0141 BIOQUIMICA EXPERIMENTAL

TRANSFERENCIA DE MATERIAL GENTICO II: TRANSFORMACIN

Objetivos
Conocer el fundamento para transformar clulas bacterianas.
Realizar la tcnica de transformacin bacteriana.
Aprender a identificar clulas transformantes mediante su fenotipo.
Conocer la definicin de organismo transgnico.
Conocer las aplicaciones de la transformacin bacteriana: beneficios y riesgos.
Introduccin
Desde pocas antiguas, el ser humano ha seleccionado animales y plantas con
caractersticas fenotpicas deseables. La domesticacin ha proporcionado importantes
beneficios a la humanidad incrementando la produccin de insumos para consumo humano.
Por ejemplo, hace 100 aos una vaca produca en promedio 2000 a 3000 litros de leche al
ao; actualmente, las vacas Holstein proporcionan un promedio de 6000 litros al ao, y las
mejores vacas son capaces de producir de 8000 a 10,000. Asimismo, una gallina hace 100
aos produca en promedio 70 huevos al ao, mientras que en este siglo las mejores razas
producen cerca de 250 al ao.
Las tcnicas convencionales de reproduccin han llevado a nuevas combinaciones de genes.
Sin embargo, la recombinacin cruzada entre miembros de especies distintas no ha sido
exitosa. Por ejemplo, la cruza entre la yegua y el burro produce la mula, que es estril. As, el
nmero de combinaciones nuevas es limitado, debido a que los genes pueden recombinarse
slo entre los miembros de la misma especie o con organismos muy relacionados.
Las barreras impenetrables entre especies han sido parcialmente superadas con el
surgimiento de tcnicas de manipulacin y de seleccin del material gentico, es decir, con la
ingeniera gentica. Debido a que el DNA contiene un cdigo gentico esencialmente igual
para todos los organismos, en principio se pueden transferir secuencias de genes de
organismos no relacionados y producir organismos con caractersticas tiles y particulares,
que de otra manera sera imposible obtener: los denominados organismos transgnicos.
Actualmente se ha identificado y caracterizado un gran nmero de genes. Este conocimiento
abre la posibilidad de buscar mtodos para introducir o modificar un gene que proporcione
una caracterstica deseable, como por ejemplo, curar enfermedades. No obstante los
posibles beneficios, hay que considerar que al introducir genes ajenos al husped se pueden
ocasionar efectos indeseados, por ejemplo, que la caracterstica introducida lleve a una
alteracin en el metabolismo, en la sealizacin y, por tanto, modifique la fisiologa y
sobrevivencia del individuo, o bien que se escape la nueva informacin de manera
indiscriminada a otros organismos.
Requisitos para construir un vector de clonacin
An cuando el cdigo gentico es bsicamente el mismo para todos los organismos, los
detalles finos del control gentico difieren. Un gene bacteriano no siempre puede expresarse
eficientemente si es introducido en una clula eucarionte. Para la produccin de un
organismo genticamente modificado se debe producir o construir un transgene, que
consiste en el gene de inters ms una parte extra de DNA que controle correctamente la
1

0141 BIOQUIMICA EXPERIMENTAL

funcin del gene en el nuevo husped. Por ejemplo, para que un gen procarionte se pueda
expresar en un organismo eucarionte se le debe agregar una regin promotora en el extremo
5 del gen para que sea reconocido por el aparato transcripcional del organismo receptor.
Recuerda que la regin promotora es un segmento de DNA localizado ro arriba de la regin
5 del gen y que acta como un elemento que controla la expresin del gen. Asimismo, se
debe aadir una secuencia de poli A en la porcin 3 del gen para que el RNAm pueda ser
traducido.
Los plsmidos poseen un inters singular en la Ingeniera Gentica por ser uno de los
vectores ms sencillos de usar. Un vector de clonacin es un sistema que permite
introducir en una clula hospedera el fragmento de DNA que se pretende clonar (obtener
mltiples copias); en esta clula hospedera el vector se replica y se expresa. La molcula
que resulta de la unin de un DNA vector con el DNA de inters (inserto) se denomina
vector recombinante.
Para ser utilizado como vector de clonacin, un plsmido debe poseer al menos tres
caractersticas (Figura 4.3):
1)
2)

3)

Tener su propio origen de replicacin y, por tanto, la capacidad de replicacin

autnoma e independiente del genoma del hospedero.
Tener un sitio de clonacin mltiple (SCM) que permita la apertura del DNA con
enzimas de restriccin (enzimas que cortan secuencias internas de DNA de manera
especfica) y hace posible la clonacin de insertos de DNA en la forma y orientacin
deseada.
Poseer marcadores genticos seleccionables que permitan aislar a las clulas
hospederas que contengan al vector, generalmente resistencia a un antibitico. La
mayora de los plsmidos naturales no cumplen todas estas condiciones, por lo que
una primera tarea de la Ingeniera Gentica ha consistido en la construccin de
plsmidos artificiales, combinando en una misma molcula diversos rasgos tiles
procedentes de los plsmidos naturales. La presencia en el plsmido del gen de
resistencia a ampicilina, kanamicina o tetracilina permite seleccionar las bacterias que
portan estos plsmidos, gracias a su capacidad para crecer en presencia de dicho
antibitico.

Adicionalmente, hay que considerar que muchos genes se expresan slo bajo ciertas
circunstancias metablicas y/o en tejidos especficos, por lo que usualmente es necesario
sustituir el promotor del donador por uno que asegure su expresin, denominados
promotores fuertes, que tambin pueden ser inducibles bajo ciertas condiciones de
crecimiento.

