Tulpini fungice izolate din dopuri de

pluta i formarea de 2,4,6trichloroaniole implicat n pata pluta de

vin
Sina Prak , Ziya Gunata , Joeph - Pierre
Guiraud , Sabine Schorr - Galindo
Abstract
Cork pat se datoreaz n principal 2,4,6 - trichloroanisole ( TCA ) produs prin activitatea de
tulpini fungice nedorite . Am observat c CFU numr mucegai n dopuri care conin TCA nu a
fost cantitativ diferit de cel al dopurilor nu conin TCA (cca 105 CFU / g ) . n contrast mai
diversitate fungilor a fost observat la dopuri coninnd TCA . Penicillium spp ( Penicillium
chrysogenum ,Penicillium glabrum ) , Aspergillus spp ( Aspergillus niger i Aspergillus oryzae )
, Chrysonilia sitophila , Mucor racemosus , Paecilomyces sp . i Trichoderma viride au fost
gsite n dopuri care conin TCA , n timp ce C. sitophila i Penicillium sp . au fost ciupercile
principal n dopurile de lipsite de TCA . Conidii au fost numeroase n apropiere de lenticele i
prezent din suprafaa lateral pn la centrul dopurilor . Tulpini de Aspergillus , Mucor ,
Paecilomyces , Penicillium i Trichoderma izolate din dopuri care conin TCA au fost capabili de
a converti 2,4,6 - triclorfenol ( TCP ), n TCA n repaus celul sau condiii de cretere . Cele mai
bune randamente de conversie au fost obinute de ciuperci verde
Paecilomyces sp . i P. chrysogenum , 17% i 20 % , respectiv . Chysonilia sitophila i
Penicillium sp . nu a produs TCA de la TCP n condiiile noastre .
1. Introducere
Plut , scoarta de stejar de plut ( Quercus suber ) a fost materialul tradiional pentru fabricarea
dopurilor din secolul al 17-lea de mbuteliere a vinului , n special pentru vinurile de nalt

calitate i de o maturare corespunztoare a vinului . Principalele componente ale plut sunt

suberin , lignin , compui fenolici i polizaharide ( Pena - Neira et al, 2000 ; . . Alvarez Rodriguez i colab , 2002) . Caracteristicile sale specifice , impermeabilitate la aer i lichide ,
comprimare , capacitatea de a adera la suprafee de sticl i ineria chimic l face ideal pentru
mbutelierea vinului . Cu toate acestea 2-7 % din vinurile nchise cu dopuri dezvoltat o pat de
plut , un mucegite i mucegai off- miros , care este considerat a fi unaccep - mas de ctre
consumator ( Butzke et al , 1999 ; . Silva Pereira et al , 2000a . ) . Incidena rsuflarea vinului a
fost considerat a fi problema major asociat cu utilizarea acestor nchideri . Mai muli compui
volatili , clor - oanisoles , guaiacol , geosmine , 2 - methylisoborneol , Pyra -Bloguri , 1 - octen 3 - ol i 1 - octen - 3 -on au fost raportate de a contribui la atribut rsuflarea vinului ( Buser ,
1982 i colab . ; Amon i colab , 1989; . Simpson i Lee , 1990; Lee i Simpson , 1993; Sponholz
i Muno , 1994; Pllnitz i colab , 1996; . . Rocha i colaboratorii , 1996a , b ; Howland et al,
1997 ; . Caldentey i colab , 1998; . . Chatonnet et al, 2003 ; Ezquerro i Tena , 2005; . Ezquerro
i colab , 2006) . Cu toate acestea , 2,4,6 - trichloroanisol ( TCA ) este compusul cel mai adesea
asociat cu rsuflarea vinului n vinurile care posed un prag senzorial foarte mic ( 1.4 - 10.0 ng /
l) ( Buser i colab , 1982; . Chatonnet , 1994 ; Evans i colab , 1997; . Butzke i colab , 1999; . .
Silva Pereira et al , 2000a ; Alvarez - Rodriguez i colab , 2002) . . In plus majoritatea vinurilor
ptate -au dovedit a conine TCA la sau peste valoarea sa de prag senzorial ( Evans et al , 1997; .
Silva Pereira et al , 2000a . ) .
Originea chloroanisoles din dopuri de pluta este atribuit transformarea microbiana a chlorophe NOLS . Aceast transformare este n esen un mecanism de detoxifiere prin metilarea
microbiologic a clor - ophenols ( Zehnder i colab , 1984; . . Silva Pereira et al , 2000a ) .
Precursorul direct al TCA este 2,4,6 - triclorfenol ( TCP ) . Prezena sa n plut pot avea mai
multe origini : clor de albire n prelucrarea dopuri care este n prezent abandonat , , utilizarea
produselor biocide polychlorophenol n pdurile de stejar de pluta ( Simpson i Lee , ( Maujean
et al , 1985 Sponholz i Muno , 1994 ). 1990) i dehalogenarea (PCP ) i 2,3,4,6 tetraclorfenol (
TeCP ), de microorganisme ( Maarse et al , 1988; . Sponholz i Muno , 1994) .
Studii privind dopurile , folosind microscopie electronic au artat prezena a numeroase
microflora (piese de turnare , drojdii i bacterii) din dopuri de plut ( Lee i Simpson , 1993;
Jger , 1999) . Cele mai abundente Microorganismele au fost matrite . De exemplu 108 , 104
mucegaiuri drojdii i 104 bacterii pe dop ( Davis et al . , 1981) i 5,7 104 mucegaiuri i 3 104

