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ndice


Introduccin 2
Mtodos 3
Tcnica de precipitacin 4
Tcnica de inmunoblotting. ..11
Tcnica de inmunoaglutinacin ..14
Tcnicas inmunofluorimtricas ..18
Tcnicas inmunoenzimticas ..22
Tcnicas inmunorradiolgicas ..26
Conclusin ..28
Bibliografa ..29




























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Introduccin

El sistema inmune, como sabemos, es capaz de crear anticuerpos especficos para cada
antgeno, dado que estos se definen o diferencian por sus interacciones, uno de ellos puede
usarse para cuantificar o cualificar al otro o viceversa. (3)
Entonces la interaccin antgeno - anticuerpo tenemos que es una relacin entre dos
molculas parecida a la que hay entre una enzima y su sustrato, con una diferencia muy
importante: no conduce a una alteracin qumica irreversible en el anticuerpo ni en el
antgeno. Esta incluye tambin varias interacciones no covalentes entre el determinante
antignico, o eptopo, del antgeno y el dominio de regin variable de la molcula del
anticuerpo. La gran especificidad de las interacciones antgeno - anticuerpo trajo consigo el
desarrollo de una diversidad de pruebas inmunolgicas, que pueden utilizarse para detectar
la presencia del anticuerpo o del antgeno. (2)
Dentro de los procedimientos, los ms tiles y prcticos son aquellos que se basan en la
especificidad de la unin Ag-Ac. La propiedad que tienen las Igs de unirse a un Ag, la
especificidad de esta unin y el hecho de que pueda ser visualizable por los fenmenos de
precipitacin, aglutinacin y otros mecanismos indirectos (marcaje con fluorescena, con
radioistopos o con enzimas) hace que estos mtodos se empleen ampliamente en diversos
campos como la investigacin y la medicina. (1)
Estas pruebas varan en su rapidez y sensibilidad; algunas son solo cualitativas, mientras
que otras son cuantitativas. En este trabajo se examina la naturaleza de la interaccin
antgeno anticuerpo y se describen diversas pruebas inmunitarias que miden o aprovechan
esta interaccin. (14)























2

Mtodos

La introduccin de los procedimientos basados en las reacciones inmunolgicas ha
representado un importante avance en el anlisis de sustancias de inters en biologa animal
y vegetal difciles de medir empleando los mtodos bioqumicos, estos ensayos tambin
han sido de vital importancia en el diagnstico de enfermedades, la vigilancia del grado de
respuesta inmunitaria y la identificacin de molculas de inters biolgico o mdico. (2)
En el campo de la inmunologa, muchas tcnicas serolgicas se utilizan para detectar la
interaccin de antgenos con anticuerpos. (14)
Estos mtodos son adecuados para la deteccin y cuantificacin de anticuerpos contra
agentes infecciosos, as como antgenos microbianos y no microbianos. (14)

Tenemos que existen 5 tcnicas que nos permiten visualizar las interacciones dadas entre
Ag-Ac.

Tcnica de precipitacin
Tcnica de inmunoblotting
Tcnica de inmunoaglutinacin
Tcnicas inmunofluorimtricas
Tcnicas inmunoenzimticas
Tcnicas inmunorradiolgicas

Cada una tiene caractersticas que las hacen ms viables como costos, tiempo, materiales,
etc. En cuestin de sensibilidad en algunas tcnicas se tiene que:




















La sensibilidad depende tanto de la afinidad del anticuerpo usado para el ensayo como de la
densidad de eptopos y la distribucin del antgeno. (2)
Pruebas Sensibilidad (g
de anticuerpo/ml)
Reaccin de inmunoprecipitacin 20 -200
Reaccin de inmunoprecipitacin en gel:
Inmunodifusin radial de Mancini 10 50
Doble Inmunodifusin de Ouchterlony 20 200
Inmunoelectroforesis 20 200
Electroforesis en cohete 2
Reacciones de inmunoaglutinacin:
Directa 0.3
Aglutinacin pasiva 0.006 0.06
Inhibicin de la aglutinacin 0.006 0.06
Radioinmunoensayo 0.0006 0.06
Ensayo de inmunosorbente ligado a
enzima (ELISA)
0.0001 0.01
ELISA con quimioluminiscencia 0.00001 0.01
Inmunofluorescencia 1.0
Citometra de flujo 0-006 0.06
3

Los mtodos inmunolgicos son ampliamente utilizados en la deteccin de patgenos en
reas clnicas, agrcolas y ambientales.
Un ejemplo es en el campo de microbiologa, en donde, por su rapidez y exactitud
comenzaron a ser usados con mayor frecuencia.



A continuacin se tendr el fundamento y uso de cada tcnica en diferentes campos
cientficos.


Tcnica de precipitacin.

Al mezclar cantidades suficientes de un antgeno soluble con anticuerpos especficos, la
interaccin Ag-Ac puede dar lugar a una red capaz de ser visualizada como un precipitado.
Esta estar constituida por grandes complejos inmunes formados por la interaccin Ag-Ac.
Cuando se agregan concentraciones crecientes de antgeno soluble a una cantidad fija de
suero que contiene anticuerpos especficos, a medida que la cantidad de antgeno agregado
aumenta, la cantidad de precipitado se incrementa hasta alcanzar un mximo, luego del cual
declina. (14) Estos mtodos pueden ser desarrollados en medios lquidos o en geles y han
demostrado una notable eficacia para individualizar y purificar los antgenos dotados de
diferencias particulares. La unin Ag-Ac se traduce por la formacin de un precipitado
insoluble con la condicin de que los reactivos se encuentren a concentracin equivalente.
(14)
Existen diferentes formas para realizar esta reaccin:
1. Tcnica de precipitacin.
2. Tcnica de difusin radial simple de Mancini.
3. Tcnica de difusin radial de Ouchterlony.
4. Tcnica de inmunoelectroforesis.
5. Tcnica de nefelometra.
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Las ventajas de estas es que existen varias, se observan fcilmente los resultados, no se
requiere ningn equipo costoso y tienen la caracterstica de ser cualitativas y cuantitativas.
La desventaja que ofrece esta tcnica es su poca sensibilidad y el hecho de ocupar grandes
cantidades de antgeno y anticuerpos. (7)

1.- Tcnica de precipitacin.
Esta reaccin se produce cuando el Ag es soluble. Se emplea como ensayo cualitativo o
semicuantitativo para medir la cantidad de Ac.
En esta tcnica tenemos que el anticuerpo y el antgeno soluble interactan en una solucin
acuosa tienden a formar un retculo que por ltimo se convierte en un precipitado visible.
Los anticuerpos que aglomeran antgenos solubles se denominan precipitinas. Aunque la
formacin del complejo soluble Ag-Ab ocurre en el transcurso de minutos, la del
precipitado visible se lleva a cabo con mayor lentitud y a menudo requiere uno o dos das
para completarse. (2)
















Se pueden usar para determinar protenas reactantes de fase aguda como PCR o demostrar
infecciones previas por Streptococcus pyogenes por AELO. (4)
Adems de servir para la identificacin de antgenos y anticuerpos. (7)

Ejemplo donde se aplica:
La esclerodermia (esclerosis sistmica) es una enfermedad autoinmune sistmica
caracterizada por la fibrosis, cambios vasculares, y la produccin de autoanticuerpos. Los
anticuerpos ms comunes asociados con la esclerosis son anti-centrmero, topoisomerasa I
(topo I) y anticuerpos-ARN polimerasa III (RNAPIII), aproximadamente el 20% cada uno.
Anti-topo I y ACA han sido utilizados por cerca de 30 aos con fines de diagnstico,
mientras que anti-RNAPIII ELISA ha sido aadido a la investigacin rutinaria no hace
mucho tiempo. Pacientes que padecen esta enfermedad se pueden clasificar en dos
subgrupos principales: limitado y variante cutnea difusa. El variante cutnea difusa se
asocia con frecuencia con anti-topo I, -RNAPIII, o -U3RNP, mientras que el limitado se
asocia con ACA y anti-Th/To anticuerpos. Estos autoanticuerpos son bastante especfico
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para la esclerosis sistmica y se pueden detectar incluso antes del diagnstico. Estn
asociados con caractersticas clnicas nicas y son tiles en la prediccin de las
manifestaciones clnicas de variantes cutneas.
Anti-Th/To y U3RNP A pesar de su importancia clnica, estos autoanticuerpos no se han
utilizado clnicamente debido a la falta de disponibilidad de pruebas de anticuerpos. No
hay un kit de inmunoensayo validado ampliamente disponible comercial que se haya
producido hasta la fecha. El objetivo del estudio es establecer un nuevo mtodo para
detectar los anticuerpos anti-Th/To y U3RNP basados en la PCR cuantitativa (qPCR) la
deteccin de los componentes del RNA de la ribonucleoprotena autoantgenos.
- La tcnica inmunoprecipitacin (IP) se realiz usando K562 extracto de clulas y
componentes de ARN que fueron extrados. Los valores de umbral de ciclo (Ct) se
compararon en un experimento de valoracin para determinar la eficacia del ensayo.
El nuevo ensayo se evalu mediante el ensayo anti-Th/To 22 y 12 muestras
positivas anti-U3RNP adems de 88 controles, y los resultados se compararon con
IP como un estndar de oro.
Este nuevo ensayo ser til para la deteccin de autoanticuerpos frente a cualquier
autoantgeno complejo ARN-protena y puede permitir la utilizacin clnica de varios
autoanticuerpos que se han detectado principalmente por IP y no se utilizan ampliamente en
el pasado. (17)

