BACs, YACs, HACs, Ti vector, BAKTERIOFAGA dan COSMID SEBAGAI

VEKTOR DNA
A. BACs
BACs atau Bacterial Artificial Chromosome merupakan vektor DNA yang
dikonstruksi dari E.coli F factor ( farktor fertilitas plasmid), yangmana
secara normal hadir pada satu atau dua replika per sel. Mereka dapat
menerima sisipan gen hingga

300kb dan dapat secara langsung

diperkenalkan pada strain deoR pada E.coli dengan menggunakan

elektroforasi,

yang

menolak

penggunaan

pengemasan

ekstrak.

Stabilitasnya dan kemudahan kloning DNA dapat disiapkan secara

sederhana untuk analisis, atau end sequencing, membuat BACs dan PI
artificial chromosome (PACs) menjadi vektor yang paling banyak dipilih
untuk hampir semua pustaka genom.
BACs mrupakan alat penting untuk memetakan dan analisis dari genom
eukariot yang kompleks. Plasmid memiliki ukuran 100kb dan memiliki
jumlah replikasi yang sangat sedikit di host. BACs hanya sebesar 7,4kb
(termasuk replikasi ori, sisi kloning, dan marker) dan demikiannya dapat
mengakomodasi DNA yang berukuran besar.
B. HACs
Dengan tujuan membuat galur sel transgenik mamalia yang stabil, para
peneliti telah mengembangkan Mammalian artificial chromosome (MACs)
dan Human artificial chromosome (HACs). Pengembangan ini telah
dicapai pada tahun 1997 ketika Harrington

et al. (1997) melaporkan

konstruksi dan pengaturan dalam galur sel manusia dari human artificial
chromosome yang mengandung 0,3-2mb dari sisipan DNA satelit-.
Memiliki sekuen sentomerik yang dapat menginisiasi replikasi DNA, dan
sekuens telomerik. Pengembangannya mempertimbangkan kemajuan
penting dalam biteknologi hewan dan terapi gen manusia untuk 2 alasan
untama. Pertama, mereka melibatkan replikasi autonom dan segregasi di
sel mamalia, yang bertentangan pada integrasi tak teratur kedalam
kromosom (sebagai vektor lainnya). Kedua, mereka dapat dimodifikasi

untuk penggunaanya sebagai sistem ekspresi dari gen yang besar,

termasuk tidak hanya daerah pengkode tetapi seluruh pengatur elemen.
Latar belakang utama pembatasan aplikasi dari HACs pada saat ini,
bagaimanapun, adalah karena mereka sulit untuk dihandle karena ukuran
mereka yang besar dan dapat diperbaiki hanya dengan kuantitas yang
kecil. Dua prosedur prinsp ada pada generasi MACs dan HACs. Pada
metode pertama, fragmentasi telomer langsung dari kromosom natural
digunakan. Contohnya, HACs yang diderivat dari kromosom 21
menggunakan metode ini. Metode lain melibatkan perakitan de novo dari
centomeric, telomeric yang di klon, dan replikasi ori in vitro.
C. Bakteriofaga
Bakteriofaga merupakan virus yang secara spesifik menginfeksi bakteri.
Faga memiliki struktur; DNA atau RNA yang membawa gen termasuk
beberapa untuk replikasi faga, yang dikelilingi capsid yang terbuat dari
molekul protein.
Bakteriofaga lambda () telah banyak digunakan dalam DNA
rekombinan semenjak rekayasa dari kloning vektor virus pertama pada
1974. Faga khususnya digunakan untuk mempersiapkan pustaka genom,
dikarenakan mereka dapat menyimpan bagian DNA yang lebih besar
dibandingkan dengan plasmid. Telah banyak varian dari vektor ini. Insersi
vektor memiliki sisi endonuklease restriksi unik yang memperbolehkan
kloning dari fragmen DNA kecil pada penambahan ke genom faga . Ini
sering

digunakan

untuk

mempreparasi

pustaka

ekspresi

cDNA.

Penggantian vektor telah memasangkan sisi koning dia atas ssi lain dari
cluster sentral gen. Sentral cluster ini berisi gen gen untuk lisogenik dan
rekombinasi, yangmana tidak diperlukan untuk siklus litik. Cluster sentral
gen dapat dihilangkan dan DNA asing disisipkan diantara arms (tangan).
Semua vektor faga digunakan sebagai vektor kloning yang telah
dihilangkan tangannya untuk keamanan dan hanya bisa berfungsi di
kondisi laboratorium khusus.

