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Fundamentos y tcnicas de anlisis microbiolgico 2010/11

UD 4

U.D 4: TCNICAS DE SIEMBRA .CULTIVO

1 INTRODUCCIN:
En la naturaleza, los microorganismos se encuentran formando poblaciones mixtas
constituidas por una gran variedad de stos. Sin embargo, el desarrollo de la
Microbiologa se ha conseguido mediante el estudio de cepas aisladas, mantenidas en
medios de cultivo preparados en el laboratorio, es decir cultivos puros, desprovistos de
cualquier otra forma de vida contaminante.
El primer problema que se plantea en el laboratorio cuando se quiere estudiar una
determinada bacteria es su aislamiento del resto de los microorganismos presentes en
una determinada muestra (frotis farngeo, exudado, esputo, orina, sangre, LCR, lquido
sinovial, etc.). Una vez que se ha logrado el aislamiento es posible realizar el cultivo puro,
cuyo estudio permitir la identificacin bacteriana, as como otras posibles
investigaciones que se deseen realizar.

MUESTRA AISLAMIENTO CULTIVO PURO

Identificacin bacteriana
Otros estudios.

2 TERMINOLOGA RELACIONADA:
-Colonia: Conjunto generalmente discreto (1-3 mm) de individuos originados a
partir de una sola clula (unidad formadora de colonias) sobre un medio slido o
semislido.
-Cepa: Lnea particular de bacterias que presumiblemente derivan de una clula
nica o un pequeo n de stas (unidad formadora de colonias).
-Cultivo: Poblacin bacteriana que se encuentra en un sitio determinado (tubos de
ensayo, matraces, etc.) en un momento determinado.
-Subcultivo: Cultivo derivado de otro anterior preexistente.
-Siembra bacteriolgica: Es el hecho de depositar en un medio de cultivo una
muestra que contiene, o se sospecha que contiene, microorganismos para obtener un
crecimiento bacteriano.

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3 TIPOS DE SIEMBRA SEGN EL ESTADO FSICO DEL


PRODUCTO DE PARTIDA
DE

A
Directo

Medio slido o
muestras biolgicas
muy viscosas o
slidas.

Medio slido
Preparacin de
inculos
Medio lquido
Medio slido

Medio lquido o
muestras biolgicas
lquidas.

Medio lquido

APLICACIONES
-Estudios de sensibilidad.
-Resiembras y
mantenimiento de cepas.
-Recuentos.
-Aislamiento.
-Identificacin.
-Enriquecimiento.
-Identificacin.
-Aislamiento.
-Identificacin.
-Enriquecimiento.
-Identificacin.

4 METODOS DE INOCULACIN Y AISLAMIENTO DE


MICROORGANISMOS
4.1 PREPARACIN DE INCULOS:
Cuando las muestras son muy viscosas o concentradas, y para tcnicas en las que
se pretende el aislamiento del germen o la realizacin de un anlisis cuantitativo, es
necesario preparar el inculo de siembra para obtener resultados fiables.
El inculo es una suspensin de microorganismos, a una determinada
concentracin, destinada a introducirla en tejidos vivos o sembrarlos en medios de
cultivo.
Como diluyente, para preparar la suspensin microbiana, se pueden usar:
- Solucin salina estril (es el ms adecuado).
- Agua destilada estril.
- Caldo de cultivo, que sea el mismo medio con el que se va a realizar la
tcnica pero sin que lleve Agar.
De ese inculo, la mayora de las veces es necesario conocer su concentracin
celular (concentracin de microorganismos) expresada en UFC/ml. Para ello se compara
el grado de turbidez del inculo con patrones establecidos. La comparacin se puede
realizar: visualmente, turbidimtricamente o espectrofotomtricamente.
Los patrones ms usados son los de la escala de escala de Mac Farland. Esta escala
es universalmente aceptada en microbiologa y est constituida por una serie de tubos en
los que se ha originado un precipitado blanco de sulfato brico (BaSO4) por reaccin del
cido sulfrico (H2SO4) con el cloruro de bario (Ba Cl2).
Si el inculo se prepara a partir de un cultivo, ste debe ser joven (cuando est en
la fase exponencial de crecimiento).
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4.2 MTODOS DE SIEMBRA- INOCULACIN


Son tcnicas destinadas a obtener gran cantidad de microorganismos (masa) a
partir de una pequea muestra. Este enriquecimiento de microorganismos se puede
conseguir tanto en medio lquido como en medio slido, en tubo o en placa.

4.2.1 En medio lquido en tubo


Se pueden realizar con asa, con pipeta, o con escobilln.

4.2.2 En medio slido en tubo


Siembra por estra en superficie inclinada. Se suele utilizar para renovar cepas
(resiembra) y para realizar pruebas bioqumicas para la identificacin
bacteriana.
Siembra en picadura. Con este tipo de siembras se observa la movilidad de los
microorganismos. Se utiliza para pruebas de identificacin.

4.2.3 En medio slido en placa


Inoculacin previa al vertido en placa. Tcnica de Barry. Se emplea para
recuento y antibiograma.
Tcnica de Kirby-Bauer. Se emplea para inoculacin directa de productos
patolgicos y estudios de sensibilidad.
Tcnica de inundacin. Se emplea para estudios de sensibilidad aunque no es
muy utilizada.

4.3 MTODOS DE SIEMBRA-AISLAMIENTO


Son tcnicas destinadas a obtener el aislamiento de las distintas poblaciones
microbiolgicas en el caso de que existieran. Se trata de dispersar los microorganismos lo
suficiente como para que cada clula forme su propia colonia, lo suficientemente
separada de las de alrededor como para poder ser identificada como una y no como
grupo de colonias. Siempre se realizan en placa.

4.3.1 Aislamiento por dilucin.


4.3.2 Aislamiento por agotamiento

Siembra en estra o en zig-zag.


Siembra en estra mltiple.
Tcnica de los cuatro cuadrantes.
Tcnica de los tres giros.

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Con asa de siembra


Con pipeta
Con escobilln
Inoculacin previa
al vertido en placa
Placa
Inoculacin sobre
la superficie del
medio solidificado
Siembra por estra
Tubo
en superficie
inclinada
Siembra en
picadura
Con esptula de Drigalski

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En medio lquido

Mtodos de
siembrainoculacin

En medio
slido

Por
dilucin
Mtodos de
siembraaislamiento

Tcnica de Barry
Tcnica de Kirby-Bauer
Tcnica de inundacin

En medio horizontal
En medio inclinado

Siembra en estra o zig-zag


Por
Siembra en estra mltiple
agotamien Tcnica de los cuatro cuadrantes
to
Tcnica de los tres giros
Mtodos
Urinocultivo
especiales Exudados genitales

5. CULTIVO
Tras la siembra de un medio de cultivo, ste debe colocarse en un ambiente
adecuado para el desarrollo de los microorganismos.
5.1. Factores que afectan al cultivo de microorganismos
Temperatura: generalmente se incubarn a 35-37, pero hay microorganismos
que requieren otras temperaturas.
Atmsfera: presencia o no de O2 y CO2; depender del tipo de
microorganismo: aerobio estricto, anaerobio facultativo, etc.
Proteccin ambiental: los microorganismos durante su incubacin deben estar
protegidos de agresiones externas y posibles contaminaciones, para ello se
deben cultivar en recipientes cerrados pero con la seguridad de que la
atmsfera sea la adecuada y en estufas de cultivo.
5.2. Estufas de cultivo
Las hay de varios tipos, segn el microorganismo a cultivar:
Estufas convencionales: en estas se controla la temperatura y la proteccin
ambiental. En ellas se incuban los microorganismos aerobios y anaerobios
facultativos.
Estufas de CO2: stas adems de proteger, controlan la temperatura y el
contenido de CO2. En ellas se incuban microorganismos cuyo crecimiento
se ve favorecido por la presencia de 5-10% de CO2, p.e. la Brucella y
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Neisseria. Cuando no se dispone de estufa de este tipo, las placas se


colocan en el interior de un recipiente hermtico en el que se introduce un
sobre generador de CO2.
Estufas o cmaras de anaerobios: se usan para incubar microorganismos
anaerobios, que no se desarrollan en contacto con el oxgeno a la presin
atmosfrica. Cuando no se dispone de estufa de este tipo, las placas se
colocan en el interior de un recipiente hermtico en el que se introduce un
sistema generador de anaerobiosis.
5.3. Normas generales para el cultivo de muestras microbiolgicas
Asegurarse de que la temperatura se mantiene constante durante el
tiempo de incubacin.
Mantener el tiempo en la estufa durante el tiempo necesario, el exceso o
defecto puede llevar a resultados errneos.
Evitar al mximo la manipulacin y apertura de los medios durante el
tiempo de incubacin. Los medios sembrados se deben incubar cerrados y
colocados de la siguiente forma:
o Tubos: cerrados con tapn o torunda de algodn graso, colocados
en posicin vertical (en gradilla).
o Placas Petri: por su diseo quedan perfectamente cerradas, se
colocarn de forma invertida, salvo raras excepciones (cultivo de
hongos).
o Frascos y botellas: cerrados con tapn hermtico y apoyados en su
propia base.
o Matraces: cerrados con torunda de algodn graso y apoyados en su
propia base.