2.- Tcnica de difusin radial simple de Mancini.
Este es un mtodo simple y especfico para la identificacin y cuantificacin de un nmero
de protenas que se encuentran en los fluidos corporales suero y otros humanos. Esta
tcnica a pesar de ser una precipitacin se lleva a cabo en un medio solido el cual tiene en
su constitucin agarosa compuesta de poros donde se permite la reaccin y un antisuero.
La Inmunodifusin radial se basa en una tcnica que utiliza una reaccin de precipitina en
la que se aade anticuerpo especfico para un medio de agarosa tamponado, el suero que
contiene el antgeno de prueba se coloca en un pozo centrado en la agarosa. El dimetro de
la zona de precipitina resultante est relacionada con la concentracin de antgeno colocado
en un pozo. (18)
El Ac es incorporado en el gel de agar. El Ag de los pocillos difunde formando anillos
de precipitacin











6

Este mtodo fue utilizado de manera sistemtica en inmunologa clnica, en particular para
las determinaciones de inmunoglobulina y tambin para sustancias como el tercer
componente del complemento, transferan, protena C reactiva y la protena embrionaria, -
fetoprotena, que se asocia con ciertos tumores hepticos (4)

Ejemplo donde se aplica:
La toxoplasmosis, una infeccin por coccidios, es causada por parsitos intracelulares
obligados, Toxoplasma gondii. Aunque por lo general benigno para las personas sanas, la
infeccin puede provocar la muerte del feto, ceguera, retraso mental y en ocasiones la
muerte de los recin nacidos con infeccin congnita. El parsito se distribuye a nivel
mundial y se encuentra en muchas especies de mamferos y aves.
Se estima que hasta un 5*10 ^ 8 personas en el mundo estn infectadas con el T. gondii.
Existe una importante situacin inmunolgica donde toxoplasmosis es de las
preocupaciones clnicas ms grandes. Esto es en el caso de una mujer embarazada con
toxoplasmosis aguda recin adquirida. En esta situacin, la hembra no ha adquirido la
inmunidad al parsito y taquizotos puede atravesar la placenta para infectar el feto.
Sin embargo, las madres con infeccin crnica rara vez transmiten la infeccin a su beb
por nacer, porque la inmunidad materna mantiene la replicacin taquizoitos en niveles
subclnicos.
El resultado de una infeccin primaria depende de la capacidad del husped para montar
una respuesta inmune capaz de controlar la multiplicacin y propagacin de los parsitos.
La respuesta a T. gondii es compleja e implica mecanismos celulares tanto como
humorales. As que en este estudio se trat de determinar el ttulo de anticuerpo en el suero
de las mujeres infectadas y correlacionar estos ttulos con ttulo de componente del
complemento C3 y C4, especialmente mediante el uso de tcnica de Inmunodifusin radial
simple con el fin de explicar el papel de los anticuerpos durante la infeccin con T. gondii y
el papel de complemento. Tambin queremos saber qu clase de aumento de anticuerpos en
el suero de las personas infectadas, las mujeres en este caso.
- La prueba se lleva a cabo usando el kit de biomaghreb.
Se abrieron las placas y se dejaron reposar a temperatura ambiente durante unos
pocos minutos para permitir que cualquier agua condensada en los pozos que se
evapore. Los pocillos se llenaron con 5 l de los sueros de prueba (infectadas y de
control). Luego nos fuimos un plato para mantenerse a temperatura ambiente
durante aproximadamente (48) horas en el caso de la IgG, IgA, C3 y C4 y (72)
horas en el caso de IgM.
Los resultados indican que hubo un aumento en el ttulo de anticuerpo de IgG e IgM en el
suero de mujeres infectadas en comparacin con el ttulo de estos anticuerpos en los sueros
de control, que significa que hay un papel definido de IgG e IgM durante la infeccin con
T. gondii que est asegurados por Mandlle quien revel que las inmunoglobulinas que
pertenecen a la clase IgG, IgM, IgA e IgE se produce en respuesta a la infeccin. (18)

3.- Tcnica de difusin radial de Ouchterlony.
Las diluciones del anticuerpo y los antgenos solubles especficos se colocan en pocillos
adyacentes. Si bien el tamao y la forma, la distancia entre los pozos, temperatura, y tiempo
de incubacin son ptimas, estas soluciones se difunden hacia fuera, se unen el uno al otro,
de enlace cruzado, y forman un precipitado visible en el punto de equivalencia
perpendicular a la lnea de eje entre el pozos de bandas de la precipitacin se compararn
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con un antgeno estndar.
La localizacin precisa de la banda depende de la concentracin y la velocidad de difusin
del antgeno y anticuerpo. En una condicin de exceso de anticuerpo, la banda se encuentra
ms cerca del pocillo de antgeno. Si dos antgenos estn presentes en la solucin que puede
ser reconocida por el anticuerpo, dos bandas de precipitina forman independientemente. (14)









Uno de los usos es en la deteccin de anticuerpos frente a diversos hongos productores de
neumonitis por hipersensibilidad. (4)
Tambin esta tcnica es usada para la deteccin de lupus eritematoso (7)

Ejemplo donde se aplica:
La coccidioidomicosis es una enfermedad predominantemente pulmonar, con
manifestaciones sistmicas, causadas por el hongo dimrfico Coccidioides immitis y C.
posadasii, adquirida despus de la inhalacin de su conidios infecciosa. Manifestaciones
graves de la enfermedad se observan generalmente en los pacientes inmunocomprimidos,
as como los pacientes que sufren de enfermedades degenerativas crnicas, como la
diabetes mellitus tipo 2.
El diagnstico clnico de la enfermedad puede ser difcil y el cultivo del microorganismo es
lento y arriesgado, ya que la manipulacin directa de la artroconidias hongos requiere un
cuidado especial en el laboratorio. En estudios recientes se han centrado en la bsqueda de
mtodos de diagnstico ms rpidos y seguros, como el Inmunodiagnstico y tcnicas de
biologa. Estudios previos han demostrado que a pesar de las diferencias genotpicas entre
Coccidioides spp, es posible obtener extractos de antgeno para la realizacin de las pruebas
serolgicas de una sola cepa del hongo. Por ejemplo, Brilhante describe el uso potencial de
un antgeno producido a partir de una nica cepa Coccidioides posadasii para el diagnstico
serolgico de la coccidioidomicosis. Adems de esto, estos autores mostraron que es
posible emplear un antgeno in-house cuando un resultado falso negativo se obtiene a partir
del uso de un antgeno comercial ampliamente utilizado.
En este contexto, el objetivo de este estudio fue evaluar la reactividad de un antgeno in-
house extrada de una cepa de C. posadasii aislado en el noreste de Brasil por
Inmunodifusin radial y Western blotting, as como para establecer la caracterizacin
bioqumica del antgeno.
- Se realizaron ensayos de Inmunodifusin radial doble. El antgeno extrado se prob
frente a muestras de suero de pacientes con coccidioidomicosis, histoplasmosis,
paracoccidioidomicosis y aspergilosis. El diagnstico definitivo de estas micosis se
bas en la recuperacin de hongos a partir de muestras clnicas. Adems, el suero
positivo (con anticuerpos anti-Coccidioides immitis) y un antgeno comercial
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producidos por Immy Inmunodiagnstico (Norman, OK, EE.UU.) se utilizaron
como controles.
El doble Inmunodifusin verific que el antgeno, a una concentracin de 54,5 g/100 l,
mostr reacciones positivas a todas las muestras de suero de pacientes con
coccidioidomicosis. El suero utilizado como control positivo (Immy Inmunodiagnstico)
tambin reaccion positivamente con la prueba del antgeno. No hubo ninguna reaccin
positiva con las muestras de suero de pacientes con paracoccidioidomicosis, histoplasmosis
y aspergillosis. (19)

4.- Tcnica de inmunoelectroforesis.
En esta tcnica, desarrollada en agar, la mezcla de antgeno se somete primero a
electroforesis a fin de separar sus componentes por carga. (2)
Es una variacin del procedimiento de precipitina clsico; slo aade una corriente elctrica
para ayudar a los antgenos y anticuerpos para mover a las salas entre s ms rpidamente
que en la difusin simple. El procedimiento se aprovecha
de la carga elctrica neta de los antgenos y los
anticuerpos que se estn probando en un tampn de
ensayo en particular.
Variables tales como tipos de gel, cantidad de corriente,
una concentracin de antgeno y anticuerpo se deben
controlar cuidadosamente para obtener la mxima
reactividad. La sensibilidad de la CIE es 10 a 20 veces
mayor que en inmuno-difusin doble, sin embargo, es
ms caro que otras tcnicas como la Inmunodifusin. (14)

