Diagnosticul de laborator al infectiilor produse de bacterii din genurile Pseudomonas, Acinetobacter,

Flavobacterium. Testarea sensibilitatii la antibiotice. Implicarea in producerea infectiilor comunitare

si nosocomiale. Algoritmul de diagnostic, demonstratii, interpretare.

35. Diagnosticul de laborator n infeciile
produse de microorganisme din genul
Pseudomonas
Genul Pseudomonas face parte din familia Pseudomonodaceae i include mai multe specii.
Pseudomonas aeruginosa (bacilul piocianic, bacilul puroiului albastru) reprezint specia
cea mai important a genului, relativ frecvent implicat n infecii la persoane cu reactivitate
sczut, precum i n infecii nosocomiale (infecii de spital). Aceti germeni sunt bacili
gram-negativi aerobi,oxidazo pozitivi, nesporulai, cu dimensiuni de 1-5m / 0,5-1m, mobili
datorit prezenei unuia sau mai multor flageli (polari).
Datorit capacitii de adaptare i supravieuire n diferite medii, precum i datorit factorilor
de virulen pe care i deine, Pseudomonas aeruginosa poate produce infecii foarte variate,
de la infecii tegumentare superficiale pn la stri de sepsis cu evoluie fulminant. Prezena
piocianicului ar putea fi semnalat de culoarea albastr verzuie a pansamentelor. La
persoanele cu reactivitate normal, infeciile sunt de obicei localizate (foliculite, otite, infecii
oculare etc). La nivel dermic, procesul infecios poate avea i o evoluie grav, cu apariia de
vezicule care se sparg i se refac pe o baz necrotic; procesul poate progresa n profunzime
(ecthyma gangrenosum).
La persoanele spitalizate, cu reactivitate diminuat i supuse unor manevre medico-
chirurgicale invazive (intubaii, cateterizri etc) precum i la persoanele cu arsuri,
Pseudomonas aeruginosa poate produce infecii localizate, dar potenialul diseminrii i
apariiei unor complicaii grave (bacteriemie, osteomielit, meningit, endocardit, sepsis)
este foarte important. n lipsa tratamentului adecvat (dificil datorit rezistenei la antibiotice),
evoluia procesului infecios poate fi grav sau deosebit de grav. Un fenotip particularal
speciei Pseudomonas aeruginosa produce o infecie pulmonar cronic la pacienii cu fibroz
chistic (mucoviscidoz). Dintre entitile clinice menionate mai sus, din punct de vedere al
diagnosticului de laborator vom discuta infeciile supurative ale tegumentelor i mucoaselor.
Diagnosticul de laborator este numai bacteriologic, direct, cu urmtoarele etape.
1. Recoltarea i transportul produsului patologic trebuie s se realizeze respectnd o serie de
reguli (ct mai aproape de debutul bolii, nainte ca pacientului s fi primit antibiotice, ct mai
rapid i corect din punct de vedere al tehnicilor utilizate, respectnd toate normele de asepsie
i antisepsie etc). n continuare vom discuta cazul n care p.p. este reprezentat de puroi (vezi
i capitolul 6). Puroiul trebuie examinat macroscopic, deoarece poate avea un aspect sugestiv
(culoare albastr sau galben-verzui fluorescent).
2. Examinarea microscopic a produsului patologic include realizarea a minim dou frotiuri
din produsul patologic recoltat i transportat corespunztor, care se vor colora cu albastru de
metilen (AM) i respectiv Gram. Frotiurile se examineaz la microscopul optic cu imersie i
se noteaz prezena celulelor de la nivel tegumentar (eventual modificate fa de normal),
prezena celulelor inflamatorii (ex. leucocite, piocite) i prezena bacililor gram-negativi cu
cu dimensiuni de 1-5m / 0,5-1m, dispui n lanuri scurte, perechi, izolai.
3. Cultivarea pe medii de cultur a produsului patologic se realizeaz n aa fel nct s se
poat obine colonii izolate i respectiv o cultur pur, care se va identifica (vezi i capitolele
9 i 10). Pseudomonas aeruginosa se poate dezvolta pe medii de cultur obinuite n 18-24
ore, la 5-42 C, cu dezvoltare optim la 30-37C. Se prefer utilizarea unor medii de cultur
selective. Uneori cultivarea se realizeaz pe agar-snge. Pe mediile solide Pseudomonas
aeruginosa formeaz colonii de tip S care se pigmenteaz n mod specific, nsoindu-se de
pigmentarea mediului (albastru sau galben-verde fluorescent). De menionat c pot aprea
colonii (de tip S) cu aspecte diferite, dnd impresia prezenei concomitente a unor bacterii
diferite. Cultura poate avea un miros aromat, ca al florilor de tei sau iasomie. Pe agar-snge
produce hemoliz. n medii lichide, Pseudomonas aeruginosa tulbur mediul ns n timp
duce la apariia unei membrane aderent, cenuie, la suprafaa acestuia. Dup 18-24 de ore,
sub membran se poate evidenia prezena pigmentului produs.
4. Identificarea microorganismului implicat patogenic se va realiza pe baza mai multor
caractere:
Caractere morfotinctoriale: Sunt bacili gram-negativicu cu dimensiuni de 1-5m / 0,5-
1m, dispui n lanuri scurte, perechi, izolai, relativ polimorfi. n culturi mai vechi pot aprea
diferite forme (filamentoase, cocoide). Mobilitatea se poate examina pe preparatul proaspt,
ntre lam i lamel.
Caractere de cultur:
Produc colonii de tip S care se pigmenteaz n mod specific, nsoindu-se de
pigmentarea mediului (albastru sau galben-verde fluorescent). Pot aprea colonii (de tip S)
cu aspecte diferite, dnd impresia prezenei concomitente a unor bacterii diferite. Coloniile
pot prezenta o suprafa iridescent, cu luciu metalic i plaje de autoliz, degajnd o arom
ptrunztoare particular. Pentru stimularea sintezei pigmenilor se poate folosi repicare pe
medii speciale, King F (stimuleaz producerea de fluorescein) i King P (stimuleaz
producerea de piocianin).
Cultura poate avea un miros aromat, ca al florilor de tei sau iasomie.
Pe mediile cu snge produc hemoliz.
Multiplicarea la 42 C poate fi util pentru identificare.
Caractere biochimice:
Produce diferii pigmeni, dintre care mai importani sunt piocianina (albastru) i
pioverdina sau fluoresceina (galben-verzui fluorescent).
Este un germen catalazo pozitiv care degradeaz oxidativ glucoza i nu fermenteaz
lactoza (att coloana ct i panta mediului TSI au culoare roie).
Se poate realiza testul de oxidare-fermentare a glucozei.
Bacilul piocianic este oxidazo pozitiv (vezi capitolul 12).
Pentru studii mai aprofundate, n momentul actual anumite laboratoare utilizeaz
sisteme comerciale care verific n acelai timp numeroase caractere biochimice permind nu
numai ncadrarea n genul Pseudomonas, dar i identificarea precis a speciei (de exemplu
Rapid NTF, cu identificarea speciei n 4-48 de ore).
Caractere de patogenitate:
Se pot studia n anumite situaii (inoculm 4 oareci cu cantiti fixe de germeni
cultivai pe geloz nclinat 2 % i urmrim supravieuirea acestora timp de patru zile).
Alte teste ce pot fi studiate n scopul identificrii germenilor:
Testarea caracterelor antigenice
Testarea sensibilitii la bacteriofagi (lizotipia) i respectiv piocinopia se pot utiliza n
studii epidemiologice sau n scop de cercetare, fiind rezervate laboratoarelor de referin
Teste de biologie molecular (sonde nucleotidice, analiza ADN dup utilizarea de
endonucleaze de restricie, PCR).
5. Antibiograma (verificarea sensibilitii la antibiotice i chimioterapice n vederea stabilirii
tratamentului) este obligatorie i se realizeaz de obicei prin metode difuzimetrice.
Pseudomonas aeruginosa reprezint unul dintre microorganismele care pot crea dificulti
deosebit de mari n alegerea tratamentului etiologic, datorit rezistenei la foarte multe dintre
antibioticele uzuale. Cu toate c anumii autori indic faptul ca bacilul piocianic ar fi sensibil
la mezlocilin, ticarcilin, ticarcilin-acid clavulanic, piperacilin, piperacilin-tazobactam,
imipenem, aztreonam, anumite aminoglicozide, fluorochinolone sau cefalosporine de
generaia a III-a, considerm c principiul care trebuie reinut este c n orice infecie cu
Pseudomonas aeruginosa (atunci cnd s-a dovedit c acest microorganism este agentul
etiologic al infeciei) antibiograma este obligatorie. n cazul unor infecii grave
antibiograma difuzimetric trebuie s fie nsoit de alte determinri (vezi capitolul 14).