0141 BIOQUIMICA EXPERIMENTAL

Figura 4.3. Vector de clonacin pET-24. Se muestran algunas caractersticas del vector, como el sitio origen de la
transcripcin (ori), el sitio de clonacin mltiple (SCM), el sitio que confiere resistencia a kanamicina, KanR; f1 ori,
origen de replicacin f1 y el sitio que servir para controlar la expresin del transgene una vez que sea insertado
en el sitio de clonacin mltiple, el sitio de unin al represor lac I. Los vectores usualmente presentan ms de un
origen de replicacin, Ori que es el que es usado para que la bacteria se replique, mientras que f1 ori es el origen
de replicacin usado por el fago F1 y es usado para producir DNA de cadena sencilla.
Transformacin
Existen varias tcnicas para la introduccin del transgene en la clula u organismo, como son
la microinyeccin, la infeccin de una clula husped con virus que contenga al vector, o
mediante el uso de bacterias (principalmente para la transformacin de plantas). En el caso
de la transformacin de bacterias, generalmente se introduce el DNA ajeno por
microelectroporacin o por choque trmico.
Durante el choque trmico, las bacterias que sern las hospederas son pre-tratadas con
agentes que ocasionan el aumento en su permeabilidad membranal. Entre stos se
encuentran una temperatura elevada y el uso de iones que cambian la carga elctrica de la
membrana al recubrir las cabezas polares de lpidos (por ejemplo los iones Ca2+), lo que
disminuye la repulsin de cargas elctricas entre los fosfatos de los nucletidos y la
membrana y adems facilita la entrada del plsmido al interior celular. Las clulas que han
recibido un tratamiento apropiado para llevar a cabo la introduccin de material gentico se
denominan clulas competentes.
Una vez que se introduce el material gentico a las clulas competentes, se disminuye la
temperatura y se diluye el calcio, con lo que se restaura la permeabilidad membranal. Al
colocar a las clulas en condiciones ptimas de crecimiento se obtienen las clulas
transformantes.
En la prctica utilizaremos el vector recombinante que se muestra en la Figura 4.4, que
contiene el gen de la -lactamasa (transgene). Se realizar la transformacin mediante la
tcnica de choque trmico y la resistencia a kanamicina se utilizar como indicador de que
las clulas son transformantes.
3

0141 BIOQUIMICA EXPERIMENTAL

Figura 4.4. Vector recombinante pET-TEM-1-ompA-lactamasa. El vector pET24 (Figura 4.3) fue utilizado para la
construccin del vector pET-TEM-1. Se insert el gen que codifica para la -lactamasa (transgene) en el sitio de clonacin
mltiple del vector pET24. El transgene, ompA-lac, contiene la secuencia completa de la protena TEM-1 -lactamasa.
Para insertarlo se adicion el sitio de restriccin BamHI y adicionalmente se coloc hacia la regin 5 del gen la secuencia
que codifica para la secuencia seal o de trnsito de una protena que se encuentra en la membrana externa de bacterias,
en este caso la ompA. A diferencia de la protena OmpA, la -lactamasa es una enzima soluble, por lo que la secuencia
seal permitir que la bacteria transformante secrete a la enzima. Recuerda que al transformar a las clulas con el vector
pET-TEM-1-ompA-lactamasa pET, la resistencia que confiere a las clulas es a kanamicina ya que el plsmido contiene
un gene que confiere la resistencia a ese antibitico.

Material biolgico
1 tubo de microcentrfuga con 100 L clulas competentes de E. coli por grupo,
mantenerlas congeladas hasta su uso.
1 tubo de microcentrifuga con 100 L clulas competentes de E. coli por equipo,
mantenerlas congeladas hasta su uso.
Plsmido PET-TEM-1.
Materiales y equipo
2 cajas Petri con medio LB/Kanamicina (30 g/mL)
Tubos de microfuga de 1.5 mL
Varilla de vidrio en forma de L
Recipiente para hielo
Mechero Bunsen
Micropipeta de 100-1000 L
Micropipeta de 10-100 L
Caja de puntas para micropipeta con capacidad de 10 L estriles
Caja de puntas para micropipeta con capacidad de 200 L estriles
Caja de puntas para micropipeta con capacidad de 1000 L estriles
Material por grupo
Bao de incubacin a 42C
Incubadora con agitacin a 37C
4

0141 BIOQUIMICA EXPERIMENTAL

Reactivos
Medio SOC (Super Optimal broth with Catabolite repression). Medio que se prepara
utilizando el medio Luria adicionado con 20 mM Glucosa. (5 mL por grupo).
Desarrollo experimental
Las clulas competentes se proporcionarn congeladas. En el apndice se encuentra el
protocolo de preparacin de las clulas competentes.
Preparativos
1. Revisar y/o equilibrar el bao de incubacin a 42C.
2. Colocar el medio SOC a temperatura ambiente.
3. Se sugiere colocar las placas de Agar-LB-Kanamicina en la incubadora a 37C por 30
min. antes del plaqueo.
Transformacin de clulas competentes con el vector PET-TEM-1 por el mtodo de
choque trmico.
1. Tomar un tubo de clulas competentes del congelador y colocarlas directamente en el
hielo. Descongelar las clulas competentes en el hielo (las clulas competentes son
muy sensibles a los cambios de temperatura).
2. Aadir 1 a 5 L (1 a 50 g) del plsmido a un microtubo que contiene 100 L de
clulas competentes. NOTA. Los profesores te indicarn el volumen de DNA a
usar y su concentracin.
3. Mezclar invirtiendo el tubo.
4. Dejar en hielo por 30 minutos.
5. Dar choque trmico a 42C durante 45 segundos. NO AGITAR.
6. Agregar 450 L de medio SOC e incubar por 60 minutos a 37C con agitacin (225 a
250 rpm).
7. Si la turbidez del medio es escasa, concentrar las clulas por centrifugacin a 14,000
rpm por 1 min. Eliminar el sobrenadante y resuspender el paquete celular en 100 L
de medio SOC.
8. Esparcir los 100 L de las bacterias transformadas en las cajas con el medio de
seleccin (Agar-LB-kanamicina), ayudados con una varilla de vidrio.
9. Incubar a 37C por 24 h. Observar crecimiento y guardar la caja a 4C.
10. Como control negativo incubar 100 L de clulas competentes en una caja con LBkanamicina por 24 h a 37C.
11. Calcular la eficiencia de la transformacin, para lo cual se necesita conocer la
concentracin del DNA usado para la transformacin, el volumen aadido a la mezcla
de transformacin, el volumen usado para el plaqueo y el nmero de colonias
obtenidas.
Cuestionario
1. Qu es un organismo transgnico?
2. Cules son las principales diferencias entre los mtodos de reproduccin asistida y la
de produccin de organismos transgnicos para la produccin de organismos
mejorados?
3. Cules son las consideraciones ticas que deben tomarse en cuenta para producir
organismos transgnicos?
5