Inmunoelectroforesis de una mezcla de antgeno.
Un preparado de antgeno (anaranjado) se somete
primero a electroforesis, que separa los antgenos
componentes con base en la carga. Luego se aade
antisuero (azul) a cuencos en uno o ambos lados de los
antgenos separados y se permite que se difundan; con el tiempo se forman lneas de
precipitacin (arcos de color) en los que interactan anticuerpo y antgeno especficos. (2)
Como la inmunoelectroforesis es una tcnica estrictamente cualitativa que slo detecta
concentraciones de anticuerpo hasta cierto punto altas (mayores de varios cientos de
microgramos por mililitro), su utilidad se limita a la deteccin de anormalidades
cuantitativas slo cuando la desviacin respecto de lo normal es notable, como en los
estados de inmunodeficiencia o los trastornos inmunoproliferativos. (2)
Esta tcnica es til para determinar si un paciente produce cantidades anormalmente bajas
de uno o ms isotipos, caractersticas de ciertas enfermedades de inmunodeficiencia.
Asimismo puede mostrarse si un paciente produce en exceso cierta protena srica, como
albmina, inmunoglobulina o transferrina. El patrn inmunoelectrofortico del suero de
individuos con mieloma mltiple muestra una gran cantidad de protena de mieloma. (2)

En la inmunoelectroforesis cruzada, se vuelven a someter a una segunda electroforesis, en
direccin que forme un ngulo recto con la primer electroforesis esta vez en un gel que
adems de buffer y agarosa, contiene los propios anticuerpos contra la protena de inters,
de forma que es durante esta segunda corrida cuando se forman los precipitados, de tal
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manera que cada precipitado tendr sus propias caractersticas migratorias, con lo cual,
cada banda que veamos corresponder a un antgeno diferente, y adems podremos,
conocer la cantidad de protena as como la cantidad de anticuerpo especfico en el gel, de
manera que se puede realizar una relativa cuantificacin de los componentes. (5)

5.- Nefelometra
Esta tcnica tiene como base un exceso de anticuerpos en la solucin, la cantidad de
complejos que pueden evaluarse por la dispersin de la luz en un nefelmetro se relaciona
de manera lineal con la concentracin de antgeno. Esta tcnica con la disponibilidad de
una amplia gama de anticuerpos monoclonales est reemplazando a la Tcnica de difusin
radial simple para la estimacin de Igs, C3, C4, haptoglobulina, ceruloplasmina y PCR en
algunos laboratorios. Esta tcnica tiene a favor el hecho de que puede analizar muestras con
un volumen pequeo, en el orden de 1 10 L. (3)


Este procedimiento es rpido y
sensible y se est utilizando en la
actualidad, sobre todo, para la
cuantificacin de protenas en suero
y en otros lquidos biolgicos. (1)




Ejemplo donde se aplica:
Las gammapatas monoclonales se caracterizan por la expansin clonal de clulas
plasmticas. La inmunoglobulina monoclonal secretada por estas clulas es un indicador de
la proliferacin clonal y puede medirse cuantitativamente para supervisar curso de la
enfermedad. Las gammapatas monoclonales, como el mieloma mltiple, mieloma de
cadena ligera, macroglobulinemia de Waldenstrom, el mieloma no secretor (NSMM),
mieloma mltiple quiescente, gammapata monoclonal de significado incierto, la
amiloidosis sistmica primaria. Las enfermedades de cadenas ligeras monoclonales
(mieloma de cadenas ligeras, AL, y LCDD) a menudo no tienen suficientemente altas
concentraciones de cadenas ligeras monoclonales en suero para ser detectados por
electroforesis de protenas en suero o inmunofijacin. Adems, cuando la inmunofijacin
detecta una cadena ligera monoclonal, la cantidad de protena puede ser demasiado baja
para ser cuantificado y controlado por la electroforesis de protenas en suero.
Ensayos nefelomtricas sensibles que son especficos para y recientemente se han
descrito las cadenas ligeras libres, pero que no reconocen cadenas ligeras unidas a cadenas
pesadas de inmunoglobulina. Estos ensayos automatizados son reportados a ser ms
sensible que la inmunofijacin para la deteccin de las cadenas ligeras libres monoclonales.
Los ensayos nefelomtricos se utilizaron para evaluar muestras de suero de pacientes cuyo
suero y muestras de orina fueron negativos para las cadenas ligeras libres del de
inmunofijacin, y estos ensayos detectan el exceso de suero o en 19 de 28 pacientes. En
un subconjunto de pacientes NSMM, las muestras de suero de serie se analizaron para las
cadenas ligeras libres, cuyas cantidades se correlacionaron con la actividad de la
10

enfermedad. Debido que la inmunofijacin no cuantifica cadenas ligeras libres y no es lo
suficientemente sensible para detectar pequeas cantidades de cadenas ligeras libres
monoclonales en todos los pacientes con discrasias de clulas plasmticas de la cadena de
la luz, es importante evaluar la utilidad de las pruebas de cadenas ligeras libres para
diagnosticar y controlar las enfermedades de cadena ligera. Estas enfermedades afectan
principalmente a las personas mayores, y hemos diseado este estudio para determinar los
intervalos de referencia del 95% de y en cadenas ligeras libres, as como el intervalo de
diagnstico para la relacin de cadenas ligeras libres a cadenas ligeras libres (K / L) en
una poblacin de 21 a 90 aos de edad. Adems, hemos aplicado estos intervalos a un
grupo de pacientes con la enfermedad de cadenas ligera y se compar la capacidad del
ensayo nefelomtrico con la del ensayo de inmunofijacin para detectar cadenas ligeras
anormales.
A diferencia de la inmunizacin, la evaluacin de las cadenas ligeras libres por
nefelometra es una medida cuantitativa, y la sensibilidad y especificidad descrita de las
cadenas ligeras libres ensayo nefelomtrico, puede permitir la cuantificacin y
monitorizacin de cadenas ligeras monoclonales en suero. La capacidad de detectar
cantidades anormales de cadenas ligeras libres y una cantidad anormal K / L es
dependiente, sin embargo, en intervalos de referencia determinados con precisin, de modo
que la especificidad de la deteccin de la enfermedad sigue siendo alta.
- La nefelometra se realiz en un Dade Behring-BNII. Cuantificacin del total de ,
el total de y cistatina C utiliza anticuerpos de Dade-Behring. Las cadenas ligeras
libres se cuantificaron con conjuntos de reactivos FreeliteTM de The Binding Site
Ltd. Estos ensayos utilizan antisueros ovejas recubierta por partculas de ltex de
poliestireno y se han mejorado por la adicin de polietilenglicol a la reaccin.
Muestras de suero diluidas en solucin salina que contena ya sea un anticuerpo
monoclonal o una cadena ligera se utiliza para probar la linealidad del ensayo.
Se realizaron 20 pruebas replicadas en sueros policlonales con valores tpicos de
cadenas ligeras libres para determinar el CV del ensayo. El ensayo fue lineal hasta
un valor mnimo de 0,5 mg / L, al 0,7 mg / L, el CV intraensayo fue del 7,9%, y en
14 mg / L, el CV interensayo fue del 8,7%. El ensayo fue lineal hasta un valor
mnimo de 0,6 mg / L, al 0,9 mg / L, el CV intraensayo fue del 10%, y en 32 mg / L,
el CV interensayo fue del 7%.


Tcnica de inmunoblotting.

El procedimiento de inmunotransferencia se basa en lo siguiente:
Las protenas se transfieren a partir de un gel de electroforesis a una superficie de la
membrana. Las protenas transferidas se inmovilizan en la superficie de la membrana en un
patrn que es una rplica exacta del gel.(12)
Sitios de unin a protenas no ocupados sobre la membrana se saturan para evitar la unin
no especfica de anticuerpos. Este paso se llama ya sea "bloqueo" o "apagar". La mancha se
prob para la protena de inters con un anticuerpo primario especfico. La transferencia se
sonde una segunda vez. La segunda sonda es un anticuerpo que es especfico para el tipo
de anticuerpo primario y se conjuga con una enzima detectable. El sitio de la protena de
inters es por lo tanto marcado con una enzima a travs de las especificidades de los
11

anticuerpos primarios y secundarios. Sustratos de enzimas que se convierten en productos
detectables, insolubles se incuban con la mancha. Los productos dejan un rastro colores en
el sitio de la banda o punto que representa la protena de inters. (12)
Es posible la identificacin de una protena especfica en una mezcla compleja de protenas
mediante una tcnica conocida como Western blotting, as denominada por su similitud con
Southern blotting, que detecta fragmentos de DNA, y con Northern blotting, que detecta
mRNA. En la Western blotting, una mezcla de protenas se separa por medios
electroforticos en un gel de SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE), un gel en placa con
infusin de dodecilsulfato sdico (SDS), un agente de disociacin. Las bandas de protenas
se transfieren a una membrana de nitrocelulosa mediante electroforesis, y las bandas
individuales de protena se identifican al inundar la membrana de nitrocelulosa con
anticuerpo policlonal o monoclonal radiomarcado o unido a enzimas especfico para la
protena de inters.(2)
Los complejos Ag-Ab que se forman en la banda que contiene la protena reconocida por el
anticuerpo pueden visualizarse de diversos modos. Si un anticuerpo radiactivo se uni a la
protena de inters, es posible determinar su posicin en la mancha (blot) exponiendo una
placa de rayos X a la membrana, un procedimiento que se conoce como autorradiografa.
Sin embargo, en los procedimientos de deteccin que ms se usan suelen emplearse
anticuerpos unidos a enzima contra la protena. Tras la unin del conjugado de enzima y
anticuerpo, la adicin de un sustrato cromgeno que produce un producto de color intenso e
insoluble origina la aparicin de una banda de color en el sitio del antgeno blanco. Puede
lograrse una sensibilidad mucho ms alta si se usa un compuesto quimioluminiscente
aunado a agentes de realce adecuados para producir luz en el sitio del antgeno.
La tcnica de Western blotting tambin puede identificar un anticuerpo especfico en una
mezcla. En este caso los antgenos conocidos de peso molecular bien definido se separan
mediante SDS-PAGE y transfieren a nitrocelulosa. Las bandas separadas de antgenos
conocidos se prueban luego con la muestra que se sospecha contiene anticuerpo especfico
para uno o ms de estos antgenos. La reaccin de un anticuerpo con una banda se detecta
mediante el empleo de anticuerpo secundario radiomarcado o ligado a enzima especfico
para la especie de los anticuerpos en la muestra en estudio. La aplicacin ms amplia de
este procedimiento es como prueba de confirmacin de VIH, donde la Western blotting se
utiliza para determinar si el paciente tiene anticuerpos que reaccionan con una o ms
protenas vricas. (2)