Rekombinan partikel virus yang menginfeksi sel host bakteri, dalam

prosesnya dinamakan transduksi. Sel host lisis setelah faga bereproduksi
melepaskan partikel virus patogen. Partikel virus tampak sebagai spot
bening pada bakteria yang dilisis atau plak di agar yang mengandung
pembunuh bakterinya. Masing masing plak mewakili pirogen dari setiap
rekombinan faga dan mengandung jutaan partikel rekombinan faga.
Hampir semua vektor kontemporer membawa gen lacZ, yang akan
memberikan skrining biru-putih.
Memiliki 48kb linear double-stranded genom, dengan 12-basa ujung
kohesif pada tiap ujung 5nya, didalam kepala protein isocahedral yang
ditempeli tail nonkontraktil yang panjang. Infeksi terjadi sebagai hasil dari
pengikatan tail ke reseptor maltosa di membran terluar dan injeksi dari
genom faga melewati tail dan ke dalam sel. Sekali berada di dalam sel,
DNA dapat mengikuti siklus lisogenik tergantung pada lingkungan atau
kondisi intraselular dan genotip dari masing masing faga. Di dalam siklus
lisogenik,,

DNA

faga

berintegrasi

didalam

genom

E.coli

yang

menyediakan genetisis dengan alat untuk mengintegrasikan DNA menjadi

DNA genomik. Dalam siklus lisis, DNA direplikasi dibawah mekanisme
berputar untuk memproduksi concatemer panjang sekitar 100 unit lambda
genom. Gen lambda mengkode kepala dan tail protein dan enzim ang
mengenali sisi kohesif dan memotong concatemer menjadi genom
individual. Secara subsekuen tiap 48kb unit dikemas menjadi kepala
lambda, tail menempel dan sel yang terinfeksi lisis untuk melepaskan kirakira 100 faga terinfeksi. Untuk dapat dikemas, sisi kohesif butuh sekitas
38-52kb bagian dan vektor lambda berbeda telah diproduksi dimana
daerah yang tidak diperlukan dibuang untuk membuat ruang DNA insersi.
Berikut beberapa keuntungan menggunakan vektor lambda:

Proses pengemasan dan infeksi sangat efisien(mungkin 100kali

lebih efisien dibandingkan transformsi/transfeksi)

Sejak sel megalami kematian karena lisis, lambda dapat mengatur

beberapa insersi yang membawa sekuens yang sitotoksis atau
tidak stabil, rendah toleransinya.

M13 Bakteriofaga merupakan bakteriofaga filamen dengan genom

sebesar 6,4kb single-strand yang menginfeksi E.coli. sel yang terinfeksi
memproduksi 100-200 double-stranded ( atau dalam bentuk replikasinya)
copies dari genom faga. Kode gen ini mengkoordinasi pengemasan
salahsatu dari strands DNA genom faga menjadi jaket virus berprotein dan
ekstruksinya dari sel dimana mereka akan bebas dan dapat menginfeksi sel
lainnya. rangkaian kloning vektor yang berbasis M13 telah dikembangkan
dan ditemukan dapat menerima insersi beberapa kali lebih besar
dibandingkan dengan genomnya sendiri. Bagaimanapun DNA dalam M13
dapat menjadi tidak stabil dan ukuran insersi secara normal disimpan di
bawahnya dan sistem ini tidak digunakan untuk pngaturan DNA jangka
panjang. M13 tidak memiliki marker selektif; tetapi sel yang terinfeksi
dapat diidentifikasi meggunakan kemampuannya membentuk zona bening
atau plak. Jika sel bakteri dicampur di agar dan dibiarkan tumbuh maka
akan terjadi kekeruhan. Sel yang terinfeksi tumbuh lebih lambat dan dapat
dilihat sebagai plak di pembunuh bakterinya. Sejak faga mengandung
DNA strands khusus, sistem ini terlah dibuktikan sangat berguna untuk
tekhnik yang menggunakan template single stranded seperti sequencing,
sisi langsung mutagenesis dan produksi radiolabel probe DNA untuk
hibridisasi.

Cara untuk melakukan DNA rekombinasi bakteriofaga;

ringkasan

sifat

dari

vektor

DNA

yang

digunakan: