ANALISIS QUMICO II Ingeniera Biotecnolgica 37

UNIDAD # 3
ESPECTO!OTOMETIA DEL "ISIBLE
!UNDAMENTO
Los mtodos colorimtricos y espectrofotomtricos probablemente son lo ms importantes
del anlisis cuantitativo y tambin los que se emplean ms a menudo. Se basan en la
absorcin de luz visible o de otro tipo de energa radiante por una solucin la cantidad de
energa radiante absorbida es proporcional a la concentracin del material en la solucin
que realiza la absorcin midiendo la absorcin de la luz o de otro tipo de energa radiante
es posible determinar cuantitativamente la cantidad de sustancias absorbentes presentes.
La espectroscopia de absorcin molecular se basa en la medida de la transmitancia ! o de
la absorbancia " de disoluciones que se encuentran en cubetas transparentes que tienen
un camino ptico de b cm.. #ormalmente la concentracin c de un analito absorbente est
relacionada linealmente con la absorbancia.
NOMENCLATUA
$urante el desarrollo de la espectroscopia de absorcin %a surgido alguna confusin en la
terminologa de tal forma que para un concepto o una propiedad e&isten diferentes
nombres en las obras de los distintos autores. 'ecientemente se %a %ec%o un considerable
esfuerzo por la "merican Society for !esting (aterials )"S!(* para crear una nomenclatura
uniforme los trminos y smbolos que se se+alan estn basados en estas
recomendaciones.
ESPECTO "ISIBLE
'egin que corresponde a la zona coloreada que comprende radiaciones de luz entre ,--.
7/- nm de longitud de onda , --- . 7/-- ngstrom es la regin ms peque+a del
espectro electromagntico.
La sensacin de color es una respuesta a una serie de estmulos fsicos qumicos y
biolgicos del ciertas partes de la retina del o0o para la energa radiante de las determinadas
longitudes de onda los colores del espectro son visibles simples o sea que no se
descomponen en otros colores la luz blanca es la superposicin de las radiaciones del
espectro visible. La luz blanca contiene radiacin de todas las longitudes de onda de la
regin visible la luz blanca es una mezcla comple0a de fotones de energas diferentes. 1s
posible seleccionar la luz de una sola longitud de onda )radiacin monocromtica* a partir
de la luz blanca )por e0emplo con un prisma* si la luz blanca se priva de uno de sus colores
)generalmente por absorcin* la luz blanca resultante aparecer como el complemento de
ese color es decir si de la luz blanca se separa la luz azul ),/- a ,2- nm* la radiacin
resultante ser amarilla.
Los colores del espectro visible son3
ANALISIS QUMICO II Ingeniera Biotecnolgica Ing Ar#an$o Salina% S&nc'e( 38
ESPECTO "ISIBLE
4.5.. 567L1!" . "84L . 51'$1 . "("'6LL7 . "#"'"#9"$7 . '797 . 6.'.
,-- ,/- ,2- /:- /;- :</ 7/- nm
DONDE: UN MILIMICRN m ES IGUAL A UN NANMETRO
ANALISIS QUMICO II Ingeniera Biotecnolgica 3;
METODOS COLOIMETICOS ) ESPECTO!OTOMETICOS
Son de mayor uso o importancia del anlisis cuantitativo se fundamentan en la absorcin
de la luz y de otro tipo de energa radiante midiendo la cantidad de energa absorbida se
determina la concentracin de las sustancias absorbentes.
*+, El an&li%i% colori#-trico o colori#etra. es la determinacin cuantitativa de una
sustancia colorida basndose en su capacidad de absorber la luz de una determinada
longitud de onda se tiene dos tipos3
a+ La colori#etra /i%0al que se basa en la comparacin de una solucin colorida de
concentracin desconocida con otras soluciones del mismo color pero de
concentraciones conocidas )utiliza como detector al o0o %umano*.
1+ La colori#etra 2oto#-trica mide la relacin entre el %az luminoso saliente y el
incidente mediante detectores de tipo de fotoceldas se denomina mtodos
fotomtricos y el instrumento fotmetro opera solamente en la regin visible.
3+, Lo% #-to$o% e%4ectro2oto#-trico%. miden esta relacin a una determinada longitud de
onda el instrumento se llama 1spectrofotmetro opera en la regin del visible ultravioleta o
infrarro0o.
Los mtodos espectrofotomtricos no se limitan al uso de la luz visible sino que tambin
incluye a aquellos que emplean energa radiante de otras regiones del espectro
electromagntico como el ultravioleta o el infrarro0o. Se %a desarrollado mtodos de
anlisis colorimtricos y espectrofotomtricos para la mayora de elementos y compuestos
orgnicos de muc%as clases. Los mtodos que se basan en la absorcin de la luz sirven
perfectamente para determinar constituyentes de las muestras desde cantidades mnimas
%asta cantidades de = > apro&imadamente pero no se usan con tanta frecuencia para
analizar cantidades mayores )macrocantidades* de sustancias. ?or e0emplo3 es me0or
determinar un analito usando mtodos de valoracin cuando su concentracin es elevada.
La determinacin colorimtrica de la muestra implica aplicar las diluciones necesarias para
que la concentracin del analito se reduzca al intervalo en el cual se aplica los mtodos
colorimtricos.
1n espectrofotometra %ay dos formas principales de analizar una de ellas es empleando el
color natural de un in o compuesto. Las sustancias muy coloridas como el permanganato
el bicromato y las tinturas orgnicas se determinan con facilidad. La otra forma es
utilizando la radiacin ultravioleta e infrarro0a para la determinacin espectrofotomtrica de
sustancias )especialmente de sustancias orgnicas* que no presentan color en la regin
visible )y por consiguiente no absorben la luz visible* pero si absorben fuertemente en las
regiones espectrales del infrarro0o o del ultravioleta.
Los iones o molculas que tienen poco o ning@n color natural pueden determinarse
espectrofotomtricamente despus de %acerlas reaccionar con un reactivo apropiado que
las convierta en producto muy colorido.
Aon respecto a la regin visible la solucin tendr un color que corresponde a las longitudes
de onda que la solucin no absorbe es decir el color que observamos es el color
complementario del color de la luz que absorbe. ?or e0emplo una solucin absorbe la luz
azul del espectro a ,7/ nm el color visible de la solucin es el color amarillo que es el color
complementario del azul.
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COLOES DE LA E5ION "ISIBLE
......................................................................................................................
Long+ $e On$a n# Color 60e %e a1%or1e Color co#4le#ento 60e %e o1%er/a
......................................................................................................................
,-- . ,3/ 5ioleta 5erde amarillo
,3/ . ,2- "zul amarillo
,2- . ,;- "zul verde ro0o naran0a
,;- B /-- 5erde azuloso ro0o
/-- . /:- 5erde ro0o p@rpura
/:- . /2- "marillo verdoso violeta
/2- B /;/ amarillo azul
/;/ . :/- naran0a azul verdoso
:/- . 7/- ro0o azul verde
......................................................................................................................
Mtodos de trabajo En Espetro!otometr"a
1l mtodo de operar en colorimetra o 1spectrofotometra se basan en que una muestra desconocida
se compara con muestras conocidas o patrones que act@an como soluciones de referencia
estndares pero difieren en el modo de %acer esta comparacin. 1l mtodo de mayor uso es el que
corresponde al de las series patrones.
Mtodo de #as ser$es patrones
Se prepara una serie de soluciones estndares o patrones del constituyente que se
analizaC la concentracin siguiente en una cantidad adecuada se desarrolla el color en la
muestra desconocida del mismo modo que en las soluciones patrn y la desconocida se
compara con los patrones. 1sta comparacin se %ace por uno de los dos mtodos
siguientes3
A) Compara$%n D$reta
Se mide las soluciones patrn y la muestra desconocida mediante la observacin de
estas soluciones y se determina la solucin patrn que es seme0ante a la
desconocidaC sta por tanto contiene la misma cantidad del constituyente que se
desea determinar que el patrn que se aseme0a. $ebido a que el mtodo esta
basado en el criterio sub0etivo del operador los errores personales pueden llegar a
ser considerables.
B) Compara$%n Ind$reta
1n este mtodo el DcolorE se mide como porcenta0e de transmitancia o absorbancia
en una aparato usando alg@n tipo de detector )fototransformador* en lugar del o0o.
Aada serie de patrones se mide en tandas y las lecturas o alguna funcin con ella
relacionada se representa en funcin de la concentracin obtenindose as una
curva de calibrado. 1l problema preparado en la misma forma que los patrones se
mide tambin y la lectura del instrumento se convierte en concentracin con au&ilio
de la curva de calibracin o por mtodos analticos de clculo.
ANALISIS QUMICO II Ingeniera Biotecnolgica ,=
1l mtodo est e&ento de los errores personales de comparacin visual de color. 1s posible
obtener una e&actitud del orden del -./ > de error relativo. 1l mtodo por tanto se puede
comparar favorablemente con los me0ores mtodos gravimtricos y volumtricos de anlisis
y es incluso superior a esos mtodos para la determinacin de peque+as cantidades del
constituyente deseado.
PASOS DE UN ANALISIS ESPECTO!OTOMETICO
Las etapas a seguir en el anlisis son3
1. !or#acin $e e%4ecie% colorea$a%
?ara medir en la regin del visible la absorbancia de una especie absorbente es indispensable que la
solucin problema presente color este color puede ser propio del ion o sustancia. ?ero algunos iones
presentan un color no muy definido o dbil otros no presentan coloracin entonces es necesario
agregarle un reactivo cromforo de tal manera que al reaccionar formen un comple0o colorante que
ser el responsable de la absorcin de la radiacin. 1l reactivo agente formador de color debe tener
las siguientes e&igencias3
a* 1l reactivo que forma color debe presentar cierta selectividad o especificidad para el
constituyente que se analiza. Las sustancias e&tra+as no deberan impedir la reaccin de
formacin del color ni dar otros productos coloreados. 1stos interferentes deben ser eliminados
mediante un cambio de condiciones tales como pF temperatura disolventes si esto no
sucede se debe proceder a enmascarar o separar el elemento interferente.
b* 1l color que forma debe ser estable para que permita realizar repeticiones de las mediciones
c* La formacin del color deber ser rpida. Auando se forma la especie coloreada se debe
estudiar y tener en cuenta los siguientes factores3
7 El e2ecto $e e8ce%o $e reacti/o si la reaccin formadora de color es prcticamente
completa cuando estn presentes cantidades estequiomtricas a los reactivos la adicin de
ms cantidad de reactivo dar lugar a peque+os incrementos de la absorbancia si es que la
%ace aumentar algo.
7 E2ecto $el tie#4o algunas reacciones de formacin de color son ms rpidas otras son
muy lentas adems algunas especies coloreadas e&perimentan Ddesvanecimientos Ddebidos
a la descomposicin por la luz yGo por el calor o por reposo. Lo ideal es que la reaccin de
formacin de color sea rpida y que las especies coloreadas sean estables en el tiempo de
modo que no sea necesario realizar el anlisis en un tiempo prefi0ado y que permita
realizar mediciones repetidas.
7 E2ecto $e te#4erat0ra se requieren a veces temperaturas elevadas para acelerar la
formacin del producto coloreadoC pero puede tambin aumentar la velocidad de
decoloracin. 1l control de la temperatura puede ser necesario no solo para el desarrollo del
color sino tambin durante la medida de la absorbancia esto es muy importante cuando se
utilizan disolventes orgnicos que tienen un elevado coeficiente de dilatacin.
E2ecto $el 49 debera e&istir un amplio margen de pF en el cual la absorbancia no
variase. Auando el control de pF es muy crtico se deben utilizar soluciones adecuadas de
gran capacidad reguladoraC o bien se a0usta el pF de la solucin al valor deseado mediante
un pFmetro.
ANALISIS QUMICO II Ingeniera Biotecnolgica Ing Ar#an$o Salina% S&nc'e( 42
3+ Seleccin $e la longit0$ $e on$a analtica
Aada especie coloreada presenta una curva de absorcin o espectral caracterstica en una
determinacin espectrofotomtrica deber obtenerse siempre una curva de absorcin de las especies
absorbentes para seleccionar en ellas la longitud de onda apropiada que permite realizar la medicin
cuantitativa. ?ara encontrar la curva de absorcin se irradia a la solucin coloreada con energa
radiante de una gama de longitudes de onda de tal manera que a cada longitud de onda se mide su
valor de absorbancia o porcenta0e de !ransmitancia esta energa absorbida se traduce en un espectro
de absorcin que es obtenido en funcin de los valores "bsorbancia o porcenta0e de !ransmitancia
frente a las longitudes de onda en la curva se ubica el m&imo pico que corresponde a un m&imo de
absorbancia el cual corresponde a una longitud de onda determinada esta longitud de onda a la cual
la especie coloreada absorbe con mayor intensidad la energa radiante se llama longitud de onda
m&ima ptima analtica o de traba0o.
1n la seleccin de la longitud de onda de traba0o que %a de usarse para una determinacin
cuantitativa dada tienen importancia los siguientes factores3
La radiacin %abr que restringirse en la medida de lo posible a una banda
de longitudes de onda que sean absorbidas por el componente deseado.
La longitud de onda escogida %a de ser una a la cual la absortividad permita
llegar a un compromiso entre la sensibilidad y el intervalo de concentracin de la
sustancia deseada.
La longitud de onda %a de ser una en la cual un ligero desplazamiento en la
longitud de onda no cause cambio apreciable en la absortividad molar.
La longitud de onda escogida %abr de ser idealmente una a la cual el
componente desconocido es el @nico componente de la muestra de anlisis que
absorbe radiacin. 1sta condicin no se logra a menudo pero es necesario acercarse
a ella lo ms posible.
7perar con la longitud de onda de traba0o el mtodo adquiere mayor
sensibilidad y mayor precisin y e&actitud.
4na aplicacin directa de estos factores a la seleccin de la longitud de onda que %a de
usarse en un procedimiento cuantitativo requiere obtener espectros de absorcin del
componente deseado y de otras sustancias que potencialmente pudieran interferir en su
determinacin. 1n ocasiones es posible %acer esta seleccin de la longitud de onda
empricamente en particular cuando se usan instrumentos de filtro. "l o0o %umano una
solucin aparece del color que la solucin transmite el cual a su vez es complementario del
color que es absorbido por la solucin. "s el color del filtro %a de ser el complementario del
color aparente de la solucin como en el siguiente cuadro3
ANALISIS QUMICO II Ingeniera Biotecnolgica ,3
Color $e la %ol0cin Color $el 2iltro
?@rpura
"naran0ado a ro0o
"marillo
5ioleta a ro0o
"zul
5erde
"zul a verde azulado
"zul
?@rpura
'o0o
Las variables comunes que influyen en el espectro de absorcin de una sustancia incluyen
el tipo de disolvente el pF de la solucin la temperatura concentracin elevada de
electrlitos y la presencia de sustancias que interfieren se deben conocer los efectos de
estas variables as como las condiciones que se %an seleccionado para el anlisis de modo
que la absorbancia del analito no sea afectada materialmente por variaciones incontroladas
de peque+a magnitud.
3+,Con2or#i$a$ con la Le: $e Beer
1l paso siguiente consiste en calibrar el mtodo que se propone este debe a0ustarse a las
leyes fotomtricas especficamente a la ley de Heer. $espus de determinar la longitud de
onda a la cual deben de realizarse las medidas se calibra el mtodo )Lo que incluye el
instrumento que se %a de utilizar*
El #-to$o $e tra1a;o con%i%te<
1n preparar una serie de soluciones estndar o patrones y midiendo de cada una de
ellas su absorbancia a la longitud de onda de traba0o. 1n algunos casos se debe
a0ustar las condiciones para que se desarrolle el color en la forma adecuada y
agregando luego el reactivo formador de color diluyendo luego con el disolvente al
enrase a un volumen determinado.
cada solucin se mide a la longitud de onda de traba0o las medidas de
transmitancia o absorbancia se realizan com@nmente a0ustando la escala de medida
del instrumento a =--> de transmitancia )absorbancia cero* cuando el %az luminoso
pasa a travs de un blanco que debe ser idntico a la muestra en todo e&cepto en
que no debe contener el constituyente que se %a de determinar. 1l blanco deber
contener los reactivos aditivos disolvente etc. en la misma naturaleza y
concentracin que las utilizadas en cada muestra desconocida en la que se
desarrolle colorC de esta manera las lecturas de las muestras estn corregidas
automticamente para cualquier absorcin peque+a por accin de los reactivos y del
disolvente.
Aon los datos de "bsorbancia frente a la concentraciones se grfica en un sistema
cartesiano y debe obtenerse una curva que corresponde a una lnea recta con
pendiente positiva o con pendiente negativa si se grfica porcenta0e de
!ransmitancia frente a las concentraciones. Si la grfica es una lnea recta se dice
que el componente activo y el mtodo cumple la Ley de Heer. 1sta curva se llama
IAurva de AalibracinI y cumple dos funciones fundamentales3
5erificar la Ley de Heer que relaciona las absorbancias y las concentraciones es decir
la cantidad de energa que absorben son funcin lineal de las concentraciones.
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?ermite encontrar las concentraciones de la muestra problema mediante el mtodo
llamado grfico
Las concentraciones de los 1stndares de acuerdo al error fotomtrico no deben ser ni muy
diluidas ni muy concentradas estas deben tener valores entre <- . :-> !ransmitancia.
4. An&li%i% $e la #0e%tra
La muestra problema tiene un tratamiento conocido de3 ?esada de la muestra disolucin
separacin de interferentes formacin de la especie coloreada ba0o las mismas
condiciones de los estndares. 1l reactivo formador de color debera ser especfico o muy
selectivo para el analito. Las sustancias e&tra+as no deberan impedir la reaccin de
formacin del color ni dar otro anlogo )espectro de absorcin*.
?ara obtener la solucin problema final esta debe encontrarse a una concentracin
apropiada de tal manera que su valor este comprendido en el intervalo de las soluciones
patrones )apro&imadamente debe presentar un 37 > de transmitancia*. 1l problema
consiste en lo que debe %acerse en la prctica cuando las soluciones preparadas para la
medida tienen una transmitancia fuera del intervalo de e&actitud m&ima. 1scogiendo un
tama+o de muestra y un volumen de solucin )por tanto de concentracin* del trayecto
ptico y de la absortividad puede %acerse unas variaciones de las condiciones a fin de
que se verifique la medida dentro de los lmites ptimos.
Los distintos mtodos para obtener las condiciones de medida son los siguientes3
Si la solucin preparada es demasiado diluida )transmitancia demasiada alta o ba0a
absorbancia*3
=.. La solucin puede medirse con una celda de un trayecto ptico mayor por
e0emplo / =- cm. en vez de = cm.
<.. ?uede utilizarse una muestra mayor en el mismo volumen
3.. ?uede disolverse una muestra del mismo tama+o pero en un volumen menor
Si la solucin preparada es demasiado concentrada )transmitancia demasiado ba0as o alta
absorbancia*3
ANALISIS QUMICO II Ingeniera Biotecnolgica ,/
=.. ?uede medirse con un trayecto ptico de menor recorrido
<.. ?uede medirse la solucin a una longitud de onda a la cual el soluto tenga menor
absortividad.
5. C&lc0lo $e e%0lta$o%
?ara determinar la concentracin del analito e&isten dos mtodos3
a= M-to$o gr&2ico
1l instrumento sea fotocolorimetro o 1spectrofotmetro arro0a valores de "bsorbancia o
porcenta0e de transmitancia y se calcula la concentracin de la muestra en la curva de
calibrado a continuacin se toma en cuenta las disoluciones efectuadas el peso inicial de
la muestra para luego calcular la concentracin del componente activo.
1= M-to$o analtico
Se emplea la relacin de la ley combinada de Heer
" J a & b & c donde3 "J absorbancia
a J absortividad
b J trayecto ptico
c J concentracin
C&lc0lo $e la a1%or1iti/i$a$ #e$ia
La relacin matemtica anterior permite ser empleada en el clculo de la absortividad
especfica o molar de cada solucin patrn operando en cada caso con su
concentracin y su respectivo valor de absorbancia medido teniendo en
consideracin que el valor del trayecto ptico es constante.
a
=
J "
= G
Gb & c
=
a
<
J "
<
G b & c
<
a
3
J "
3
G b & c
3

Aalculada la absortividad de cada patrn se determina la absortividad media
a
m
J a
=
K a
<
K a
3
3
C&lc0lo $e la concentracin $e la #0e%tra
?ara calcular la concentracin de la muestra se emplea la misma ecuacin de Heer
pero tomando en cuenta la siguiente relacin matemtica3
"
( $7#$1 3
A
( J A7#A1#!'"A6L# (41S!'"
A
(
J .......... "
( J "HS7'H"#A6" (41S!'"
b & a
m a m J "HS7'!656$"$ (1$6"
C&lc0lo $e la concentracin 4ara la% $il0cione%
Se toma en cuenta las diluciones efectuadas como volumen inicial volumen final y si
corresponde el volumen alcuota. M finalmente se calcula la concentracin del analito
relacionando el peso inicial de la muestra. 1l resultado del analito se e&presa como
porcenta0e partes por milln miligramos por ciento o seg@n corresponda al tipo de
muestra o como se solicita entregar el resultado del anlisis.

>+ E/al0acin $el #-to$o
ANALISIS QUMICO II Ingeniera Biotecnolgica Ing Ar#an$o Salina% S&nc'e( 46
4sualmente se %ace las mediciones repetidas de una muestra para poder determinar la
precisin y e&actitud que presenta mediante un tratamiento estadstico adecuado.
A4licacin $e la e%4ectro%co4ia $e a1%orcin en la regin /i%i1le
Las aplicaciones cualitativas de 1spectrofotometra visible son limitadas porque el espectro
de la mayora de los compuestos en solucin consiste de uno o cuando muc%o unos pocos
picos amplios sin estructura fina que podran ser requeridos para su identificacin precisa.
1n contraste el mtodo es uno de los ms utilizados para el anlisis cuantitativo de
sustancias inorgnicas orgnicas y bioqumicos presentando buena sensibilidad lmites de
deteccin de =-
.,
a =-
.7
( selectividad de moderada a elevada e&actitud y precisin
razonables y gran rapidez. "dems los mtodos espectrofotomtricos son fcilmente
automatizados.
1&isten sustancias coloreadas por naturaleza que permiten la aplicacin directa de esta
tcnica sin necesidad de reaccin qumica alguna por e0emplo iones inorgnicos tales
como el bicromato permanganato c@prico frrico etc. 1n compuestos orgnicos tambin
se presenta esta situacin en compuestos coloreados como son los tintes.
Sin embargo la mayora de los iones metlicos son incoloros y su determinacin requiere la
presencia de un reactivo cromoforo o tambin llamado reactivo colorimtrico.