En la tcnica de Western blotting, una mezcla protenica a) se trata con SDS, un detergente
desnaturalizador potente, b) luego se separa
mediante electroforesis en un gel de SDS
poliacrilamida (SDS-PAGE) que discrimina los
componentes segn su peso molecular; los
componentes de peso molecular ms bajo migran
ms rpido que los de peso molecular ms alto. c)
El gel se retira del aparato y se aplica a una hoja
de nitrocelulosa o nylon que une protenas, y las
protenas y el gel se transfieren a la hoja mediante
el paso de una corriente elctrica. d)
La adicin de anticuerpos unidos a enzima
detecta el antgeno de inters y e) la posicin de
12

los anticuerpos se observa mediante una reaccin ELISA que genera un producto insoluble
de color intenso el cual se deposita en el sitio de la reaccin. De otra manera puede
utilizarse un ELISA quimioluminiscente para generar luz que se detecta con facilidad al
exponer una pieza de pelcula fotogrfica a la blot (mancha). (2)











Ejemplo donde se aplica:
Gnatostomiasis es una zoonosis parasitaria que rara vez ocurre en los seres humanos. Trece
especies de Gnathostoma se han reportado hasta la fecha, de los cuales 5 especies tales
como Gnathostoma spinigerum, G. nipponicum, G. hispidum, G. y G. doloresi binucleatum
infectan a los humanos. Los seres humanos se convierten en huspedes accidentales por
ingerir pescado crudo o carne infectada por larvas de tercer estadio y larvas migran a travs
de los rganos internos y la piel. Los mecanismos de las manifestaciones clnicas de
gnatostomiasis humanos incluyen dao mecnico de los tejidos del husped causado por la
migracin de las larvas parasitarias y las respuestas del husped a las toxinas Gnathostoma
parecidas a las de la proteasa, hialuronidasa, acetilcolina, y hemolisina [5]. Infeccin de la
piel que se manifiesta por dolor local e hinchazn migratoria en la piel y el tejido
subcutneo es la forma ms comn de gnatostomiasis humano. De las formas de
gnatostomiasis visceral, letal meningitis es la ms comn, pero la infeccin intraocular rara
vez puede ocurrir, incluso muchos aos despus de la infeccin inicial. [6] Gnatostomiasis
ocular se ha informado de la participacin del prpado, la conjuntiva, la crnea, la cmara
anterior, y la cavidad vtrea. Slo 24 casos de gnatostomiasis oftlmicas se han reportado
hasta la fecha, 14 casos en el segmento anterior, 6 casos en el segmento posterior, y 4 casos
en los tejidos y los prpados orbitales. Entre estos, se inform de pistas sub retinal en el
segmento posterior
en 1 caso. Se requiere identificacin de las larvas para un diagnstico definitivo de
gnatostomiasis humana, pero es difcil encontrar las larvas. Por lo tanto, el diagnstico
depende en gran medida en las manifestaciones clnicas y la historia del potencial de la
ingestin de un husped infectado con las larvas. Recientemente, las pruebas serolgicas,
tales como ensayo de western blot, se hicieron disponibles para el diagnstico [8]. Aqu, se
presenta un caso de gnatostomiasis intraocular diagnosticado ensayo de Western Blot en un
paciente con pistas sub retinianas observados en los exmenes de fondo de ojo, aunque no
se encontraron larvas Examen serolgico se realiz para proporcionar un diagnstico ms
preciso, y el suero del paciente reaccion fuertemente al antgeno nipponicum Gnathostoma
mediante el ensayo de Western blot, que llev a un diagnstico de gnatostomiasis
13

intraocular. Este es el primer caso de gnatostomiasis intraocular con pistas sub retinianas
confirmados serolgicamente mediante Western Blot en Corea. (20)
Tcnica de inmunoaglutinacin

La interaccin entre el anticuerpo y un antgeno particulado resulta en un agrupamiento
visible llamado aglutinacin. (2)
Esta reaccin se basa en la formacin de puentes entre anticuerpos multivalentes y
antgenos con varios eptopos. La multivalencia de los anticuerpos es necesaria ya que
permite que se creen entrecruzamientos para formar molculas de peso elevado las cuales
se observan de forma macroscpica. (9)
Las reacciones de aglutinacin son similares a las reacciones de precipitina, pero implican
antgenos o anticuerpos unidos a la superficie de otras molculas acarreadoras tales como
perlas de poliestireno. (10)
Estas como tcnicas aplicadas al laboratorio tienen mayor sensibilidad que las de
inmunoprecipitacin y produce resultados cualitativos y semicuantitativos. (9)
Esta tcnica se puede dividir en varias clases, como el material usado o por su complejidad,
entonces tenemos que existen estos tipos:

1. Tcnica de aglutinacin directa
2. Tcnica de aglutinacin indirecta
3. Tcnica de aglutinacin con ltex
4. Tcnica de aglutinacin con carbn activado
5. Tcnica de hemaglutinacin

1.- Tcnica de aglutinacin directa
En este tipo de tcnica, el antgeno es una parte que est dentro de la constitucin de la
superficie celular (eritrocitos, bacterias). En este se crea una aglutinacin con los
anticuerpos especficos que estn presentes en la muestra.
Esta tcnica frecuentemente es usada en hematologa para el estudio del tipo sanguneo o en
diagnsticos inmunolgicos para llevar a cabo la deteccin de anticuerpos especficos
dirigidos contra antgenos de origen natural en la superficie de algunos microorganismos.
(9)
Habr aglutinacin cuando los glbulos rojos posean la especificidad del antisuero aadido.
De igual manera se procede con antisueros anti-Rh para la determinacin de los distintos
grupos Rh. (1)










14



2.- Tcnica de aglutinacin indirecta
Esta tcnica usa partculas o molculas que ya han sido tratadas para adherir los antgenos a
su superficie celular.
Antes se usaban los eritrocitos como la molcula ideal para la unin de estos antgenos,
pero ltimamente, algunas partculas inertes como ltex, oro coloidal, carbono activado,
entre otras han demostrado una mayor versatilidad para la tcnica de aglutinacin
El uso de esta tcnica es usada para la deteccin de anticuerpos contra antgenos de la
superficie de algunos agentes patgenos y algunos auto anticuerpos, como el examen del
factor reumatoide, el examen de protena C-reactiva o corinica humana. (9)













3.- Tcnica de aglutinacin con ltex
Las partculas de ltex son esferas de poliestireno que se unen fcilmente molculas de IgG
por la regin Fc a un pH de 9,0 cuando se utiliza un buffer de baja fuerza inica.
Cuando los anticuerpos estn obligados por su regin Fc del anticuerpo sitios de
combinacin [F (ab) regiones] permanecer expuesta y son capaces de unir antgenos.
Cuando los antgenos diana tienen estructuras antignicas repetitivas (por ejemplo,
polisacridos), anticuerpos multivalentes acoplados a mltiples partculas de ltex se
pueden unir molculas de antgeno y entrelazar las partculas de ltex, lo que resulta en la
aglutinacin. Las partculas de ltex sirven como el sistema indicador para detectar la
reaccin antgeno-anticuerpo.(8)
Pruebas de aglutinacin de ltex son propensos a resultados falsos positivos debidos a
reacciones de aglutinacin no especficos. Por lo tanto, es importante incluir controles
positivos y negativos adecuados en la prueba. Mtodos de pretratamiento de la muestra,
como centrifugacin, punto de ebullicin, o filtracin pueden ser tiles en la eliminacin o
minimizacin de aglutinaciones no especficos. Algunas muestras, como orina, se pueden
concentrar por centrifugacin o filtracin de membrana para aumentar la sensibilidad de la
prueba.(10)
Tericamente, cualquier antgeno (pero no hapteno) a la que pueden producirse anticuerpos
debe ser detectable por esta tcnica. Este tipo de aglutinacin es particularmente til para
detectar antgenos de polisacridos bacterianos en el LCR o en la orina o en ambos. La
aglutinacin con ltex ha reemplazado algunas tcnicas para la deteccin en el LCR de los
15

antgenos capsulares de influenza tipo b, varios grupos de N. meningitidis y S. pneumoniae
para el diagnstico de la meningitis bacteriana y para la deteccin de antgenos capsulares
Cryptococcus neoformans en pacientes inmunodeprimidos. Grupo B antgenos de
estreptococos son detectados por esta tcnica en la orina o LCR de los recin nacidos. (8)
A pesar de que las pruebas de aglutinacin de ltex estn siendo rpidamente reemplazados
por mtodos ms rpidos, como tiras de prueba de flujo lateral, pruebas de aglutinacin de
ltex se siguen utilizando de forma rutinaria para confirmar la cultura y la serotipificacin
en muchos laboratorios clnicos.(10)