0141 BIOQUIMICA EXPERIMENTAL

4. Qu es un vector de clonacin?
5. Cules son los requisitos que debe cumplir un vector de clonacin para ser utilizado
para transformar a un organismo?
6. Da dos ejemplos de tipos de vectores que son usados para la clonacin de fragmentos
de DNA de alto peso molecular
7. Qu tipo de vector de clonacin es el pET24?
8. Cul es el mtodo de transformacin que se utilizar en la prctica?
9. Describe al menos otros dos mtodos para transformar clulas, ya sea de animales,
hongos o plantas.
10. Para realizar la transformacin de clulas, adems del vector de clonacin se
necesitan las clulas receptoras, qu tipo de clulas receptoras son las E. coli DH5
y las clulas E.coli BL21?
11. Cul es el marcador de seleccin de las cepas transformantes y dnde se encuentra
codificado?
12. Despus de obtener un organismo transgnico, cules son los cuidados que se
deben tener para su manipulacin o almacenamiento?
Referencias
Devlin T. Biochemistry. 1992 Ed. Wiley- Liss, pp. 768-773. Localizacin
QP514.2
Micklos DA, Freyer GA y Crotty DA. 2003 DNA Science. A first course. 2nd
edition. Cold spring Harbor Laboratory Press, CSH, New York, USA.
Localizacin QH442.
Nelson D. Principles of Biochemistry. 2004, 4a edition Ed. Freeman and
company, pp. 279-317. QH345 L43
Seidman C, Brent R. 1998. Introduction of plasmid DNA into cells. Current
protocols in protein science. A.4D.1-A.4D.2.
Sosa-Peinado A. Mustafi D, Makinen MW. 2000. Overexpression and
biosynthetic deuterium enrichment of TEM-1 beta-lactamase for structural
characterization by magnetic resonance methods. Protein Expression &
Purification 19: 235-45.
Stryer L. Bioquimica, 2004, Ed. Revert, pp.745-773.

http://www.colvema.org/PDF/amg1.pdf
http://www.revista.unam.mx/vol.1/num3/art3/
http://es.geocities.com/picodelobo/transgenesis.html
http://openwetware.org/wiki/E._coli_genotypes
http://www.sciencegateway.org/tools/transform.htm
eficiencia de la transformacin)

(determinacin

de

0141 BIOQUIMICA EXPERIMENTAL

TRANSFERENCIA DE MATERIAL GENTICO II:

AISLAMIENTO DE PLSMIDOS
Objetivos
Conocer los fundamentos para la purificacin del DNA plasmdico y su separacin del
DNA genmico.
Realizar el aislamiento del DNA plasmdico.
Introduccin
Desde finales de la dcada de los aos 70 del siglo pasado, se desarroll un gran nmero de
mtodos de aislamiento de plsmidos. La mayora toma en cuenta las diferencias topolgicas
(es decir, de acomodo en el espacio) entre los plsmidos circulares y los fragmentos
cromosomales lineales, as como el tamao de ambos. Cuando los puentes de hidrgeno
entre las cadenas complementarias del DNA del plsmido circular se rompen, ya sea por
calentamiento o por un pH alcalino, las cadenas permanecen cercanas ya que el
enrollamiento entre las dos cadenas no se perturba grandemente. En contraste, las cadenas
lineales o rotas de DNA se liberan o separan completamente. Si una mezcla de plsmido
desnaturalizado y de DNA cromosomal se renaturalizan rpidamente, ya sea por
enfriamiento o al restaurar el pH neutro de la solucin, la fidelidad de la reasociacin es
diferente para ambas macromolculas. La renaturalizacin de los plsmidos circulares es
rpida debido a que las cadenas estn prximas, mientras que las molculas lineales de
DNA se renaturalizan menos precisamente, formando redes de DNA o agregados que
pueden ser removidos de la suspensin por centrifugacin. El plsmido permanece en la
solucin y puede ser precipitado con alcohol despus de que el DNA cromosomal ha sido
removido.
Material biolgico
Clulas de E. coli transformante obtenidas en la prctica anterior.
Materiales y equipo
Tubos para microfuga
Recipiente para hielo
Microcentrfuga
Micropipeta de 100-1000 L
Micropipeta de 20-200 L
Micropipeta de 0.5-10 L
Caja de puntas para micropipeta con capacidad de 10 L
Caja de puntas para micropipeta con capacidad de 200 L
Caja de puntas para micropipeta con capacidad de 1000 L
Reactivos
Tubo de ensayo de 16X150 mm con 5 mL de medio Luria-Kanamicina (30 g/mL)
Solucin GTE: 50 mM Glucosa, 25 mM Tris/HCl pH 8.0 y EDTA 10 mM pH 8.0.
3 M Acetato de potasio pH 4.8
70% Etanol
Isopropanol
10 N NaOH
7

0141 BIOQUIMICA EXPERIMENTAL

10% SDS
Para preparar 500 L de solucin de lisis (0.2 N NaOH y 1% SDS p/v), tomar 10 L de
10 N NaOH y 50 L 10% SDS, aforar con agua destilada. De preferencia cada equipo
deber prepararla justo antes de usarla.
Desarrollo experimental (Figura 4.5)
Trabajo previo
1. Inocular una colonia de las clulas transformadas en 5 mL de medio Luria que
contenga kanamicina a una concentracin de 30 g/mL, e incubar a 37C por 12 h con
agitacin horizontal constante. Colocar los tubos de preferencia en forma diagonal
para que se agiten bien las clulas y haya buen crecimiento.
Obtencin de plsmido por el mtodo de lisis alcalina
2. Tomar 1.5 mL del cultivo, colocarlo en 1 tubo de microfuga de 1.5 mL y centrifugar a
10,000 rpm por 1 min a 4C. Descartar el sobrenadante eliminando totalmente el
medio Luria. Repetir este paso en el mismo tubo tres veces ms o hasta que el
cultivo se acabe el cultivo. De tal manera que el paquete celular de los 5 mL quede
en un solo microtubo.
3. Resuspender el paquete celular en 300 L de solucin GTE fra, agitando en el vrtex.
Incubar a temperatura ambiente por 5 minutos. Preparar la solucin de lisis durante
este tiempo de incubacin.
4. Adicionar 300 L de la solucin de lisis. Mezclar suavemente por inversin del tubo.
IMPORTANTE: no agitar en el vrtex. Incubar en hielo por 5 min.
5. Agregar 300 L de la solucin fra de acetato de potasio 3 M, pH 4.8 y mezclar
suavemente por inversin del tubo. Incubar en hielo por 5 min.
6. Centrifugar a 12,000 rpm durante 5 min. a 4C.
7. Colocar el sobrenadante en un tubo limpio y adicionarle un volumen igual de
isopropanol fro.
8. Incubar por 20 min a -20C.
9. Centrifugar a 12,000 rpm por 5 min, a 4C.
10. Eliminar el sobrenadante y para lavar el DNA aadir 1 mL de etanol al 70% y
centrifugar a 12,000 rpm durante 5 min.
11. Remover el sobrenadante por decantacin y eliminar el etanol residual por
evaporacin a temperatura ambiente (aproximadamente 5 a 10 min).
12. Resuspender el DNA en 30 L de agua estril, guardar a 20C.
Nota. Se recomienda cuantificar el DNA por su absorbancia a 260 nm. Obtener los
g/mL considerando que una unidad de A260 nm de DNA de doble cadena es igual a 50
g/mL.
Investiga:
El fundamento de la determinacin espectroscpica a 260 nm de la concentracin de
cidos nucleicos.