bacterii gram de plut ( Alvarez- Rodriguez i colab . , 2002) au fost raportate . O scdere
drastic a populaiei microbiene are loc n timpul pluta etape de prelucrare , n principal prin
tratament termic . Flora din pluta pot varia n funcie n mare msur de condiiile de origine ,
prelucrare , transport i depozitare ( Silva Pereira et al . , 2000a ) . Printre microflora forme sunt
de obicei cele mai rezistente , iar unele pot supravieui n condiii extreme .
Matriele sunt considerate a fi n principal responsabil pentru plut pat . Mai muli autori
ecranate florei micotice pe dopuri de plut i identificate Penicillium sp . , Trichoderma sp . ,
Chrysonilia sp . , Cladosporium sp . , Fusarium sp . , Acre - monium sp . , Aspergillus sp . ,
Monilia sp . , Mucor sp . , Paecilomyces sp . , Rhizoctonia sp . , Mortierella sp . iVerticillium sp
. ( Moreau , 1978; Davis et al , 1981; . Castera - Rossignol , 1983 , Lee i Simpson , 1993 ; Hill
et al , 1995; . Caldentey et al , 1998; . Silva Pereira et al , 2000b ; . Alvarez - Rodriguez et colab .
, 2002) .
Unsprezece din 14 tulpini fungice izolate din probe de pluta au fost capabili s produc TCA
cnd au fost cultivate pe plut suplimentat cu TCP ( Alvarez- Rodriguez i colab ., 2002 ) .
Printre ei Fusarium i tulpini Trichoderma au fost cele mai eficiente ( Alvarez- Rodriguez i
colab . , 2002) . A S - adenozil - L - metionin - depen - Dant metiltransferaz catalizator Ometilarea mai multe clorofenoli , inclusiv TCP a fost recent izolat din
Trichoderma longibrachiatum ( Coque i colab . , 2003) .
n ceea ce privete drojdii izolate din coaja de stejar de plut , Rhodosporidium sp . i
Rhodotorula sp . ( Villa- Carvajal i colab ., 2004 ) au fost cele mai abundente . Printre bacteriile
Streptomyces sp , Streptococcus sp , Micrococ - cu sp . , i Bacillus spp au fost observate la
dopuri ( Fumi i Colagrande , 1988) . Capacitatea lor de a metileaz chlorophe - NOLS nu a fost
nc raportate .
Compoziie flora Mould de dopuri de plut lipsite de plut gustului chemat aici '' sunet dopuri '' ,
precum i de cele care prezint plut gustului au fost studiate pentru a mbunti cunotinele
noastre de forme de turnare care contribuie la off- mirosul de vin prin formarea de TCA .
Capacitatea de a tulpinilor izolate de a transforma TCP n TCA de repaus i n cretere de celule
a fost examinat att n mediu de cultur solid format din dopuri de plut i n mediu lichid .
Analiza a fost realizat prin TCAn faz solid micro - extracie ( HS - SPME ) tehnica n spaiul
superior . Aceast tehnic a fost deja utilizat pentru analiza TCA din plut i vinuri plut viciate (

Fischer i Fischer , 1997; Evans i colab , 1997; . Riu et al, 2002 ; . Bianchi et al, 2003 ; . Insa et
al., 2004 ; Juanola et al, 2004 ; . Ezquerro i Tena , 2005 ; Ezquerro et al , 2006) .
2. Material i metode
2.1 . chimicale
TCP i TCA au fost obinute de la Sigma ( St. Louis, MO , USA ) .