Ejemplo donde se aplica:
Paracoccidioidomicosis (PCM) es una enfermedad causada por el hongo
Paracoccidioides brasiliensis, y Brasil es uno de los principales
pases donde es endmica. El diagnstico se basa en la observacin de gemacin
P. brasiliensis levaduras en muestras clnicas de los pacientes, sin embargo, la sensibilidad
de la visualizacin de los hongos es baja, lo que indica que las pruebas serolgicas se
utilizan para el diagnstico precoz.
Se presenta la mejora del rendimiento de una prueba de aglutinacin de ltex (LAT) por
tratamiento previo de 30 muestras de suero de pacientes PCM y 71 controles
(histoplasmosis y aspergilosis pacientes, los pacientes con infecciones bacterianas, y sueros
humanos normales) con un tampn de dilucin se incubaron a 37 C durante 30 min. La
sensibilidad y especificidad de la prueba LAT en las muestras nonpretreated eran 73% y
79%, respectivamente. Sin embargo, cuando las muestras se trataron previamente, la
sensibilidad y especificidad de la prueba aument a 90%. En este estudio, no se observ
reactividad cruzada con sueros de pacientes con histoplasmosis, pero se observaron algunas
reacciones a sueros de pacientes con aspergilosis y las infecciones bacterianas. Estos
resultados indican la necesidad de la eliminacin de las reacciones heterlogas para poder
utilizar adecuadamente este mtodo de tamizaje de casos de PCM.
La prueba de aglutinacin del ltex (LAT) presenta ventajas tales como una ejecucin
simple y rpida y la obtencin de resultados para la lectura visual. En las infecciones por
hongos, como la candidiasis y aspergilosis (ASP), LAT puede ser empleado para detectar
antgenos en el suero de los pacientes. Por ejemplo, es posible obtener la sensibilidad y
16

especificidad de 100% y 80%, respectivamente, para la candidiasis. LAT es, pues, una
herramienta fundamental para el diagnstico de criptococosis.
- La solucin de aglutinacin de ltex (LA) fue producida como se ha descrito
previamente (21). La cantidad ptima de antgeno utilizado fue la dilucin ms alta
que produjo una clara aglutinacin con el suero de control positivo. Las
suspensiones fueron almacenadas a 4 C y llevarse a temperatura ambiente antes de
su uso.
El LAT se llev a cabo mediante la mezcla de 25 l de solucin de LA con 25 l del
suero de ensayo en un portaobjetos de oscuridad durante 5 min. Todas las muestras
de suero se ensayaron con y sin tratamiento previo en este ensayo. Slo solucin
tampn se us como un control negativo. Se observaron los patrones de
aglutinacin segn lo establecido anteriormente.
La piscina de exoantgenos derivados de cepas de P. brasiliensis fue positivo en la prueba
de identificacin con el suero de control positivo. Exoantgeno perfil mostr 5 componentes
que van desde 22 hasta 180 kDa, como se muestra por SDS-PAGE. Se observaron dos
antgenos dominantes del hongo (gp43 y gp70). La solucin de LA era reactiva a un nivel
de 3 con ambos controles de suero positivo pretratadas y no pretratado. (21)

4.- Tcnica de aglutinacin con carbn activado
Para esta tcnica tenemos que el carbn activado es obtenido de la combustin de materia
vegetal y tiene la propiedad de ser un potente adsorbente. Su capacidad de adsorcin se da
gracias a que su constitucin consta ms que nada micro poros. (11)
En inmunoaglutinacin las partculas de carbn tienen adheridas a sus partculas sustancias
como colesterol, leticina y cardiolipina o conocidas como reagininas plasmticas en la
prueba de RPR.

5.- Tcnica de hemaglutinacin
Una variedad de antgenos puede ser acoplado a los eritrocitos (glbulos rojos) para
proporcionar el sistema de indicadores para detectar anticuerpos.
Antgenos diana, tales como polisacridos, se adhieren fcilmente a los glbulos rojos,
incluyendo antgenos de E. coli, N. meningitidis, y Toxoplasma sp. as como derivado de
protena purificada de M. tuberculosis.
Antgenos de carbohidratos se adhieren fcilmente a los glbulos rojos, pero los antgenos
proteicos requieren pretratamiento con cido tnico (produccin de glbulos rojos
"curtidos") o con cloruro de cromo. (8)
El curtir a los glbulos rojos facilita un recubrimiento de alta densidad que aumenta la
sensibilidad del sistema de ensayo. Tratamiento con formalina o glutaraldehdo
subsiguiente de los glbulos rojos curtidos recubiertas con protenas o hidratos de carbono
permite el almacenamiento a largo plazo. Los glbulos rojos curtidos tratados recubiertos
con antgenos de protena se han utilizado para la deteccin de anticuerpos a las toxinas,
por ejemplo, toxina de la difteria o la toxina del ttanos. Treponema anticuerpos se detectan
mediante el uso de antgenos treponmicos adsorbidos a los glbulos rojos curtidos en el
ensayo de micro-hemaglutinacin para Treponema pallidum. (8)



17



Demostracin de hemaglutinacin utilizando anticuerpos contra glbulos rojos de
oveja (SRBC). El tubo testigo (10) slo contiene SRBC, que se asientan en un botn
slido.
Los tubos experimentales 1 a 9 contienen un nmero constante de SRBC ms diluciones
seriadas al doble de suero anti-SRBC. El patrn de diseminacin en la serie experimental
indica hemaglutinacin positiva en el tubo 3. (2)

Ejemplo donde se aplica:
Melioidosis, que es causada por el bacilo Gram negativo saprophytic Burkholderia
pseudomallei, es endmica en el norte de Australia y el sudeste Asia. Se han reportado tasas
de incidencia anual de esta enfermedad las cuales varan de 16,5 casos por cada 100.000
habitantes en el norte de Australia a 4,4 por 100.000 habitantes en el noreste de Tailandia.
Las partes proteicas, pueden afectar a casi cualquier sitio en el cuerpo, y tiene un espectro
de gravedad de la sepsis fulminante aguda a la infeccin crnica. Los factores de riesgo
para la enfermedad son la diabetes, consumo excesivo de alcohol y enfermedad renal
cronica. El diagnstico se basa en pruebas de diagnstico rpido, sobre todo basado en la
deteccin de anticuerpos, se confunden por la alta prevalencia de positividad serolgica en
las zonas con enfermedades endmicas.
Los mecanismos inmunes que median la resistencia a la melioidosis estn mal definidos.
Exposicin natural repetida a B. pseudomallei y organismos saprfitos antignicamente
relacionados son suficientes para inducir anticuerpos especficos. Aunque algunos estudios
han sugerido que los altos niveles de anticuerpos especficos pueden ser de proteccin,
anticuerpos especficos en la mayora de los pacientes son insuficientes para prevenir o
eliminar la infeccin con B. pseudomallei.
Otros trabajos han demostrado que una respuesta mediada por clulas especficas est
presente en los supervivientes de la melioidosis, pero la falta de asociacin de melioidosis
con la infeccin con el virus de la inmunodeficiencia humana sugiere que otros
mecanismos pueden mediar la proteccin contra B. pseudomallei.
El ensayo de hemaglutinacin indirecta (IHA) sigue siendo la prueba serolgica slo
ampliamente utilizado para la melioidosis, a pesar de su conocida baja sensibilidad y
especificidad. (22)

Tcnicas inmunofluorimtricas

La fluorescencia es una propiedad con la que cuentan ciertas molculas que, al ser
irradiadas con energa electromagntica de longitud de onda adecuada, emiten radiacin de
longitud de onda caracterstica permitiendo su cuantificacin. (1)
Las molculas fluorescentes absorben luz de una longitud de onda (excitacin) y emiten luz
de otra longitud de onda (emisin). Si las molculas de anticuerpo se marcan con un
colorante fluorescente o Fluorocromo, los complejos inmunitarios que contienen estos
anticuerpos marcados con fluorescencia (FA) pueden detectarse por la emisin de luz de
color cuando se excitan con una luz de longitud de onda apropiada. (2)
Cada uno de los fluorocromos que se mencionan a continuacin absorbe luz en una
longitud de onda y emite luz a una longitud de onda ms larga:
18

Fluorescena, un colorante orgnico que es el marcador ms utilizado para procedimientos
de Inmunofluorescencia, absorbe luz azul (490 nm) y emite una fluorescencia
verde-amarillo intensa (517 nm). (2)
Rodamina, otro colorante orgnico, absorbe en el intervalo entre el verde y el amarillo
(515 nm) y emite una fluorescencia roja intensa (546 nm). Ya que emite fluorescencia en
una longitud de onda ms larga que la fluorescena, puede usarse en pruebas de
inmunofluorescencia de dos colores. Un anticuerpo especfico para un determinante se
marca con fluorescena y un anticuerpo que reconoce un antgeno distinto, con rodamina.
La localizacin del anticuerpo marcado con fluorescena es visible por su color verde
amarillo, fcil de distinguir del rojo que se emite donde el anticuerpo marcado con
rodamina se uni. La conjugacin de fluorescena a un anticuerpo y la de rodamina a otro
anticuerpo permite, por ejemplo, ver al mismo tiempo dos antgenos de membrana celular
diferentes en la misma clula. (2)
Ficoeritrina absorbe luz de manera eficiente (~30 veces ms que la fluorescena) y es un
emisor brillante de fluorescencia roja, lo cual la hace de uso amplio como un marcador de
inmunofluorescencia. (2)
Esta tcnica puede ser dividida en:

1. Inmunofluorescencia Directa
2. Inmunofluorescencia Indirecta
3. Citometra de flujo

Si bien la ltima en esta lista se considera una tcnica diferente, se toma en cuenta un
aspecto que se considera relevante para entrar en esta categora que es el uso de
fluorocromos.

La inmunofluorescencia se utiliza para la deteccin de autoanticuerpos y anticuerpos contra
antgenos de superficie de clulas y tejidos. (1)
La inmunofluorescencia tambin es una herramienta de diagnstico valiosa auxiliar para las
enfermedades ampollosas autoinmunes y trastornos inflamatorios, ya que sus hallazgos
clnicos e histopatolgicos pueden ser concluyentes. (13)
Como puede utilizarse para mapear la localizacin real de antgenos blanco, la microscopia
de fluorescencia es un instrumento potente para relacionar la arquitectura molecular de los
tejidos y rganos con su anatoma macroscpica global. (2)

1.- Inmunofluorescencia Directa
Esta tcnica consiste en la tincin histolgica para la identificacin de anticuerpos in vivo
que se enlazan a antgenos tisulares o de tejidos. (15)
El anticuerpo reconoce la molcula diana y se une a ella, y el fluorocromo. Esta tcnica
tiene varias ventajas sobre la inmunofluorescencia indirecta debido a la conjugacin directa
del anticuerpo con el fluorocromo. Esto reduce el nmero de pasos en el procedimiento de
tincin que hacen el proceso ms rpido y puede reducir la seal de fondo por evitar
algunos problemas con anticuerpos de reactividad cruzada o no especificidad. Sin embargo,
ya que el nmero de molculas fluorescentes que se pueden enlazar con el anticuerpo
primario es limitado, inmunofluorescencia directa es menos sensible que la
inmunofluorescencia indirecta. (13)

19


2.- Inmunofluorescencia Indirecta
En la tincin indirecta el anticuerpo primario no se marca y se detecta con un reactivo
adicional marcado con fluorocromo. Se han desarrollado varios reactivos para la tincin
indirecta. El ms usual es un anticuerpo secundario marcado con fluorocromo formado en
una especie contra anticuerpos de otra especie, como la inmunoglobulina antirratn de
cabra marcada con fluorescena.
La tincin de inmunofluorescencia indirecta tiene dos ventajas sobre la tincin directa.
Primera, no es necesario conjugar el anticuerpo primario con un fluorocromo. Puesto que la
dotacin de anticuerpo primario suele ser un factor limitante, los mtodos indirectos evitan
la prdida de anticuerpo que suele ocurrir durante la reaccin de conjugacin. Segunda, los
mtodos indirectos aumentan la sensibilidad de tincin porque mltiples molculas del
reactivo fluorocromo se unen a cada molcula de anticuerpo primario, lo que incrementa la
cantidad de luz que se emite en la localizacin de cada molcula de anticuerpo primario. (2)

Ejemplo donde se aplica:
Los hantavirus son virus de ARN de cadena simple envoltura y de sentido negativo de la
familia Bunyaviridae. El genoma del hantavirus se compone de tres segmentos (L, M y S),
que codifican para la ARN polimerasa viral (protena L), glicoprotenas (Gn y Gc) y la
protena de la nucleocpside (N), respectivamente. La mayora de los hantavirus son
agentes etiolgicos de cualquiera de fiebre hemorrgica con sndrome renal (FHSR) o
Sndrome Cardiopulmonar por Hantavirus (SCPH). El nmero de infecciones por
hantavirus es cada vez mayor, como se refleja en un brote reciente en el Parque Nacional
Yosemite, que puso un estimado de 10.000 personas en riesgo de infeccin y ha causado
varios casos fatales. La transmisin al hombre se produce a travs de las vas respiratorias
por inhalacin de polvo y aerosoles que contienen partculas de virus contaminadas vertidas
por especies reservorio viral persistentemente infectado (principalmente ratones, topillos y
ratas).
Para la deteccin con inmunofluorescencia basado en multiparamtros de hantavirus IgG e
IgM especficos, el Mosaico Hantavirus 1 y 3 se utilizaron. Estos ensayos se CEmarked y
validadas de acuerdo con la Directiva 98/79/CE sobre productos sanitarios para diagnstico
in vitro, el cumplimiento de los requisitos de anlisis estandarizados y reproducibles. Los
ensayos de inmunofluorescencia Multiparmetrico se basan en fragmentos de tamao
milimtrico de portaobjetos de vidrio pegados al lado del otro en los campos de reaccin de
un portaobjetos de microscopio. Los biochips se recubrieron con clulas infectadas por
hantavirus-EU14, seguido por la fijacin de acetona y la irradiacin gamma. (23)

3.- Citometra de Flujo
La tcnica de inmunofluorescencia se suele utilizar en el estudio de poblaciones de clulas
de sangre perifrica. (1)
Las tcnicas de anticuerpos fluorescentes descritas son instrumentos cualitativos
extremadamente valiosos, pero no proporcionan datos cuantitativos. Este inconveniente se
elimin con el desarrollo del citmetro de flujo, que se dise para automatizar el anlisis y
la separacin de clulas teidas con anticuerpo fluorescente. (2)
El citmetro de flujo recurre a un rayo lser y un detector de luz para contar clulas intactas
aisladas en suspensin Cada vez que una clula pasa por el rayo lser, la luz del detector se
desva y esta interrupcin de la seal lser se registra. El lser excita las clulas que tienen
20

un anticuerpo marcado con fluorescencia unido a sus antgenos de superficie celular, de
modo que emiten luz que un segundo sistema detector localizado en ngulo recto con el haz
lser registra. La forma ms sencilla del instrumento cuenta cada clula cuando pasa por el
haz lser, y registra el grado de fluorescencia que la clula emite; una computadora
conectada al sistema genera grficas del nmero de clulas como coordenadas y su
intensidad de fluorescencia como abscisas. Las versiones ms complicadas del instrumento
son capaces de seleccionar poblaciones de clulas en diferentes contenedores segn su
perfil de fluorescencia. (2)
El uso del instrumento para determinar qu poblacin celular y cuntos de sus miembros
unen anticuerpos marcados con fluorescencia se denomina anlisis; el empleo del
instrumento para colocar clulas que tienen diferentes patrones de reactividad en
contenedores distintos se denomina clasificacin celular. El citmetro de flujo tiene
mltiples aplicaciones en problemas clnicos y de investigacin. Un uso clnico frecuente
consiste en determinar el grupo y el nmero de glbulos blancos en muestras de sangre. (2)
La Citometra de flujo ocupa ahora una posicin fundamental en la inmunologa y la
biologa celular, y tambin constituye
un recurso clnico indispensable. El
citmetro de flujo es uno de los
instrumentos esenciales para la
deteccin y clasificacin de leucemias
en muchos centros mdicos. (2)



Separacin de clulas marcadas con
fluorocromo en el citmetro de flujo.
En el ejemplo que se muestra, una
poblacin mixta de clulas se ti con
dos anticuerpos: uno especfico para el
antgeno de superficie A y el otro
especfico para el antgeno de
superficie B. Los anticuerpos anti-A se
marcaron con fluorescena (verde) y los
anticuerpos anti-B con rodamina (rojo).