0141 BIOQUIMICA EXPERIMENTAL

5mL
Medio LB +
Kanamicina

Inocular

Clulas transformantes

Incubar a 37 0C / agitacin durante 12- 16 h

a. Tomar 1.5 mL del cultivo
y centrifugar
b. Eliminar el sobrenadante
Repetir a. y b. en el mismo tubo con el resto del cultivo
Eliminar el sobrenadante
Resuspender el paquete celular con sol. GTE fra.
Agitar e incubar por 1 a 5 min a Tamb
Adicionar sol. de lisis

Mezclar por inversin (no agitar).

Incubar en hielo mximo 5 min.
Adicionar sol. de acetato de potasio fra

Mezclar por inversin (no agitar).

Incubar en hielo mximo 5 min.
Centrifugar y tomar el sobrenadante
Eliminar el sobrenadante

Adicionar isopropanol fro (v/v)

Incubar en hielo por 20 min y centrifugar.

Eliminar el sobrenadante

Aadir etanol al 70%, agitar en vrtex

Centrifugar

Eliminar sobrenadante por decantacin y

eliminar el etanol residual por evaporacin

Resuspender el DNA en 30 L de agua estril.

5 a 10 uL para la cuantificacin Cuantificar cidos nucleicos (relacin Abs260 nm / Abs 280 nm).

Figura 4.5. Protocolo de obtencin de DNA plasmdico a partir de las clulas

transformantes que se obtuvieron en la prctica anterior.
9

0141 BIOQUIMICA EXPERIMENTAL

Cuestionario
1. Cules son las propiedades del DNA plasmdico que nos permiten separarlo del DNA
cromosomal o genmico?
2. Explica por qu se usa NaOH, SDS, acetato de potasio y etanol en la purificacin de
plsmidos.
3. Cules son los principales contaminantes de una preparacin de plsmidos?
4. Cmo los eliminas?
5. Cules son los usos que se le dan a los plsmidos una vez purificados?
6. Cules son los mtodos utilizados para cuantificar los cidos nucleicos?
7. Qu experimento realizaras para determinar si el plsmido que obtuviste se
encuentra puro?
8. Porqu a veces es necesario utilizar RNAasa para visualizar el DNA plasmdico?
9. Busca el factor de conversin de pares de bases a nmero de aminocidos y de
nmero de aminocidos a peso molecular de protena en kDa.

Referencias
Tmmler B y Mekus F. Genomic DNA: Purification. Encyclopedia of life sciences &
2005, John Wiley & Sons, Ltd. www.els.net.
Stryer L. Bioquimica, 2004, Ed.Revert, pp.745-773.
Watson JD, Gilman M, Witkowski JA, Zoller M. Recombinant DNA. Segunda edicin,
WH Freeman.

10

0141 BIOQUIMICA EXPERIMENTAL

TRANSFERENCIA DE MATERIAL GENTICO II:

ENSAYOS DE RESTRICCIN DE PLSMIDO.
Objetivos
Conocer el principio de separacin y deteccin de cidos nucleicos en geles de
agarosa.
Emplear la electroforesis en geles de agarosa para visualizar cidos nucleicos.
Determinar el tamao de fragmentos de cidos nucleicos separados en geles de
agarosa.
Conocer la utilidad de las enzimas de restriccin en la transformacin gentica y la
biotecnologa.
Introduccin
Las endonucleasas de restriccin o tipo II se caracterizan por su habilidad para reconocer
una secuencia usualmente de 4 a 6 pares de bases (pb) y cortarla especficamente en
ambas cadenas de la molcula de DNA. Si bien existen tres tipos de endonucleasas con
caractersticas de reconocimiento y de corte del DNA distintas, son las del tipo II son las que
se utilizan en biologa molecular, debido a que son capaces de cortar directamente la
secuencia que reconocen y a que no modifican la secuencia blanco. Las endonucleasas se
denominan enzimas de restriccin, debido a que es la forma de defensa de las bacterias
contra la invasin por bacterifagos, es decir, restringen la invasin por el DNA viral.
Las enzimas de restriccin generalmente reconocen secuencias palindrmicas, es decir
segmentos de DNA que se leen igual de derecha a izquierda que de izquierda a derecha.
Algunas enzimas de restriccin (EcoRI, HindIII) rompen las dos cadenas del DNA en
posiciones no simtricas del centro del palndrome y producen fragmentos con secuencias
complementarias de una cadena, denominados extremos cohesivos. Mientras que otras
enzimas (HaeIII) cortan exactamente sobre los dos ejes de simetra, produciendo extremos
romos (Figura 4.6).

EcoRI

HindIII

HaeIII

Figura 4.6. Dos diferentes formas de corte de las enzimas de restriccin en una secuencia de DNA.
Las dos primeras enzimas EcoRI y HindIII producen extremos cohesivos al cortar la secuencia que se
muestra y en el ltimo ejemplo, HaeIII produce fragmentos de DNA con extremos romos. Las
primeras 3 letras de la enzima se refieren a las iniciales del gnero y especie de la bacteria de donde
se aisl y se escribe en itlicas. Por ejemplo, EcoRI se refiere a que la enzima proviene de
Escherichia coli.

