You are on page 1of 21

MAKALAH REKAYASA GENETIK

Teknik Kloning Sederhana dan Vektor- Vektor untuk


Eschericia Coli

Disusun Oleh:
KELOMPOK 10
Fitrah Humala Harahap (1206212376)
Maylina Chandra Puspita (1206212451)
Ranee Devina Rusli Putri (1206212483)
Sri Dwi Aryani(1206212395)
Vifki Leondo (1206238665)

DEPARTEMEN TEKNIK KIMIA


FAKULTAS TEKNIK UNIVERSITAS INDONESIA
DEPOK
2014

ABSTRAK

Apoptin merupakan protein yang bertugas menginduksi apoptosis dan diperoleh


dari Chicken anemia virus (CAV). Tahap pertama yang dilakukan untuk melakukan
cloning apoptin adalah mengetahui sekuens dari apoptin tersebut. Setelah sekuens
DNA dari apoptin telah diketahui, purifikasi dapat dilakukan. Tahap selanjutnya
adalah melakukan ekstraksi DNA Virus CAV dengan phenol chloroform, kemudian
melakukan amplifikasi DNA CAV menggunakan PCR-style untuk menentukan posisi
gen dari apoptin. Gen apoptin yang telah diisolasi kemudian ditambahkan 12 histidin
pada ujung C-terminal dan 8 arginin pada ujung N-terminal. Penambahan histidin
bertujuan untuk mempermudah proses purifikasi, sedangkan penambahan arginin
bertujuan untuk mempermudah penetrasi sel. Penambahan histidin dan arginin
dilakukan dengan menggunakan teknik PCR hard copy.
Selain mempersiapkan apoptin yang akan di cloning, perlu juga mempersiapkan
vector sebelum dilakukan transformasi. Dalam hal ini, plasmid pUC19 dipilih sebagai
vector karena dapat dengan mudah dibedakan dari non rekombinannya berdasarkan
perbedaan warna koloni pada media pertumbuhan. Kemudian, penyisipan insert gen
apoptin yang telah dimodifikasi ujung-ujungnya dengan menggunakan 12 histidin
pada C-terminalnya dan 8 arginin pada N-terminalnya ke dalam vektor plasmid
dengan cara meligasinya. Setelah ligase apoptin pada plasmid vector berhasil,
plasmid tersebut ditransformasikan ke dalam bakteri E.Coli dengan teknik
elektroporasi. Tahap terakhir yang dilakukan adalah memastikan keberhasilan dari
transformasi, yaitu dengan screening atau seleksi white blue

BAB I
PENDAHULUAN

1.1. Latar Belakang


Kloning

merupakan

proses

perbanyakan

fragmen

gen

target

dengan

mengintroduksi DNA rekombinan ke dalam suatu inang. Disamping banyaknya


kontroversi mengenai kloning, kloning gen memberikan manfaat yang sangat besar
dalam bidang teknologi. Proses kloning gen dapat menghasilkan protein penting
dalam jumlah besar, khususnya protein- protein yang penting untuk terapi dan obat.
Banyak penelitian telah dilakukan untuk memanfaatkan proses ini untuk mengobati
penyakit kanker. Kanker merupakan penyakit yang terjadi akibat pertumbuhan tidak
normal dari sel- sel jaringan tubuh yang berubah menjadi sel kanker. Penyakit ini
banyak terjadi pada masyarakat dan dan dapat menyebabkan kematian.
Apoptin merupakan protein yang mampu menginduksi apoptosis sel- sel
ganas tanpa mengganggu sel normal. Karena kemampuannya inilah, banyak usaha
dilakukan untuk mengklon gen apoptin pada CAV (Chicken Anemia Virus) dengan
inangnya berupa bakteri E.Coli. Dalam makalah ini, akan dibahas tahap kloning
sederhana apoptin pada E.Coli, yang dimulai dengan pemurnian gen CAV dari sampel
hati ayam yang terinfeksi CAV, hingga tahap screening white-blue untuk menentukan
keberhasilan transformasi.
1.2. Tujuan Penulisan
Tujuan penyusunan makalah ini ialah mengetahui proses kloning sederhana gen
apoptin dalam bakteri Eschericia coli dengan menambahkan 12 histidin pada ujung Cterminal apoptin, dan 8 arginin pada N-terminal apoptin.
1.3. Perumusan Masalah
Rumusan masalah pada makalah ini antara lain:

Bagaimana teknik isolasi gen apoptin dari sumbernya?

Langkah apa saja yang dilakukan untuk memodifikasi gen apoptin?

Apakah plasmid yang digunakan sebagai vektor dalam kloning gen apoptin?

Bagaimana menyisipkan gen apoptin yang telah dimodifikasi ke dalam vektor


plasmid?

Bagaimana teknik transformasi gen apoptin ke dalam E.coli


2

Teknik screening apakah yang digunakan untuk menentukan keberhasilan


transformasi gen apoptin dalam E.coli?

1.4. Metode Penulisan


Makalah ini disusun berdasarkan sumber- sumber yang terdapat pada buku,
jurnal, artikel serta informasi lainnya yang berasal dari internet. Sumber- sumber
tersebut dilampirkan penulis pada bagian daftar pustaka. Data- data yang diperoleh
telah dianalisis untuk mendukung topik yang dibahas pada makalah ini, yaitu teknik
kloning sederhana dan vektor- vektor untuk Eschericia coli.
Kata kunci: kloning, CAV (Chicken Anemia Virus), plasmid, apoptin, histidin, arginin,
E.coli, Screening, White- Blue.

BAB II
ISI

2.1 Definisi Apoptin


Apoptin merupakan protein yang bertugas menginduksi apoptosis dan diperoleh
dari Chicken anemia virus (CAV), yang termasuk genus Gyrovirus, dan famili
Circoviridae, berisi sebuah minus-strand DNA sirkular. Apoptin dapat menginduksi
apoptosis sel ganas dari burung, tikus, dan manusia yang terserang carcinoma,
sarcoma, melanoma, lymphoma, dan kanker darah, tanpa mengenai sel target
normal. (Leliveld dkk, 2003).
Apoptin mengandung 121 macam asam amino dan terdeteksi pada 14 kDa, dan
merupakan protein virus nonstructural yang dikodekan sebagai virus VP3 (Noteborn,
2004). Karena kemampuannya untuk menginduksi apoptosis (proses matinya sel),
apoptin berpotensi untuk aplikasi medis, yaitu mengobati kanker. Hal ini dikarenakan
protein ini dapat mengenali sel normal manusia yang terkena kanker, dan
menginduksi agar terjadi apoptosis ketika proses berlangsung tanpa menginduksi sel
normal (Danen Van Oorschot dkk, 1997).
2.2 Sekuens Apoptin

Ujung C- terminal Apoptin mempunyai bipartite nuclear localization sequence


(NLS): NLS1 mempunyai rentang asam amino 82-88, dan NLS2 rentang asam amino
111-121, serta putative nuclear export sequence (NES) pada rentang asam amino
97-105, seperti pada gambar 1. NLS1, NLS 2, dan NES merupakan sekuens yang
digunakan apoptin untuk keluar dan masuk nukleus. Terdapat suatu peragangan
pada apoptin yang kaya akan leusin (aa 34-46). Peregangan leusin berfungsi
sebagai pengikatan protein promyelocytic leukimia. Hal ini menunjukkan bahwa
bentuk aktif biologi dari rekombinan apoptin dapat membentuk pengikatan globular
multimer yang terdiri dari 30-40 monomer yang berikatan secara non-kovalen.
Formasi kompleks multimer dapat dilakukan melalui interaksi dengan prolin di Nterminus (aa 1-69).

Gambar 1. Struktur Primer Apoptin. Daerah kunci, dan sekuens penting telah ditandai. Bagian
bawah menunjukkan sekuens apoptin (UniProtKB/Swiss-Prot entry P54094). Sumber: Los,
Marek; dkk. (2009). Apoptin, a tumor-selective killer. Biochimica et Biophysica Acta 1793 (2009)
1335-1352.

C-terminal pada setiap monomer mengandung NLS dengan situs fosforilasi (Thr
108) yang dapat melakukan interaksi dengan protein lain dan pemodifikasian oleh
kinase. Mikroinjeksi multimer Apoptin ke dalam sitoplasma sel tumor menunjukkan
bahwa kompleks apoptin dapat melakukan translokasi ke nukleus.
Bentuk apoptin sangat stabil, multimerik aktif biologis kompleks terdiri dari 30-40
monomer dan nukleoprotein kompleks tingkat tinggi dengan konformasi DNA
ditemukan dominan dalam aktif transkripsional, replikasi dan DNA rusak. Karena itu,
apoptin mungkin dapat memicu apoptosis dengan menginterferensi transkripsi dan
sintesis DNA. (Leliveld dkk, 2003). Struktur NLS dalam terminal C berperan penting
bagi apoptin untuk keluar masuk nukleus ketika proses apoptosis. Sedangkan
penyisipan tag pada terminal C tidak mempengaruhi aktivitas antikanker dari apoptin,
karena itu, penyisipan tag dilakukan pada terminal C (Yan dkk, 2010).
Mekanisme kerja apoptin terdiri dari:

Apoptin bekerja dengan PI3K, sehingga menyebabkan nuclear translocation


Akt

Akt mengaktivasi CDK2 dengan cara langsung maupun tidak (degradasi p27)

Pada nukleus, apoptin bekerja dengan DEDAF, Nmi, APC/C, dan PML

Pada sitoplasma, Nur77 mengatur protein Bcl-2 dari molekul anti-apoptosis


menjadi proapoptosis

2.3 Purifikasi Apoptin

Pemurnian protein adah proses mengisolasi satu jenis protein dari campuran
kompleks. Tahapan ini sangat penting untuk karakterisasi fungsi, struktur dan
interaksi protein yang diteliti.

2.3.1

Ekstraksi DNA Virus CAV

Metode yang digunakan untuk ekstraksi DNA Virus CAV ialah PhenolChloroform karena walaupun memakan waktu yang lebih lama, dapat diperoleh DNA
yang lebih murni. Pada proses ekstraksi fenol-kloroform, akan dibutuhkan sampel
hati ayam yang telah terinveksi virus (karena virus CAV terdapat didalamnya).
Terdapat tiga jenis buffer yang dapat digunakan dalam ekstraksi, antara lain:

Buffer ekstraksi 1

: 100mM Tris-HCl pH 8, 5mM EDTA

pH 8, 100mM Tris-HCl dan 0,5% SDS pH 7

Buffer ekstraksi 2 (Bello)

: 50 mM Tris-HCl pH 8, 20mM EDTA,

2% SDS, 175g/ml Proteinase K

Buffer ekstraksi 3 (Khosravinia) : 5M NaCl, 1M Tris pH 8, 0,5M EDTA,


10% SDS, 3 g/ml Proteinase K

Gambar 2. Tahapan ekstraksi dengan metode PCE (Phenol-Chloroform


Extraction). Sumber: (http://artikel.dikti.go.id/index.php)

Sentrifugasi merupakan suatu cara pemisahan yang berdasarkan perbedaan


kecepatan sedimentasi dari partikel- partikel molekul yang disebabkan oleh adanya
gaya sentrifugal. Penambahan etanol ditunjukkan untuk mengendapkan DNA, karena
DNA memiliki sifat yang sangat polar akibat muatan yang dimiliki struktur fosfatnya.
Etanol yang memiliki sifat tidak polar dapat menyebabkan adanya atraksi elektrik
antara gugus fosfat dan ion positif yang ada dalam larutan sampel sehingga
membentuk ikatan ion dan mengendapkan DNA. Ion yang nantinya berikatan dengan
DNA untuk diendapkan adalah ion natrium yang berasal dari natrium asetat.
Setelah melalui tahapan pemurnian tersebut, sampel telah mengandung DNA
virus CAV murni untuk kemudian dilakukan tahapan berikutnya. Hasil ekstraksi DNA
dengan ketiga jenis buffer ini kemudian dielektroforesis dalam gel agarosa (1% TBE
buffer) selama 23 menit pada tegangan 100 volt.

2.3.2

Menentukan Posisi Gen Apoptin

Penentuan posisi gen apoptin dilakukan dengan mengamplifikasi DNA CAV


menggunakan metode PCR-cycle, dan dilanjutkan dengan sekuensing DNA
menggunakan metode Sanger. Langkah- langkah menentukan posisi gen apoptin
ialah sebagai berikut:

Mencampurkan DNA yang akan disekuensing (Template DNA), DNA primer,


DNA polimerase, dan 4 nukleotida.

Tambahkan nukleotida jenis kedua, yang disebut dideoxynuclotides dan


akan dikenali oleh DNA sequencer.

Ketika suhu dinaikkan menjadi 96 0C, Template DNA akan terpecah, lalu suhu
diturunkan menjadi 500C, dan primer akan menempel

Suhu

dinaikkan

menjadi

60 0C,

dan

enzim

DNA

polimerase

akan

menempelkan nukleotida yang komplementer terhadap template hingga


didNTPs menempel

Ketika didNTP menempel, maka sintesis berhenti. Karena terdapat banyak


sekali molekul DNA , maka akan dihasilkan banyak untai dengan panjang
berbeda

Hasil reaksi sekuensing dipindahkan ke polyacrylamide gel, dan gel


diletakkan pada DNA sequencer untuk dielektroforesis, dan dianalisis

Fragmennya akan berpindah sesuai ukurannya, molekul DNA yang kecil


dapat dengan mudah melewati gel, dan bergerak lebih cepat dibanding
molekul lebih besar.

Setiap didNTPs akan menghasilkan warna yang berbeda. Akhirnya akan


menghasilkan electropherogram

2.4 Modifikasi Gen Apoptin


Gen apoptin yang telah diisolasi kemudian ditambahkan 12 histidin pada ujung
C-terminal dan 8 arginin pada ujung N-terminal. Penambahan histidin bertujuan untuk
mempermudah proses purifikasi, sedangkan penambahan arginin bertujuan untuk
mempermudah penetrasi sel. Penambahan histidin dan arginin dilakukan dengan
menggunakan teknik PCR hard copy. Teknik PCR hard copy dilakukan jika situs
restriksi yang cocok tidak ada dalam sekuens DNA yang akan diamplifikasi. Teknik ini
dilakukan dengan cara memasukkan sekuen yang mengandung situs pengenalan
enzim restriksi pada ujung primer ketika mereka disintesis. Primer akan anneal ke
DNA target, dengan situs restriksi sekuens terikat, seperti yang ditunjukkan pada
gambae dibawah ini. Molekul-molekul antara yang terbentuk akan memiliki situs
restriksi di satu ujung dan semua target molekul DNA panjang akan memiliki situs di
kedua ujungnya. Molekul amplifikasi kemudian dapat dipotong di ujungnya dengan
enzim yang sesuai dan fragmen dikloning dengan cara yang biasa. Untuk pembuatan
primer, primer tidak perlu cocok semuanya, yang terpenting adalah cocok pada bagian
ujung 3 agar template bisa tercetak dengan sempurna. Setelah kodon tersebut
barulah ditambahkan 12 kodon pengkode histidin untuk C-terminal atau 8 kodon
pengkode arginin untuk N-terminal. Kodon pengkode arginin dan histidin dapat dilihat
pada tabel dibawah ini.
Tabel 1. Kode Genetik
(sumber : http://gurungeblog.files.wordpress.com/2008/11/kode-genetika.png)

Gambar 3. Mekanisme Hard Copy PCR. Sumber: (C. J. Howe. 2007. Gene Cloning and Manipulation,
Second Edition. Inggris : Cambridge University Press.)

2.5 Pemilihan plasmid pUC19 sebagai vektor dalam teknik kloning gen apoptin

Vektor pUC19 merupakan vektor yang memiki circular double stranded DNA dan
mempunyai 2686 pasang basa. Vektor pUC19 adalah salah satu molekul vektor yang
paling banyak digunakan sebagai rekombinan atau pengenalan DNA asing karena
dapat dengan mudah dibedakan dari non rekombinannya berdasarkan perbedaan
warna koloni pada media pertumbuhan.

Gambar 4. Mapping Plasmid pUC19


(sumber:https://www.neb.com/~/media/Catalog/AllProducts/5BAF764370244182844C8611046
ABCFC/Long%20Description/pUC19_map.jpg)

Pemilihan vektor yang akan digunakan didasarkan pada pertimbangan panjang


gen yang akan diligasi serta host yang akan digunakan. Dari beberapa laporan
penelitian vektor plasmid pUC19 memberikan hasil yang memuaskan pada
pembuatan pustaka DNA dengan panjang gen < 2686 bp. Vektor ini dapat tumbuh
pada host strain E.coli DH5 (Hanahan, 1983; Yanisch-Perron et al.,1985; Liu dan Niu,
2008). Plasmid ini sangat mudah ditransfeksikan kedalam E coli dengan metode yang
sederhana dan relatif murah (seperti heat shock) serta dapat dengan cepat
bereplikasi. Vektor ini sangatmudah diseleksi dengan metode white/blue color
selection (Yanisch-Perron, 1985; Chung, et al., 1989). Vektor pUC19 digunakan
karena memenuhi beberapa syarat vektor yang baik dalam teknik kloning sederhana,
antara lain:
a.

Memiliki origin of replication, sebagai syarat replikasi. Vektor pUC19 memiliki


yang oriV. Sekuens oriV untuk setiap spesies akan memiliki sedikit perbedaaan.
Ori untuk vektor pUC19 adalah pMB1-type ColE1 origin of replication. OriV
berfungsi untuk replikasi sendiri plasmid tersebut. Vektor pUC19 memiliki jumlah
copy yang cukup tinggi yaitu lebih dari 100. Jumlah copy yang tinggi disebabkan
karena mutasi tunggal pada replicon pMB1 dan kurangnya ROP gen. ROP

10

meningkatkan afinitas RNAi untuk RNAII sehingga mengurangi tingkat kejadian


inisiasi replikasi.
b.

Mempunyai dua gen marker yang dapat menandai masuk tidaknya plasmid ke
dalam sel inangnya nanti. Gen marker yang yang ada pada vektor pUC19
adalah lac Z. Gen lac Z adalah gen yang mengkode enzim -galaktosidase yang
menghidrolisis senyawa x-gal dengan membentuk warna biru. Bila gen lac Z
disisipi oleh gen lain, maka gen lac Znya akan rusak sehingga tidak lagi
menghasilkan enzim -galaktosidase dan tidak dapat menghidrolisis senyawa 5bromo- 4- cholo- 3indolyl- - D- galactosidase (x-gal). Bakteri yang telah
ditransfer dengan plasmid dimana gen lac Xnya telah tersisipi akan membentuk
koloni warna putih, sebaliknya jika gen lac Znya belum tersisipi maka koloninya
akan berwarna biru. Vektor pUC19 resisten terhadap antibiotik ampisilin (ampR)
yang juga berperan sebagai marker.

c.

Ukuran yang sesuai, memiliki ukuran yang relatif kecil (2686 bps) dibandingkan
dengan pori dinding sel inang sehingga dapat dengan mudah melintasinya.

d.

Memiliki multiple cloning site (MCS) dalam menjalankan fungsinya. Sekuen


Multiple cloning site berada pada bagian 5 dari lacZ gene yang mengkodekan
untuk amino, bagian N terminal dari beta-galactosidase (LacZ) dari E.coli.
Daerah MCS berada dalam lacZ gene (kodon 6 7 lac Z), dimana berbagai jenis
sisi restriksi untuk beberapa enzim restriksi endonuklease.

Vektor pUC19 memiliki karakteristik yang mirip dengan pUC18 namun memiliki
perbedaan pada wilayah MCS-nya, yang berkebalikan dengan pUC19 (Gambar 5).

Gambar 5. Perbedaan pada multiple cloning site antara pUC18 dan pUC19
(sumber: Yanisch-Perron, C., et al., Improved M13 phage cloningvektors and host strains: nucleotide
sequences of the M13mp18 and pUC19 vektors, Gene, 33, 103-119, 1985.)

11

Vektor pUC19 diisolasi dari E.coli ER2272 (dam+ dcm+ EcoK M-) dengan cara
purifikasi plasmid standar. Untuk isolasi dan purifikasi plasmid terdapat 2 metode yaitu
denaturasi dengan alkali dan metode sentrifuge isopiknat dengan menggunakan
larutan CsCl yang mengandung Etidium bromida. Namun dalam pembahasan kali ini
akan digunakan metoda denaturasi dengan alkali. Untuk isolasi dan purifikasi DNA
memiliki 4 bagian penting yang meliputi pemecahan sel, penghilangan protein dan
kromosom DNA, pengambilan plasmid dan pemurnian lebih lanjut apabila dibutuhkan.
Metode denaturasi alkali dipilih karena memiliki keuntungan yaitu tidak diperlukan
presipitasi menggunakan fenol atau pelarut organik seperti kloroform untuk
menghilangkan sisa protein.
2.6 Penyisipan Insert Gen Apoptin ke dalam Vektor Plasmid

Penyisipan insert gen apoptin yang telah dimodifikasi ujung-ujungnya dengan


menggunakan 12 histidin pada C-terminalnya dan 8 arginin pada N-terminalnya ke
dalam vektor plasmid dengan cara meligasinya. Untuk menyisipkan gen apoptin
kedalam vektor plasmid dilakukan dengan penambahan alkalin fosfatase pada larutan
vektor, penambahan insert, buffer, air (pelarut) dan DNA ligase, kemudian dilakukan
inkubasi campuran larutan. Penambahan alkalin fosfatase pada larutan vektor
dilakukan sebelum dicampur dengan insert untuk menghilangkan gugus P pada 5P
sehingga menjadi 5OH (defosforilasi) sehingga dapat meminimalisasi terjadinya
kemungkinan vektor menyambung pada vektor itu sendiri atau vektor menyambung
dengan vektor lain (terjadi ligasi antar vektor). Dengan berubahnya 5P menjadi 5OH
maka yang diharapkan 3OH pada vektor akan menyambung pada 5P insert, akan
tetapi 3OH insert tidak dapat menyambung ke vektor karena 5P vektor telah berubah
menjadi

5OH sehingga terjadi nick atau celah. Celah tersebut akan tersambung

kembali setelah terjadi transformasi, karena terjadi mekanisme reparasi selular yang
menyusun kembali dupleks yang utuh.

12

Gambar 6. Penerapan perlakuan alkali fosfatase untuk mencegah resirkulasi


vektor plasmid tanpa penyisipan DNA asing. (sumber : R.W. Old., S.B. Primrose.
1989. Principles of Gene Manipulation. Blackwell Scientific Publications)

Penambahan buffer berfungsi untuk mempertahankan pH pada nilai tertentu


agar DNA tidak terdegradasi dengan penambahan bahan lainnya. Buffer yang
digunakan umumnya mengandung ATP, hal ini dikarenakan sebagian besar enzim
restriksi buffer akan bekerja jika dilengkapi dengan ATP. Penambahan buffer
disesuaikan dengan penggunaan pelarut dan enzim yang akan ditambahkan.
Umumnya pelarut yang digunakan adalah ddH2O (double-distilled water) karena dapat
melarutkan DNA atau RNA dengan baik. ddH2O adalah air yang sangat murni, lebih
murni dari aquadest ataupun air reverse osmosis karena telah melalui berbagai
macam cara pemurnian. Penambahan ddH2O adalah untuk pemurnian dan proses
vakum. Penambahan ddH2O memiliki efek positif, yaitu tidak mengandung EDTA
seperti pelarut TE Buffer (campuran antara larutan Tris-HCl dengan EDTA). EDTA
merupakan chelating agent yang dapat membentuk senyawaan kompleks dengan ion
logam seperti Mg2+dan menghambat aplikasi enzimatis. Namun, penambahan ddH2O
memiliki efek negatif yakni timbul peluang untuk berubahnya pH karena DNA dan RNA
memiliki sifat asam lemah yang dalam waktu lama dapat menyebabkan degradasi
DNA/RNA, apalagi DNase juga bekerja pada pH yang sedikit asam. Namun, hal ini
telah diantisipasi dengan penambahan buffer.
Langkah terakhir dalam melakukan ligasi adalah penambahan DNA ligase. DNA
ligase ditambahkan paling terakhir karena kondisi larutan telah disesuaikan terlebih
dahulu agar ligasi dapat berjalan efektif. DNA ligase yang umum digunakan pada
proses kloning adalah T4 DNA ligase. T4 DNA ligase adalah enzim yang dikode oleh
13

genom bakteriofag T4 dan diproduksi saat infeksi pada sel E.coli. Enzim ini digunakan
untuk metabolisme virus, replikasi, rekombinasi, perbaikan DNA, dan kloning
molekular. T4 DNA ligase dapat menutup nick diantara nukleotida yang berdekatan
dalam untai DNA dupleks. Kofaktor yang dibutuhkan oleh T4 DNA ligase adalah ATP.
Enzim T4 DNA ligase dapat digunakan untuk reaksi penyambungan blunt ended dan
sticky ended. Mekanisme reaksi katalisis oleh T4 DNA Ligase terdiri dari tiga tahapan :
E + ATP E-AMP + Ppi
E-AMP + ndsDNA E-AMPndsDNA E + AMP-ndsDNA
E + AMP-ndsDNA EAMP-ndsDNA E + dsDNA + AMP

Kofaktor akan terpecah dan membentuk kompleks enzim-AMP. Kompleks


tersebut berikatan dengan nick, yang dapat membuka gugus 5 fosfat dan 3OH dan
membentuk ikatan kovalen dalam rantai fosfodiester. Pada saat teminal terbentuk oleh
restriksi endonuklease yang membuat ujung kohesif berikatan, penggabungan
memiliki nick beberapa pasangan basa yang terpisah pada untaian yang berlawanan.
T4 DNA ligase kemudian dapat memperbaiki nick untuk membentuk dupleks yang
utuh.

Gambar 7. Mekanisme ligasi oleh T4 DNA Ligase


(sumber : R.W. Old., S.B. Primrose. 1989. Principles of Gene Manipulation. Blackwell
Scientific Publications)

14

2.7 Transformasi Gen Apoptin ke dalam E. Coli


Setelah gen apoptin berhasil disisipkan ke dalam vektor, maka langkah
selanjutnya adalah melakukan transformasi, yaitu proses pemindahan vektor ke dalam
sel inang, dalam hal ini E. Coli strain DH5 . Dari metode transformasi yang ada,
metode yang kami usulkan adalah penggunaan transformasi Heat Shock atau kejutan
panas.
Vektor puc19 hasil ligasi dicampur dengan sel DH5 kompeten bersama larutan
es CaCl2. Hal ini dapat membuat sel bakteri menjadi kompeten untuk dilewati oleh
vektor dari luar. Lalu, campuran tesebut diinkubasi selama 30 menit dalam es. Tahap
selanjutnya adalah pemberian kejutan panas. Kejutan panas (heat shock) dilakukan
selama 30 detik pada 42C, lalu diikuti dengan pendinginan selama 10 menit pada es
0 C kembali. LB lalu ditambahkan ke dalam total volume 1 ml dan kultur diinkubasi
pada suhu 37C, selama satu jam dengan pengocokan. Dengan metode perlakuan
dan kondisi operasi seperti ini, dapat meningkatkan efisiensi transformasi vektor puc19
ke dalam sel kompeten E. Coli DH5 .

Gambar 8. Pengaruh lama waktu inkubasi kejutan panas terhadap efisiensi transformasi
puc19 ke dalam DH5 . (Sumber: International Journal of Biotechnology and
Biochemistry ISSN 0973-2691 Volume 6 Number 4 (2010) pp. 561568 Research
India Publications http://www.ripublication.com/ijbb.htm)

Dari gambar 8, didapatkan informasi bahwa durasi kejutan panas yang paling
efektif dalam proses transformasi vektor pUC19 ke strain DH

adalah 30 detik.

Sementara gambar 9 menunjukan bahwa temperatur kejutan panas yang optimal


adalah pada 42C. Selanjutnya gambar 10 menunjukan bahwa perlakuan inkubasi
pendinginan pada 0 C selama 10 menit setelah proses kejutan panas merupakan
tahap paling penting karena dapat meningkatkan efisiensi transformasi yang cukup
besar.
15

Gambar 9. Pengaruh suhu inkubasi kejutan panas terhadap efisiensi transformasi puc19
ke dalam DH5 (Sumber: International Journal of Biotechnology and Biochemistry ISSN
0973-2691 Volume 6 Number 4 (2010) pp. 561568 Research India Publications
http://www.ripublication.com/ijbb.htm)

3
Gambar 10. Pengaruh suhu inkubasi pendinginan setelah perlakuan kejutan panas
terhadap efisiensi transformasi puc19 ke dalam DH5 . (Sumber: International Journal of
Biotechnology and Biochemistry ISSN 0973-2691 Volume 6 Number 4 (2010) pp. 561568
Research India Publications http://www.ripublication.com/ijbb.htm)

Setelah dilakukan proses transformasi, maka terdapat tiga kemungkinan yang


akan terjadi. Kemungkinan pertama sel inang sama sekali tidak berhasil ditransformasi
(tidak ada vektor yang masuk). Lalu, yang kedua vektor berhasil masuk tetapi tidak
16

dengan disisipi oleh gene of interest dalam kasus ini adalah gen apoptin. Lalu, yang
ketiga adalah vektor berhasil disisipi oleh gen apoptin dan berhasil masuk ke dalam
sel inang. Ketiga kemungkinan ini berhubungan dengan efisiensi transformasi yang
terjadi. Semakin tinggi efisiensi transformasinya, maka peluang vektor yang berisi gen
apoptin akan semakin banyak yang masuk ke dalam sel inangnya. Untuk menentukan
inang yang berhasil ditransformasi dan tidak, perlu ada analisis lebih lanjut, yaitu
dengan menggunakan teknik screening.
2.8 Metode Screening
Transformasi dikatakan berhasil apabila rangkaian DNA yang diintroduksikan
dapat disisipkan ke genom sel inang (bakteri), diekspresikan, dan terpelihara dalam
seluruh proses pembelahan sel berikutnya. Seleksi bakteri pembawa DNA rekombinan
dapat dilakukan dengan dua cara yaitu seleksi resistensi antibiotika dan seleksi warna.
Metode Blue-White Screening merupakan salah satu metode seleksi sel hasil kloning
berdasarkan warna. Blue-white screening dilakukan untuk memisahkan sel yang
mengandung plasmid rekombinan dengan sel yang mengandung plasmid tanpa insert.
Seleksi biru putih dilakukan untuk mengetahui keberhasilan proses ligasi atau
keberadaan DNA sisipan.
Senyawa kimia yang diperlukan untuk metode screening ini adalah X-gal, enzim
-galaktosidase dan Isopropil beta-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG). -galaktosidase
merupakan protein yang dikodekan oleh gen lacZ dari lac operon, dan berperan
sebagai homotetramer dari keadaan aktifnya. Gen ini diatur ekspresinya oleh operon
lac. Aktivator untuk ekspresi gen ini adalah molekul laktosa yang dalam jumlah
tertentu dapat menginduksi terekspresinya gen lacZ. Sementara X-gal merupakan
gula galaktosa tak berwarna yang dimodifikasi yang dimetabolisme oleh enzim galaktosidase.

Isopropil beta-D-1-thiogalactopyranoside

(IPTG) yang

berfungsi

sebagai penginduksi Lac operon, dapat digunakan untuk meningkatkan fenotipe.


White-Blue Screening merupakan teknik yang cepat dan mudah dan
memungkinkan untuk menyaring reaksi kloning yang berhasil melalui warna koloni
bakteri. Namun, jenis vektor yang benar dan sel kompeten adalah pertimbangan yang
penting ketika merencanakan screening putih biru.

17

2.8.1

Mekanisme Secara Molekular


Dalam metode screening ini, sel inang E.Coli membawa mutan lacZ (lacZM15)
yang mengandung -peptida, sementara plasmidnya membawa sekuens lacZ yang
mengkode 59 residu pertama dari -galactosidase, -peptide. Ketika dua peptida ini
diekspresikan bersamaan, dan ketika plasmid yang mengandung sekuens lacZ
ditransformasikan

kedalam

lacZM15,

mereka

akan

membentuk

enzim

galaktosidase.

Gambar 11. Representasi skematik dari


white-blue screening. Sumber: wikipedia.com

Metode blue-white screening bekerja berdasarkan proses -complementation.


Plasmid yang membawa sekuens lacZ didalamnya disebut multiple cloning site
(MCS). MCS yang terdapat didalam sekuens lacZ dapat dipotong menggunakan
enzim restriksi sehingga DNA asing dapat disisipkan kedalam gen lacZ, sehingga
akan mengganggu produksi -peptide pada gen tersebut. Sehingga sel yang
didalamnya terdapat plasmid tersebut tidak dapat membentuk -galactosidase yang
berfungsi.
Keberadaan dari -galactosidase yang aktif dapat dideteksi oleh X-gal. X-gal
merupakan gula galaktosa tak berwarna yang dimodifikasi yang dimetabolisme oleh
enzim -galaktosidase untuk membentuk 5-bromo-4-chloroindoxyl yang dioksidasi
secara spontan untuk pigmen larut berwarna biru cerah 5, 5'-dibromo-4, 4'-dichloroindigo. Ini akan menghasilkan warna biru pada sel yang mengandung -galactosidase
yang fungsional. Koloni berarna biru menunjukkan bahwa didalam sel tersebut
terdapat vector dengan lacZ tanpa plasmid sisipan, sementara koloni berwarna putih,
dimana X-gal tidak dihidrolisis, menunjukkan adanya insert pada lacZ yang
mengganggu -galactosidase aktif yang fungsional.

18

BAB III
KESIMPULAN

Kloning apoptin dalam E.coli dapat dilakukan melalui beberapa tahap antara lain:
1. Isolasi gen apoptin dari sumbernya menggunakan metode Phenol-Chloroform,
dilanjutkan PCR-cycle dan Sanger sequencing.
2. Penyisipan arginin dan histin dalam gen apoptin dapat dilakukan menggunakan
metode PCR hard copy.
3. Vektor pUC19 dipilih sebagai vektor karena dapat dengan mudah dibedakan dari non
rekombinannya berdasarkan perbedaan warna koloni pada media pertumbuhan.
4. Penyisipan gen apoptin kedalam vektor plasmid dilakukan dengan penambahan
alkalin fosfatase pada larutan vektor, penambahan insert, buffer, air (pelarut) dan
DNA ligase, kemudian dilakukan inkubasi campuran larutan.
5. Transformasi gen apoptin dilakukan dengan metode heat-shock.
6. Untuk memastikan keberhasilan transformasi dilakukan screening dengan metode
white-blue screening. Teknik ini dipilih karena merupakan teknik yang cepat dan
mudah, selain itu kelengkapan yang dibutuhkan tersedia pada plasmid.

19

DAFTAR PUSTAKA

Hendra, dkk. Ekstraksi DNA Collocalia fuchiphaga dengan Metode Phenol Chloroform
Extraction dari Berbagai Material Sumber Genetik. Yogyakarta.
Khalid, Raditya. Imamul. 2012. Pemurnian Rekombinan Protein Apoptin dari Dua Sel Inang
Bacillus subtilis 168 dan Escherichia coli BL21 Star. Depok: Universitas Indonesia.
Los, Marek, dkk. 2009. Apoptin, a tumor-selective killer. Biochimica et Biophysica Acta.
1335-1342.
Witoyo,

Jatmiko.Eko.

Teknik

Rekayasa

Genetika.

[online].

Available

at:

(http://blog.ub.ac.id/jatmikoekotbp/files/2014/04/Teknik-Rekayasa-Genetika1.docx).
Diakses pada: 05/10/14 pukul 22.00 WIB.
Stanfield, William, dkk. 2006. Schaums Easy Outlines Biologi Molekuler dan Sel. Jakarta:
Penerbit Erlangga.

Christopher Howe. 2007.Gene Cloning and Manipulation Second Edition. New York:
Cambridge University Press.
Chan, Vicky. 2002. The Effect of Increasing Plasmid Size on Transformation
Efficiency in Escherichia Coli. Journal of Experimental Microbiology and
Immunology.
Joakim Nilsson, Stefan Stahl, Joakim Lundeberg, Mathias Uhlen, and Per-Ake Nygren.
1997. Affinity Fusion Strategies for Detection, Purification,and Immobilization of
Recombinant Proteins. Protein Expression And Purification 11,1 16 (1997). Article
No. Pt970767.
K. Terpe. 2002. Overview of tag protein fusions: from molecular and biochemical
fundamentals to commercial systems. Appl Microbiol Biotechnol (2003) 60:523533.
DOI 10.1007/s00253-002-1158-6/
W. Old., S.B. Primrose. 1989. Principles of Gene Manipulation. Inggris : Blackwell Scientific
Publications.
Dale. Jeremy W., Schantz, Malcolm Von. 2002. From Genes to Genomes. Inggris : John
Wiley & Sons, ltd.

20