Ejemplo donde se aplica:
Hemoglobinuria paroxstica nocturna (HPN) es una enfermedad de clulas madre
hematopoyticas adquirida que es causada por una mutacin somtica de la fosfa-tidyl-
inositol glicano (PIG-A) gen ligado al cromosoma X. Dado que el PIG A-protena est
implicada en la etapa inicial de la sntesis de la (GPI) de anclaje glicosilfosfatidil-inositol,
estos defectos resultan en deficiencia parcial o absoluta de todas las protenas /
glicoprotenas unidas a GPI en un clon de clulas madre hematopoyticas. La expansin de
los clones HPN-como tambin se puede detectar en los casos de sndromes aplsica /
hipoplasia / mielodisplsico causados por un fallo inmune-mediada de la hematopoyesis
normal o defecto en las clulas madre hematopoyticas.
21

Diagnstico y seguimiento de los pacientes con HPN se ha mejorado en gran medida por la
llegada de los ensayos basados en citometra de flujo. Debido al papel histrico de las
clulas rojas de la sangre en el diagnstico de la HPN, la mayora de los enfoques de
citometra de flujo han implicado la tincin de las clulas rojas de la sangre de los pacientes
con CD55 y CD59. Anlisis citomtrico de flujo de los glbulos rojos en pacientes no
transfundidos se puede utilizar para cuantificar el Tipo III (deficiencia completa), tipo II
(deficiencia parcial), y de tipo I (expresin normal) clones.
Hay varios problemas potenciales con este enfoque, la lisis de los glbulos rojos y Tipo III
o la presencia de glbulos rojos normales recientemente transfundidos reduce
significativamente la capacidad de detectar eritrocitos HPN. Como HPN es una enfermedad
rara, la deficiencia de al menos dos estructuras unidas a GPI en ms de un linaje, por lo
general, los neutrfilos, es un criterio adicional necesario para establecer un diagnstico. En
situaciones de hemlisis antes y / o transfusin de glbulos rojos reciente, la deteccin de
los granulocitos PNH refleja mejor el tamao del clon HPN.
Sin embargo, la neutropenia grave en algunos pacientes hace que sea difcil de identificar la
poblacin objetivo utilizando las caractersticas de dispersin de luz sola. Ms an, en un
pequeo nmero de pacientes con HPN, slo los neutrfilos se ven afectados. Debido a su
vida til prolongada, los linfocitos no son normalmente una buena poblacin objetivo para
el anlisis, ya que slo los que surgen despus de la aparicin de la enfermedad ser
deficiente en las estructuras unidas a GPI, la mayora va a expresar protenas GPI mientras
que los neutrfilos, monocitos, y clulas rojas no lo hacen.

Tcnicas inmunoenzimticas

Los inmunoensayos enzimticos utilizan enzimas, por lo general peroxidasa o fosfatasa
alcalina, para detectar y cuantificar reacciones inmunoqumicas. Ambos anticuerpos o
antgenos se pueden etiquetar con una enzima con el fin de ayudar a la deteccin. (9)
El ensayo de inmunosorbente ligado a enzima, que suele conocerse como ELISA (o EIA),
depende de la conjugacin de una enzima con un anticuerpo. (6)
Una enzima conjugada con un anticuerpo reacciona con un sustrato incoloro para generar
un producto con reaccin de color. (2)
Ese sustrato se denomina sustrato cromgeno. Para ELISA se utilizan varias enzimas, como
fosfatasa alcalina, peroxidasa de rbano picante y - galactosidasa. Estas pruebas tienen
sensibilidad comparable a los RIA y la ventaja de ser ms seguras y menos costosas. (2)
Se cuenta con algunas variaciones de ELISA que permiten la deteccin cualitativa o la
medicin cuantitativa de antgeno o anticuerpo. Cada tipo de ELISA puede usarse de
manera cualitativa para detectar la presencia de anticuerpo o antgeno. De manera
alternativa, se realiza una curva estndar con base en concentraciones conocidas de
anticuerpo o antgeno, a partir de la cual es posible determinar la concentracin
desconocida de una muestra. (2)
Las tcnicas en las que se puede dividir ELISA, son debido a la molcula que contabilizan,
estos son:

1. ELISA Directo
2. ELISA Indirecto
3. ELISA competitivo
22

4. Quimioluminiscencia
5. ELISA en sndwich
6. Prueba ELISPOT



1.- ELISA Directo
Esta prueba se usa con frecuencia para detectar la presencia de drogas en la orina. Esta
prueba tiene como caracterstica la adsorcin de anticuerpos especficos contra la droga a
los pocillos de la placa de microtubulacion. Esta prueba positiva se detecta por el agregado
de un sustrato para la enzima ligada, se produce un color visible cuando la enzima
reacciona con su sustrato.

2.- ELISA Indirecto
Por medio de ELISA indirecto puede detectarse anticuerpo o determinarse de modo
cuantitativo. Suero o alguna otra muestra que contenga el anticuerpo primario (Ab1) se
aade a un foso de microttulo recubierto con antgeno y se permite que reaccione con el
antgeno unido al foso. Despus de eliminar por lavado cualquier Ab1 libre, la presencia de
anticuerpo unido a antgeno se detecta mediante la adicin de un anticuerpo secundario
(Ab2) conjugado con enzima, que se une al anticuerpo primario. A continuacin se elimina
por lavado cualquier Ab2 libre y se aade un sustrato para la enzima. La cantidad de
producto de la reaccin de color que se forma se mide con lectores espectrofotomtricos de
placa especializados, que pueden medir la absorbancia de la totalidad de los fosos de una
placa de 96 fosos en segundos. (2)
El ELISA indirecto es el mtodo de eleccin para detectar la presencia de anticuerpos
sricos contra el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), el agente causal del
sndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA). En esta prueba, protenas recombinantes
de la envoltura y del ncleo del VIH se adsorben como antgenos en fase slida a fosos de
microttulo. Las personas infectadas con VIH producen anticuerpos sricos contra eptopos
en estas protenas vricas. Por lo general, el ELISA indirecto permite detectar anticuerpos
sricos contra VIH desde las primeras seis semanas de una infeccin. (2)

3.- ELISA competitivo
El mtodo de ELISA competitivo es otra variante para medir cantidades de antgeno (fi g.
6-10c). En esta tcnica se incuba primero anticuerpo en solucin con una muestra que
contiene antgeno. Despus la mezcla de antgeno y anticuerpo se aade a un foso de
microttulo recubierto con antgeno. Cuanto ms antgeno se encuentra en la muestra, tanto
menos anticuerpo libre est disponible para unirse al foso recubierto con antgeno. (2)
La adicin de un anticuerpo secundario (Ab2) conjugado con la enzima especfica para el
isotipo de un anticuerpo primario puede utilizarse para determinar la cantidad de anticuerpo
primario unido al foso como en un ELISA indirecto. Sin embargo, en la prueba competitiva
cuanto ms alta es la concentracin de antgeno en la muestra original tanto ms baja es la
absorcin. (2)

4.- Quimioluminiscencia
23

La luz que se produce por quimioluminiscencia durante determinadas reacciones qumicas
constituye una alternativa conveniente y muy sensible para las mediciones de absorbancia
en ELISA. Las versiones de ELISA que recurren a la quimioluminiscencia usan un sustrato
luxgeno (que genera luz) en lugar del sustrato cromgeno de las reacciones ELISA
ordinarias. (2)
La luz que se genera durante las reacciones luxgenas puede detectarse en virtud de su
capacidad de exponer pelcula fotogrfica. La medicin cuantitativa de la emisin de luz
puede hacerse por medio de un luminmetro. La ventaja de las pruebas de
quimioluminiscencia sobre las cromgenas es la mejora de la sensibilidad.
En general el lmite de deteccin puede incrementarse cuando menos 10 veces si se cambia
de un sustrato cromgenoa uno luxgeno, y ms de 200 veces cuando se adicionan agentes
de realce. De hecho, en condiciones ideales se detectan apenas 5 x 10^18 moles (5
attomoles) de antgeno blanco. (2)

5.- ELISA en sndwich
Es posible detectar o medir antgeno mediante ELISA en sndwich. En esta tcnica, el
anticuerpo (en lugar del antgeno) se inmoviliza en un foso de microttulo. Se aade una
muestra que contiene antgeno y se deja reaccionar con el anticuerpo inmovilizado.
Despus de lavar el foso, se agrega un segundo anticuerpo ligado a enzima especfico para
un eptopo distinto del antgeno y se permite que reaccione con el antgeno unido. Tras
eliminar cualquier segundo anticuerpo libre mediante lavado, se aade sustrato y se mide el
producto de la reaccin de color. (2)

6.- Prueba ELISPOT
Una modificacin de la prueba ELISA llamada ELISPOT permite la deteccin cuantitativa
del nmero de clulas en una poblacin que produce anticuerpos especficos contra un
antgeno determinado o un antgeno contra el que se dispone de un anticuerpo especfico.
En este mtodo las placas se recubren con el antgeno (antgeno de captura) reconocido por
el anticuerpo de inters o con el anticuerpo (anticuerpo de captura) especfico para el
antgeno cuya produccin se valora. Luego se aade a las placas recubiertas una suspensin
de la poblacin celular que se investiga y se incuba. Las clulas se asientan en la superficie
de la placa, y las molculas secretadas reactivas a las molculas de captura son unidas en la
cercana de las clulas secretorias, lo que produce un anillo de complejos antgeno-
anticuerpo alrededor de cada clula que sintetiza la molcula de inters. A continuacin la
placa se lava y un anticuerpo unido a enzima especfico para el antgeno secretado o para la
especie (p. ej., anticonejo de cabra) del anticuerpo secretado se aade y deja unir. El
revelado ulterior del ensayo por la adicin de un sustrato cromgeno o luxgeno adecuado
indica la posicin de cada clula productora de anticuerpo o de antgeno como un punto de
color o luz. (2)
24