Las enzimas de restriccin son una herramienta experimental muy importante en el

desarrollo de las tcnicas para el anlisis y la manipulacin de los cidos nucleicos. Han sido
utilizadas en la eliminacin de secuencias genmicas que van desde un nucletido hasta
11

0141 BIOQUIMICA EXPERIMENTAL

cientos de bases, as como en la introduccin de secuencias ajenas a un genoma, lo que ha
permitido la produccin de protenas recombinantes.
Existen diferentes factores que afectan la reaccin de restriccin por endonucleasas. Se
inhiben usualmente con los contaminantes que se pueden encontrar en las preparaciones de
DNA, tales como otras protenas, fenol, cloroformo, etanol, EDTA, SDS y una alta
concentracin de sales. Los efectos de la contaminacin pueden disminuir si se aumenta la
cantidad de enzima aadida a la reaccin, arriba de 10 a 20 U /g DNA, incrementando el
volumen de reaccin, lo que diluye a los inhibidores potenciales, o aumentando la duracin
de la incubacin. La digestin del DNA genmico por estas enzimas puede facilitarse por la
adicin de policationes como espermidina, que acta uniendo contaminantes cargados
negativamente. Cuando un plsmido est superenrollado es necesario aadir ms enzima o
bien, desnaturalizarlo.
El tratamiento de una molcula de DNA con enzimas de restriccin permite producir
fragmentos definidos que pueden separarse mediante electroforesis horizontal. En
soluciones alcalinas, los grupos fosfato de los nucletidos se encuentran cargados
negativamente, entonces al imponer un campo elctrico, estas molculas migran hacia el
electrodo positivo o nodo. Cuando la migracin ocurre en un gel, las molculas de DNA se
separan de acuerdo a su tamao, porque las molculas pequeas se mueven ms
rpidamente a travs del poro del gel que las ms grandes.
Generalmente, un segmento de DNA contiene secuencias blanco para varias enzimas de
restriccin. Si el fragmento de DNA a analizar es lo suficientemente extenso, se puede cortar
con una o varias enzimas de restriccin, de manera individual o en mezclas. Un diagrama de
una molcula de DNA en donde se muestran los sitios de corte de las enzimas de restriccin
se denomina mapa de restriccin. El anlisis de los mapas de restriccin constituye una
importante herramienta para localizar secuencias de bases especficas en un cromosoma y
para estimar el grado de diferencias entre cromosomas relacionados.
Existen varias aplicaciones de los mapas de restriccin, como la obtencin de los patrones
de RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) utilizados en las pruebas de
paternidad, as como tambin en la identificacin de individuos a partir de evidencias
forenses como saliva, sangre, semen, cabello, etc.
En la prctica se utilizarn dos enzimas de restriccin en una mezcla. Esto se debe a que el
vector utilizado en la transformacin (Figuras 4.3 y 4.4) tiene dos sitios de restriccin para
enzimas diferentes, de manera que slo se podr liberar el fragmento de DNA de inters al
cortar por los extremos con las dos enzimas que reconocen dichos sitios.
Material biolgico
DNA plasmdico purificado de la prctica anterior.
Materiales y equipo
Recipiente para hielo
Tubos para microfuga
Gradilla para tubos de microfuga
Recipientes para teir el gel.
Micropipeta de 100-1000 L
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0141 BIOQUIMICA EXPERIMENTAL

Micropipeta de 20-200 L
Micropipeta de 0.5-10 L
Caja de puntas para micropipeta con capacidad de 10 L estriles
Caja de puntas para micropipeta con capacidad de 200 L estriles
Caja de puntas para micropipeta con capacidad de 1000 L estriles
Cmara de electroforesis horizontal
Fuente de poder
Vrtex
Horno de microondas
Microfuga
Bao de incubacin a 37C
Bao de incubacin o bloque de calentamiento a 100C
Transiluminador
Pantalla de acrlico
Cmara fotogrfica
Reactivos
NdeI. Solicitar al profesor justo antes de usarse. Se almacenan a 20C.
BamHI. Solicitar al profesor justo antes de usarse. Se almacenan a 20C.
NOTA; Las enzimas de restriccin son muy sensibles a la temperatura, mantenerlas
en fro durante su manipulacin.
Amortiguador TANGO de restriccin. Reactivo que es proporcionado por el proveedor
junto con la enzima NdeI.
TAE 1X. Ver preparacin en el apndice.
Agarosa
Amortiguador de muestra
Estndar de peso molecular. Proporcionado por el laboratorio, se utilizar de acuerdo
a las instrucciones del proveedor.
Bromuro de etidio 10 mg/mL (GIBCO BRL)
Desarrollo experimental
Ensayo de restriccin
1. Etiquetar dos tubos de microfuga.
2. Colocar en cada tubo los siguientes reactivos: 10 L de plsmido y 1 L de
Amortiguador Tango10X
3. Incubar a 100C por 5 min.
4. Transferir al recipiente con hielo e incubar por 5 min.
5. Pasado el tiempo de incubacin, aadir al tubo 1 nicamente una de las dos enzimas
de restriccin que fueron proporcionadas, se sugiere que un par de equipos coloque 1
L BamHI y otro par de equipos 1 L NdeI. Mezclar suavemente despus de aadir la
enzima.
6. Al tubo 2 aadir 1 L de BamHI y 1L de NdeI. Mezclar suavemente con ligeros
golpes al tubo de microfuga.
7. Centrifugar los dos tubos de microfuga por 5 segundos, para que todo el lquido se
deposite en el fondo.
8. Incubar a 37C por 1.5 h.
13