Ejemplo donde se aplica:
Debido al diagnstico correcto y rpido de la infeccin por Mycobacterium tuberculosis,
nuestro objetivo es el uso de mtodos modernos y eficaces. Desde este punto de vista, el
objetivo de este estudio es poner de relieve la utilidad de ciertas tcnicas mdicas, en el
cribado de la infeccin por Mycobacterium tuberculosis. En este contexto, el estudio se
refiere a la utilizacin de tcnicas de laboratorio que permiten el diagnstico indirecto de la
tuberculosis. Para ello, se utiliz una prueba que se basa en la tcnica inmunoenzimtica
denominada ELISA (ensayo inmunoenzimtico), denominada QuantiFERON-TB Gold.
La tcnica inmunoenzimtica de laboratorio, QuantiFERON-TB Gold representa una
prueba indirecta para la infeccin con Mycobacterium tuberculosis, incluyendo la forma
activa de la enfermedad, pero no exclusivamente para fines de diagnstico.
La importancia de esta tcnica consiste en el hecho de que permite la determinacin
cuantitativa de la - interfern que se libera en el plasma como consecuencia de la
interaccin entre los antgenos ppticas que estimula las protenas micobacterianas y los
linfocitos T de los individuos que son infectados por los organismos del complejo de
Mycobacterium tuberculosis.
25

El QuantiFERON - TB Gold (Mtodo A-tina), el cual utiliza el ELISA (ensayo
inmunoenzimtico) tcnica inmunoenzimtica, se considera un mtodo de laboratorio
altamente sensibles.
La tcnica inmunoenzimtica en el que se basa la QuantiFERON TB Prueba de
laboratorio de oro representa uno de los mtodos utilizados a nivel internacional en el
diagnstico de la infeccin con Mycobacterium tuberculosis.
La corroboracin de los resultados de la prueba con los datos, paraclnicos especialidad
clnica y con los resultados de las investigaciones de formacin de imgenes permite la
creacin de alta precisin del diagnstico de la tuberculosis. (24)

Tcnicas inmunorradiolgicas

Una de las tcnicas ms sensibles para detectar antgeno o anticuerpo es el
radioinmunoensayo. (2)
El principio del RIA implica la unin competitiva de antgeno radiomarcado y antgeno no
marcado a un anticuerpo de alta afinidad. El antgeno marcado se mezcla con anticuerpo a
una concentracin que satura los sitios de unin a antgeno del anticuerpo. En seguida se
aaden en cantidades crecientes las muestras de antgeno no marcado de concentracin
desconocida. El anticuerpo no distingue el antgeno marcado del no marcado, por lo que los
dos tipos de antgeno compiten por los sitios de unin disponibles en el anticuerpo. (2)
Conforme la concentracin de antgeno no marcado aumenta, ms antgeno con la marca
radiactiva es desplazado de los sitios de unin. El decremento de la cantidad de antgeno
radiomarcado que se une al anticuerpo especfico en presencia de la muestra en estudio se
mide para determinar la cantidad de antgeno que esta ltima contiene. (2)
Por lo general el antgeno se marca con un istopo emisor de partculas como 125I, pero
tambin suelen emplearse como marcas istopos de emisin como el tritio (3H). El
antgeno radiomarcado es parte de la mezcla de valoracin; la muestra de estudio puede ser
alguna compleja, como suero u otros lquidos corporales, que contiene el antgeno no
marcado. La primera etapa para llevar a cabo un RIA es determinar la cantidad de
anticuerpo necesario para unir 50 a 70% de la cantidad fi ja de antgeno radiactivo (Ag*) en
la mezcla por valorar. Esta relacin de anticuerpo con Ag* se eligi para asegurar que la
cantidad de eptopos que el antgeno marcado presenta siempre exceda el nmero total de
sitios de unin de anticuerpo. En consecuencia, el antgeno no marcado que se agrega a la
mezcla de estudio compite con el antgeno radiomarcado por el suministro limitado de
anticuerpo. Incluso una cantidad pequea de antgeno sin marca aadido a la mezcla de
antgeno marcado y anticuerpo en estudio origina un descenso en la cantidad de antgeno
radiactivo unido, y esta disminucin es proporcional a la cuanta del antgeno no marcado
aadido. Con objeto de determinar la cantidad de antgeno marcado unida, el complejo Ag-
Ab se precipita para separarlo del antgeno libre (antgeno no unido a anticuerpo) y se mide
la radiactividad en el precipitado. Puede generarse una curva estndar utilizando muestras
de antgeno no marcado de concentracin conocida (en lugar de la muestra de estudio), y a
partir de esta grfica es posible determinar con precisin la cantidad de antgeno en la
mezcla de estudio. (2)
Se han desarrollado varios mtodos para separar antgeno unido de antgeno libre en RIA.
Uno de ellos incluye la precipitacin del complejo Ag-Ab con un antisuero antiisotipo
secundario. (2)
26

Por ejemplo, si el complejo Ag-Ab contiene anticuerpo IgG de conejo, entonces la IgG
anticonejo de cabra se une a la IgG de conejo y precipita el complejo. En otro mtodo se
utiliza el hecho de que la protena A de Staphylococcus aureus tiene alta afinidad por la
inmunoglobulina G (IgG). Si el complejo Ag-Ab contiene un anticuerpo IgG, el complejo
puede precipitarse mezclndolo con S. aureus muerto con formalina. Tras eliminar el
complejo por cualesquiera de estos mtodos es posible medir la cantidad de antgeno
marcado libre que queda en el sobrenadante con un contador de radiacin; la sustraccin de
este valor de la cantidad total de antgeno marcado aadido proporciona la cantidad de
antgeno marcado unido. (2)
Se han creado diversos RIA de fase slida que hacen ms fcil separar el complejo Ag-Ab
del antgeno no unido. En algunos casos el anticuerpo se une por enlaces cruzados
covalentes a cuentas de Sepharose. La cantidad de antgeno radiomarcado unido a las
cuentas puede medirse despus de centrifugar y lavar estas ltimas. De modo alternativo el
anticuerpo se inmoviliza en fosos de poliestireno o policloruro de vinilo y la cantidad de
antgeno marcado libre en el sobrenadante se determina en un contador de radiacin. En
otro mtodo se inmoviliza el anticuerpo en las paredes de los fosos de microttulo y se
determina la cantidad de antgeno unido. Ya que el procedimiento slo requiere cantidades
pequeas de la muestra y puede realizarse en placas de microttulo pequeas de 96 fosos
(un poco ms grandes que una tarjeta de 3 x 5), este procedimiento resulta muy adecuado
para determinar la concentracin de un antgeno particular en un gran nmero de muestras.
Por ejemplo, el RIA de microttulo se utiliza con amplitud para detectar la presencia de
virus de hepatitis B. El RIA de la sangre del donante reduce mucho la incidencia de
infecciones por hepatitis B en receptores de transfusiones sanguneas. (2)



Radioinmunoensayo (RIA) de fase slida para
detectar virus de hepatitis B en muestras de
sangre. a) Fosos de microttulo se cubren con una
cantidad constante de anticuerpo especfico para
Hbs Ag, el antgeno de superficie en viriones de
hepatitis B. A continuacin se aaden una muestra
de suero y [125I]HBsAg. Tras la incubacin, el
sobrenadante se extrae y la radiactividad de los
complejos antgeno-anticuerpo se mide. Si la
muestra est infectada, la cantidad del marcador
unido es menor que en los testigos con suero no infectado. b) Se obtiene una curva estndar
aadiendo concentraciones crecientes de HbsAg no marcado a una cantidad fi ja de
[125I]HBsAg y anticuerpo especfico. La grfica de porcentaje de antgeno marcado unido
27

contra concentracin de antgeno no marcado permite determinar la concentracin de
HBsAg en muestras de suero desconocidas mediante el uso de la parte lineal de la curva. (2)

Ejemplo donde se aplica:
Trastornos de la tiroides afectan a un amplio espectro de la poblacin en Sudn. Numerosas
modalidades de imagen, incluyendo la medicina nuclear, ecografa, fluorescencia de rayos
X (XRF), tomografa computarizada (TC) y la resonancia magntica nuclear (RMN), se han
utilizado en un intento de proporcionar un diagnstico fisiopatolgico relacionada en
pacientes con diferentes enfermedades de la tiroides.
Para la mayora de los pacientes con enfermedad de la tiroides, la combinacin de la
exploracin fsica especializada, la funcin tiroidea, la biopsia por aspiracin con aguja
fina, y la gammagrafa proporcionan los medios ms rentables de la evaluacin de la
glndula tiroides y sus enfermedades. Medicin de la concentracin de yodo en la orina da
una idea de la ingesta de yodo y determinar su papel como el ms comn sobre el factor en
el bocio etiologa.
Usos de RIA gammagrafa juntos podran ayudar a obtener resultados precisos, muestran
una variacin anatmica y cambios patolgicos. La palpacin solo, sobre todo en la edad de
los adolescentes, no es adecuado en la deteccin temprana de desarrollo bocio. (25)

Conclusin
Los inmunoensayos constituyen herramientas de gran utilidad en la identificacin rpida de
enfermedades basndose en las reacciones del sistema inmune. La introduccin de estos
mtodos dentro de los protocolos de los laboratorios de anlisis no solo de la rama de
inmunologa debe de seguir estudindose para modificar u optimizar alguna tcnica y asi
aprovechar el mximo de cada tcnica.


















28


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