0141 BIOQUIMICA EXPERIMENTAL

9. Se sugiere aadir 0.5 l de una solucin de RNasa (1 g/mL) e incubar 30 min a 37C.
Este procedimiento eliminar el RNA y facilitar la visualizacin de los productos de la
restriccin en el gel. Otra opcin para la eliminacin del RNA es aadir 2 L de la
solucin de RNasa a los 35 mL de gel poco antes de vaciarlo a la cmara de
electroforesis, cuando est tibio.
10. Al trmino de la incubacin colocar los tubos en hielo.
11. Se recomienda que para visualizar ms ntidamente los fragmentos de la restriccin,
tomar todo el volumen usado en el ensayo de restriccin de cada tubo para correr en
un gel de agarosa.
Preparacin del gel
Se sugiere utilizar un gel por cada dos equipos y utilizar el peine para hacer 8 pozos o
carriles en el gel.
Colocar la bandeja de acrlico para hacer el gel dentro de la cmara y colocar el peine.
Preparar un gel de agarosa al 1%. Pesar 0.35 g agarosa en un matraz Erlenmeyer,
aadir 35 mL de amortiguador TAE 1X, tapar con algodn o una servitoalla. Se
calienta la mezcla en microondas por 1 a 3 min. o hasta que la agarosa se disuelva
bien.
Esperar a que la temperatura baje hasta 45-60C, aadir entonces 2 L bromuro de
etidio (MANEJAR CON GUANTES, REACTIVO MUTAGNICO) para obtener una
concentracin final de 0.5 g/mL, agitar el matraz para mezclar. O bien aadir el
reactivo SYBR Green (se recomienda usar 1 L de 10,000 SYBR Green I por cada 10
mL de gel)..
Depositar el gel en la bandeja de la cmara (Figura 4.7), evitando la formacin de
burbujas. Se deja enfriar hasta que polimerice (aproximadamente 20 min).
Quitar los acrlicos que hacen la bandeja y colocar el gel en la cmara de
electroforesis.
Aadir el amortiguador TAE en la cmara. La cmara de electroforesis se llena con
aproximadamente 275 mL de TAE 1X o hasta que se cubran los pozos.

Figura 4.7. Preparacin de un gel de agarosa. Adicin de la agarosa disuelta en TBE.

14

0141 BIOQUIMICA EXPERIMENTAL

Preparacin y cargado de las muestras.
1.
Tomar los tubos de microfuga que fueron usados en la restriccin y etiquetarlos R1,
R2. Adems marcar dos tubos ms uno como E de estndar y otro como P de plsmido
sin digerir.
2.
Aadir los reactivos como se indica en la tabla 4.1. Usar una punta de micropipeta
distinta para cada tubo, de esta manera se evita la contaminacin cruzada.
Tabla 4.1. Preparacin de muestras para aplicar en el gel de agarosa.
Estndar*
Plsmido digerido Plsmido digerido
Plsmido sin
(E)
con una enzima
con dos enzimas
digerir
(R1)
(R2)
(P)
Muestra
10
L
12
L**
13
L**
1 L DNA-HindIII
H 2O
9 L

Amortiguador de 2 L (Stop Mix)

3 L
3 L
3 L
muestra
*El estndar que se usa en el laboratorio (lambda DNA digerido con HindIII) puede calentarse a 65C por 10
min para separar las bandas de 23130 y 4361. Los pesos moleculares que deben encontrarse en el carril del
estndar son 23130, 9416, 6557, 4361, 2322, 2027 y 564 pb.
** Volumen que qued despus de realizar el ensayo de restriccin.
Reactivos

3.
4.
5.

Centrifugar por 3 segundos en microfuga, para que se mezcle y deposite el lquido en el

fondo.
Retirar el peine de la bandeja. Muy importante: los pozos del gel tienen que estar
orientados hacia el ctodo, generalmente el electrodo es de color negro.
Tomar el volumen total de cada uno de los tubos de microfuga preparados segn la
tabla 4.1 y colocar en los pozos como se muestra en la Figura 4.8.

Figura 4.8. Cargado de la muestras en los pozos del gel de agarosa.

6.
7.

8.

Una vez depositadas las muestras, colocar la tapa con los electrodos (rojo con rojo y
negro con negro) y conectar a la corriente. Aplicar 80 V por 30 a 40 min. Verificar que
las muestras migren hacia el lado positivo de la cmara.
Al concluir la electroforesis desconectar el equipo y retirar la bandeja para la
observacin de DNA (USAR GUANTES). El gel puede ser inmediatamente colocado
sobre una lmpara de luz UV para visualizar las bandas de DNA. La radiacin
ultravioleta es peligrosa, usar lentes especiales o colocar una pantalla de acrlico
entre el observador y la fuente de luz UV.
Tomar la foto del gel. Posteriormente desechar el gel en el recipiente colocado para ese
propsito, los geles sern incinerados, junto con los guantes y puntas si es que
estuvieron en contacto con el bromuro de etidio.
15

0141 BIOQUIMICA EXPERIMENTAL

Utilizando la foto, medir la distancia desde el centro del pozo hasta cada una de las
bandas de DNA detectadas. Construir la curva de estndares de peso molecular y
Estimar el tamao aproximado de cada uno de los fragmentos de DNA as como del
vector sin restringir, utilizar para ello los valores del estndar de peso molecular que
se encuentran en la parte inferior de la tabla 4.1.
9.

Analizar los resultados.

Cuestionario
1. Qu parte de la molcula de DNA le confiere la carga negativa?
2. Cul es el papel de cada componente del amortiguador de carga, en particular de los
dos colorantes que contiene?
3. Por qu el bromuro de etidio es un reactivo mutagnico?
4. A que se le denomina topoismeros?
5. En la prctica se pudieron observar topoismeros?
6. Qu peso molecular tienen los topoismeros?
7. Qu tipo de extremos producen las enzimas utilizadas en la prctica, romos o
cohesivos?
8. Cuntos fragmentos de DNA o restriccin se obtuvieron al utilizar las dos enzimas
NdeI y BamH1?
9. Cuntos fragmentos se obtuvieron al utilizar slo una de las enzimas de restriccin?
Por qu?
10. Cul fue el peso molecular del DNA liberado y del plsmido o vector?
11. Cules son las aplicaciones de rutina de las enzimas de restriccin?
Referencias

Devlin T. Biochemistry. 1992 Ed. Wiley- Liss, pp. 768-773. QP514.2

Kenneth D. Digestion of DNA with Restriction Endonucleases. Current Protocols in
Protein Science (1998) A.4I.1-A.4I.3.
Mitsis P, Exonucleases. Encyclopedia of life sciences 2001, John Wiley & Sons, Ltd.
www.els.net.
Micklos DA, Freyer GA y Crotty DA. 2003. DNA Science. A first course. 2ndedition.
Cold spring Harbor Laboratory Press, CSH, New York, USA. Localizacin QH442
Nelson D. Principles of Biochemistry. 2004, 4a edition Ed. Freeman and company, pp.
279-317. Localizacin QH345 L43
Sambrook J, Fritsch EF y Maniatis T. 1989. Molecular cloning. A laboratory manual.
Cold spring Harbor Laboratory. CSH, New Harbor Laboratory. CSH. New York, USA.
Voet y JG Voet. Biochemistry. Energy metabolism: Integration and organ
specialization. 2da. Ed. John Willey & Sons, INC. 1995. Pp848-914.

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0141 BIOQUIMICA EXPERIMENTAL

TRANSFERENCIA DE MATERIAL GENTICO II: INDUCCIN DE

PROTENA RECOMBINANTE.
Objetivos

Conocer el fundamento de la induccin de la sntesis de protenas recombinantes en E. coli

Realizar la induccin de una protena recombinante (-lactamasa)
Obtener la curva temporal de induccin de una protena recombinante
Interpretar el patrn electrofortico de produccin de una protena recombinante
Conocer las aplicaciones biotecnolgicas de las protenas recombinantes

Introduccin
La necesidad de producir protenas heterlogas o recombinantes para varias aplicaciones cientficas
y comerciales ha influido en el desarrollo de diversas herramientas para purificar y manipular
protenas. Los sistemas bacterianos han sido los ms utilizados para este fin, debido a que son
fcilmente manipulables genticamente, se propagan en periodos de tiempo corto, son econmicos y
se requiere slo un entrenamiento mnimo para su manejo. Adems, muchas de las caractersticas
inherentes a los sistemas bacterianos permiten la automatizacin en proyectos de produccin a gran
escala, donde se requiere la produccin y muestreo de cientos de clonas.
A pesar de lo anterior, los sistemas bacterianos tienen sus limitantes: las protenas de eucariontes o
las protenas de membrana generalmente no se expresan o no son funcionales. El carcter qumico
del citoplasma de las bacterias y de sus chaperonas (protenas que se unen a las protenas recin
sintetizadas), as como las enzimas que se encargan de las modificaciones post-traduccionales son
muy diferentes entre los organismos eucariontes. Por ejemplo, los sistemas de expresin de bacterias
no glicosilan a las protenas. Otros sistemas de expresin, como los sistemas de clulas de mamfero,
de insecto o levadura, tienen la capacidad de procesar las protenas eucariontes de manera correcta
y son utilizados cuando la funcionalidad de las protenas es crtica, aunque el costo de estos sistemas
es considerablemente ms alto y la tecnologa que se necesita es ms complicada. Adicionalmente,
la produccin de grandes cantidades de protenas, como algunos productos teraputicos, se puede
lograr tanto en plantas como en sistemas animales.
Muchas compaas ofrecen una serie de vectores con capacidades de expresin muy variadas, con o
sin protenas de fusin que funcionan como etiquetas para la deteccin y/o purificacin de la protena
deseada, la presencia de marcadores selectivos de la cepa transformante y promotores distintos.
Los vectores de expresin como el pET son usados comnmente para la expresin de protenas
heterlogas en E. coli. En los sistemas pET, los plsmidos son clonados bajo las seales de
expresin fuerte del promotor del bacteriofago T7, que controla la alta expresin de la RNA
polimerasa T7. Adicionalmente, los sistemas pET cuentan con una copia del gen cromosomal de la
RNA polimerasa T7 bajo el control del operador de la lactosa, sistema que se estudiar con ms
detalle en el siguiente protocolo experimental del curso. Basta mencionar ahora que para que se
exprese la RNA polimerasa T7 y por tanto se lleve a cabo la expresin de la protena de inters, se
tiene que introducir lactosa o un anlogo de sta, el ms utilizado es el isopropil-D tiogalactosido
(IPTG), anlogo no hidrolizable de la lactosa que sirve como un inductor artificial del opern de la
lactosa (Fig. 4.9). El IPTG se une a la protena represora, ocasionndole a la protena un cambio
conformacional que le impide su funcin biolgica de unirse al DNA. La actividad biolgica de la
protena represora es unirse a una secuencia de DNA denominada operador impidiendo, en el caso
del vector pET, la transcripcin del gen para la RNA polimerasa T7 y por tanto la transcripcin del
transgene. El efecto del IPTG de liberar de la represin del gen es denominado induccin, por lo que
el IPTG es llamado inductor. El gen que codifica a la protena represora se encuentra incluido en el
vector, LacI, y su transcripcin ocurre a la par que todos los genes incluidos en el vector (Fig. 4.9).

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0141 BIOQUIMICA EXPERIMENTAL

As, a pocas horas de induccin, la formacin de la protena deseada puede llegar a ser ms del
50% de la protena total en la clula.

Figura 4.9. Mecanismo de accin del IPTG en la expresin de protena mediada por el vector pET.
Como se mencion anteriormente, la produccin de la protena recombinante en un organismo no
relacionado puede llevar a que la protena no sea funcional, ya sea porque no presenta las
modificaciones post-traduccionales necesarias o bien porque no se pleg adecuadamente,
provocando su aglomeracin. Cuando las protenas se aglomeran formando agregados que slo
pueden solubilizarse a travs del uso de soluciones de detergentes, se dice que forman cuerpos de
inclusin. En este caso, aumentan los costos de produccin y/o recuperacin de la protena.
En la prctica se llevar a cabo el monitoreo de la induccin de la -lactamasa en clulas completas
de E. coli transformadas con el vector pET-TEM-1-ompA-lactamasa (Figura 4.4), vector que fue
producido a partir del vector pET-24a-d(+) que se mostr en la Figura 4.3.
Material biolgico por grupo
1 matraz de 150 mL con 25 mL cultivo lquido saturado de clulas transformadas de E. coli (crecidas
por 12 a 16 horas con agitacin vigorosa).
Material y equipo
1 mechero
1 recipiente para hielo
Tubos para microfuga de 0.5 mL
2 vasos de precipitados 25 mL
1 pipeta Pasteur con bulbo
Recipiente de plstico para la tincin.
Micropipeta de 2 a 10 L
Micropipeta de 20 a 200 L
Micropipeta de 200 a 1000 L
1 caja de puntas de 10 L para micropipeta
1 caja de puntas de 200 L para micropipeta
1 caja de puntas de 1000 L para micropipeta
Placas de vidrio
Peine

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0141 BIOQUIMICA EXPERIMENTAL

Separadores
Pinzas para sujetar las placas
Cmara para electroforesis
Fuente de poder
Vrtex
Incubadora a 37C con agitacin
Cmara fotogrfica
Reactivos
1 tubo de 50 mL con 15 mL de medio LB-kanamicina (30 g/mL)
100 mM IPTG
Estndar de peso molecular de protenas
8 mL de LB por grupo para ajustar a cero el espectrofotmetro.
Desarrollo experimental
Induccin de protena recombinante, -lactamasa (Figura 4.8).
1. Tomar 2.5 mL de un cultivo saturado de clulas de E. coli transformadas con el vector PETTEM-1-ompA-lactamasa, y aadirlos a 15 mL de medio LB-kanamicina. Tomar una alcuota
de 1 mL y leerla en el espectrofotmetro a 600 m contra un blanco de medio Luria (la
absorbancia debe ser menor a 0.3). Incubar los tubos con agitacin vigorosa a 37C
(colocarlos en posicin diagonal para que se mezcle bien el medio). El cultivo celular debe
llegar a una absorbancia entre 0.6 a 0.8.
2. Para verificar que se lleg a la absorbancia indicada, tomar una alcuota de 1 mL y leerla en el
espectrofotmetro a 600 m contra un blanco de medio Luria. Si an no llega, volver a incubar
el matraz con agitacin vigorosa.
3. Al llegar a la absorbancia apropiada, tomar una alcuota a la que llamaremos tiempo 0
(mantener en hielo el tubo de microfuga).
4. Agregar el IPTG para tener una concentracin final en el tubo de 0.5 mM. El volumen del
medio con clulas puede variar, dependiendo del nmero de alcuotas que se hayan tomado
para determinar que la absorbancia corresponde a 0.6-0.8. Hacer el clculo tomando en
cuenta el volumen final de medio con clulas.
5. Incubar nuevamente a 37C con agitacin horizontal y tomar alcuotas de 1 mL cada 30 min
por 1.5 o 2 h.
6. Guardar todas las alcuotas en tubos de microfuga a 4C.
Preparacin de un gel de poliacrilamida-SDS
Durante el tiempo de incubacin e induccin de la protena recombinante, preparar un gel de
poliacrilamida-SDS por cada dos equipos, utilizar un peine que genera 10 carriles o pozos. Las
instrucciones de elaboracin se encuentran en la seccin II, parte III del manual. O bien realizar
los geles y la corrida de las muestras en otra sesin de laboratorio.
Preparacin de las muestras y separacin en un gel de poliacrilamida-SDS
1. Tomar 15 L de cada una de las alcuotas que fueron recolectadas y mezclarlos con 10 L de
amortiguador de muestra en un tubo de microfuga. Hacer una mezcla apropiada de
estndares de peso molecular (se sugiere 7 L de los estndares de peso molecular ms 18
L de amortiguador de muestra).
2. Ensamblar el gel en la cmara de electroforesis.
3. Aplicar las muestras en el gel.
4. Iniciar la electroforesis aplicando una corriente de 10 a 15 mA y hasta que el frente del
colorante haya entrado en el gel separador. Despus incrementar el amperaje a 25 mA,
siempre y cuando no se caliente el gel.
5. Terminar la corrida una vez que el frente haya alcanzado el borde inferior del gel.

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6. Enseguida desprender el gel de las placas y realizar la tincin depositando el gel en una
charola que contenga solucin teidora y colocando la bandeja en agitacin constante.
7. Decantar la solucin teidora, lavar el exceso con H2O destilada y aadir la solucin
desteidora. Poner a agitar suavemente.
8. Tomar la foto del gel.
9. Analizar los resultados. La protena tiene un peso molecular aproximado de 32 kDa si tiene el
pptido seal de la protena ompA y de 29 kDa sin pptido seal.

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0141 BIOQUIMICA EXPERIMENTAL

1.5 ml
Medio LB-kanamicina

Incubar a 370C / agitacin vigorosa

durante 2 h

Clulas del cultivo saturado

Leer a 600 m
hasta obtener 0.6-0.8 Abs.
Agregar__________L 100mM IPTG
(concentracin final 0.5 mM)

1 mL
t=0

Incubar a 37 0C / agitacin.
Tomar una alcuota cada 30 min

t=0

1 mL
t = 30 min

1 mL
t = 60 min

1 mL
t = 90 min

1 mL
t = 120 min

Elegir entre incubar

hasta 90 o 120 min,
ya que slo hay 5
pozos disponibles por
equipo. Recordar que
uno de los pozos
contendr el estndar
de peso molecular.

Aplicar 4 de las fracciones a un gel de poliacrilamida-SDS.

Figura 4.10. Proceso de induccin de protena recombinante en E. coli.

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0141 BIOQUIMICA EXPERIMENTAL

Cuestionario
1. Menciona las diferencias entre las clulas de E. coli DH5 y las clulas E. coli BL21
2. Qu es una protena recombinante?
3. Por qu el cultivo de clulas debe de llegar a una densidad ptica de 0.6 a 0.8 antes de
comenzar el proceso de induccin de la protena recombinante?
4. Cul fue el tiempo en el que se produjo la mxima cantidad de protena recombinante?
5. Qu otros parmetros se podran modificar para obtener un mayor rendimiento de la
protena?
6. Qu son los cuerpos de inclusin?
7. Qu experimento realizaras para determinar si la protena se encuentra en forma soluble o
en forma agregada?
8. Qu mtodo propondras para purificar a la protena recombinante obtenida?
9. Describe tres ejemplos de protenas recombinantes que se producen actualmente de manera
comercial, explicando sus usos.
Referencias
Ghrayeb J, Kimura H, Takahara M, Hsiung H, Masui Y, Inouye M. 1984. Secretion cloning
vectors in Escherichia coli. The EMBO Journal 3, 2437-2442.
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biotechnology education 1995. http://www.reading.ac.uk/NCBE.
LaVallie E. 1995. Production of recombinant proteins in Escherichia coli. Current Protocols in
Protein Science 5.1.1-5.1.8.
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spring Harbor Laboratory. CSH, New Harbor Laboratory. CSH. New York, USA.
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Voet y JG Voet. Biochemistry. Energy metabolism: Integration and organ specialization. 2da.
Ed. John Willey & Sons, INC. 1995. Pp906-914.

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