2.2 . dopuri de pluta

Dou loturi de dopuri de pluta au fost furnizate de Bouchons Abel Company ( Le Boulou , Frana
) . Nu a fost nici o urm dopuri din primul lot ntruct a fost prezent n al doilea lot . n plus , n
analiza GC / MS efectuat n timpul lucrului TCA prezent, nu a fost detectat n primul lot , n
contrast cu cea de a doua . Dopurile au fost depozitate ntr -o cutie nchis la 20-25 1C pn la
analiz . Nivelul de umiditate al dopurilor ( lungime 4571 mm , diametrul de 2470.5 mm ) a fost
de 8% .
2.3 . Microscopie electronic de scanare
Sunet i coninnd TCA dopuri s-au tiat la diferite adncimi de la partea de raz ( 0 , 2 , 4 , 6 i
8 mm) folosind o lam steril pentru a obine ptrate jetoane ( 6 mm 6 mm) . Tierea fost paralel
cu suprafaa lateral i perpendicular pe lenticele . Probele au fost apoi desicate timp de 24 ore la
25 1C nainte observaii microscopice au fost realizate ( Cambridge Stereosca , JEOL JSM
6300F , scanare Microscop ) .
2.4 . Estimarea de celule de mucegai cultivabile

Counts au fost efectuate pe dopuri ntregi sau pe cipuri luate aseptic la diferite niveluri de
dopurile ( de la suprafa pn la 2 mm adncime radial ; ntre 2 i 4 mm , ntre 4 i 6 mm , de
la 6 la 8 mm i de la 8 mm la centru ) . Pentru izolarea mucegaiurilor, dopurile sau chips-uri au
fost imersate n 200 ml (10 buoane, circa 35 g ) sau n 10 ml (circa 1 g de granule ) de mediu
sterilizat anterior tripton - sare ( tripton 1 g / l i NaCI 8,5 g / l ) . Dup agitare ( 160 rpm , 45 de
minute la 40 1C ) , 0,1 ml de mediu de extracie a fost supus la diluii seriale de 10 ori i placat
pe vase Petri conin -ing PDA - cloramfenicol ( pH 3,5 ) medie ( Guiraud , 1998) . Dup 3-5 zile

de incubare la 25 1C , coloniile au fost numrate . Rezultatele sunt exprimate ca numr de

colonii viabile per g de plut ( UFC / g de plut ) cu IC 95 .
2.5 . Estimarea populaiei mucegai prin microscopie epifluorescenta
Tehnica de filtrare cu epifluorescen direct ( DEFT ) ( Jaeggi i colab . , 1989) utilizat anterior
pentru numrarea celulelor de mucegai ( Kisko i colab . , 1997) s-a aplicat mostrelor noastre . n
acest scop 10 ml de mediu de extracie de mai sus au fost filtrate pe Millipore IsoporeTM 0,4
mm membran ( Milli - pori ) , urmat de adugarea a 1 ml de soluie acridin portocalie ( 0,025
mg / ml ) . Membrana a fost apoi cltit dup 10 minute cu 10 ml de ap steril . Observarea
celulelor de pe membrana a fost fcut printr-o pictur de ulei de imersie n UV cu o
epifluorescen micro- domeniu de aplicare ( Olympus BX60 ) . Numrarea se realizeaz pe o
suprafa cunoscut de cmp microscopic , distincie celule de culoare verde ( Predominana a
ADN-ului , teoretic, n stare fiziologic buna ) i celule colorate n rou ( predominant - Nance a
ARN-ului , teoretic , n stare bun fiziologic ) . Rezultatele raportate sunt media a trei capete de
acuzare .

2.6 . identificarea Mould

Tulpinile au fost izolai ca unic CFU prin diluii mari n soluie salin ( NaCl 8,5 g / l) i
puritatea a fost controlat de subclonare . Tulpini minore observate n diluii mai mici sau
contaminate cu tulpinile predominante au fost izolate de cules i striating , atta timp ct este
necesar pentru a obine colonii unice . Identificri au fost fcute de ctre macroscopice observations ( form , mrime , culoare de colonii ) i observaii microscopice ( tobogan colorate de
bumbac albastru ) prin compararea cu datele obinute n aceleai condiii de cultur ( Samson et
al ., 1995) .
2.7. Culturi de mucegai i de producie TCA
2.7.1 . Prepararea inoculului
Toate tulpinile fungice izolate au fost cultivate pe mediu PDA ( pH 3,5 ) la 25 1C timp de 5 zile .
Conidii au fost colectate prin rzuire ntr -o soluie salin cu 0,01 % Tween 80. Dup numrarea
cu un hemocitometru suspensia a fost standardizat prin diluare laconcentraia adecvat .

2.7.2 . Bioconversie pe mediu dop de plut solid

Dopuri de sunet ( 15 g) s-au sfrmat ntr-un amestector Waring ( Waring Blendor ) cu 75 ml de
mediu de cultur i autoclavizat ( 20 min la 120 1 C) ntr -un balon Roux . Mediul de cultur a
constat din ( per litru ) : 30 g glucoz , 5 g casein pepton , 5 g pepton de carne , 5 g clorur de
sodiu , 3,3 g azotat de sodiu , 1 g clorur de calciu , 1 g dipotassic phos - fosfat , 1 g clorur
feric , 1 g clorur de potasiu , sulfat de magneziu 0,5 g ( 7H2O ) i 0,1 g sulfat de fier ( 7H2O ) .
Acest mediu a fost chemat de mediu dop de plut solid , deoarece constat n dopuri de plut
presai impregnate cu un mediu de cultur lichid . Baloanele au fost inoculate cu 5 108 conidii
ale tulpinilor izolate i identificate i apoi incubate timp de 3 sptmni la 25 1C care era
necesar pentru a obine o concentraie maxim de biomas .
Dup 3 sptmni de incubare , 5 g de cultur SSD pe mediu plut au fost transferate n fiole de
20 ml i fixat cu 150 ml dintr-o soluie TCP ( 1 g / l ) . Bioconversia a fost efectuat timp de 2 i
7 zile la 25 1C . Probele au fost apoi supuse la spaiul superior faz solid micro - extracie ( HS
- SPME ) i gaz cromatografie / spectrometrie de mas ( GC / MS ) analiz . Pentru a estima
biomasa din mediul de dop de plut solid dup 3 sptmni de cultur sau 2 i 7 zile de
bioconversie , moloz plut a fost luat ntr-o soluie salin cu 0,01% Tween 80 i conidii au fost
numrate cu un hemocitometru .

2.7.3 . Bioconversie n mediu lichid

Mediu Czapeck ( pe litru : 30 g zaharoz , 2 g nitrat de sodiu , 1 g fosfat potasic , 0,5 g clorur de
potasiu , sulfat de magneziu 0,5 g ( 7H2O ) , 0,1 g sulfat de fier ( 7H2O ) ) a fost distribuit n 250
ml pahar Erlenmeyer ( 100 ml de mediu ) . Baloanele au fost inoculate cu 5 104 conidii de tulpini
identificate i incubare a fost realizat la 25 1C timp de 1 sptmn . Acest timp de incubare a
fost necesar pentru a obine o concentraie maxim de biomas . Dup aceea 15 ml de mediu care
conine celule n repaus au fost turnat n fiole de 20 ml i 150 ml dintr-o soluie TCP ( 1 g / l) a
fost adugat la mediu . Bioconversia a fost efectuat timp de 2 i 7 zile la 25 1C . Probele au fost
apoi supuse la HS- SPME i analiza GC / MS . Pentru a evalua biomas dup 1 sptmn de

cultur , sau dup 2 i 7 zile de bioconversie , mediul de cultur se filtreaz printr- o membran ,
iar biomasa rezultat a fost evaluate dup uscare la 105 1C pentru 24 H.
2.7.4 . Producia de TCA n timpul cultur n mediu lichid
Mediul de cultur utilizat pentru experimente bioconversie (100 ml) a fost fixat cu 1 ml de
soluie TCP ( 1 g / l ) , inoculat ( 5 104 conidii ) i se cultiv timp de 1 sptmn la 25 1C .
Dup aceea 15 ml de mediu au fost turnat n flacoane de 20 ml pentru HS- SPME i analiza GC /
MS . EVALUARE -TION Biomasa s-a realizat ca n cazul de bioconversie n mediu lichid .

2.8 . Analiza TCA de la dopuri si culturi de mucegai

2.8.1 . Extracie TCA din dopuri
Pentru extracia TCA 10 dopuri au fost imersate n 150 ml de soluie de ap - etanol ( 88/12 ; v /
v) i supus la agitare ( 160 rpm ) timp de 24 ore la 25 1C .

2.8.2 . HS- SPME

Doisprezece mililitri de macerate plut au fost plasate ntr -un flacon de 20 ml i 2 g / l NaCl s-au
adugat cu . Fiola a fost nchis cu un perete despritor teflon i plasat la echilibru timp de 24 h
la 20 1C . Mediul de cultur de mai sus au fost transferate ntr-un flacon de 20 ml i au fost
supuse aceleiai proceduri . Polidimetilsiloxan ( PDMS , 100 mm grosimea peliculei , Supelco ,
SUA ) Fibr din dispozitiv SPME fost expus laspaiul superior din mostra de 20 ml flacon de 40
min la 20 1C ( Evans et al , 1997; Fischer i Fischer , 1997) . Desorbie termic a volatile
dinfibra SPME a avut loc n portul de injectare GC la 250 1C timp de 4 minute .
2.8.3 . analiza GC
Analiza GC a fost efectuat cu un varians 3300 cromatograf ( Walnut Creek , CA, USA ) echipat
cu o coloan de silice topit DB - CEARA capilar ( 30 m 0,32 mm id , 0,25 mm grosime de film
, J & W tiinific ) . Injectarea a fost n mod splitless i temperatura injectorului a fost fixat la
250 1C . Gazul vector ( hidrogen ) rata de curgere a fost de 1,5 ml / min . Temperatura coloanei a

fost programat 40-250 1 C, la 10 1C / min i se menine la 250 1C timp de 10 min . Detectarea a

fost de un detector cu ionizare n flacr ( FID ) reglat la 300 1C .
Cuantificarea a fost realizat folosind metoda standardului extern cu o curb de calibrare TCA
stabilit cu soluie TCA la 20 , 50 , 100 , 200 , 500 i 1000 ng / l .

2.8.4 . GC -MS
TCA recuperate prin fibr SPME a fost identificat cu un aparat GC - MS ( HP- 6890A GC
conectat la un MS HP - 5973N ), montat cu o coloan capilar identic cu cea menionat mai
sus . Programarea temperaturii pentru port de cuptor i de injectare au fost ca mai sus . Gama
mas scanat a fost de 40-350 amu la o rat de scanare de 2.89 scaneaz / s . Temperatura linie
de transfer a fost de 260 de 1C . Gazul vector ( Heliu ) rata de curgere a fost de 1,5 ml / min .
Metoda de ionizare utilizat a fost de impact electronic cu energie -TION ioniza de 70 eV . TCA
a fost analizat de monitorizare selectiv de ioni ( SIM ), modul de analiz cu urmtoarele ioni
int : m / z 167 , 195, 197 i 210 .
3. Rezultate i discuii

3.1 . Nivelurile TCA de dopuri de pluta

Nivelurile TCA n dou arje de dopuri sortate n funcie de prezena sau absena off- miros de
ctre furnizor a fost msurat prin combinaia dintre SPME i tehnici GC / MS dup extragerea
10 dopuri folosind un amestec de ap / etanol . TCA nu a fost detectat n aa-numitele '' dopurile
de sunet ", n timp ce 10,5 ng / g . de plut a fost gsit n lotul plut - pat atribuit , o sum
capabil s exercite plut pat n vin . Aceast valoare a fost n intervalul de la nivelurile ntlnite
n dopuri contaminate cu TCA ( Juanola i colab . , 2004) . Reinei c o variabilitate mare n
concentraie TCA din dopuri de plut poate s apar ca urmare a influenei mai multor factori :
originea dale de stejar , prelucrarea i conservarea materialului , mediul de vinificatie ,
microflora , etc.

3.2. Florei fungice ale dopuri

3.2.1 . Microscopie electronic de scanare
Examinarea Microfotografiile din solide i dopuri care conin TCA arat c conidia sunt
numeroase n apropiere de lenticele ( fig. 1 ) , spre exterior rare dar sunt prezente pana lacentrul
dopului . Acest lucru este n conformitate cu observaiile Jger ( 1999) i Jger et al . ( 1996 ) .
Pentru ambele tipuri de dopuri contaminare are loc la diferitele poziii observate ( fig. 1 i 2 )

Fig . 1 .Microscopie de TCA coninnd dop, la nivel tiere 2 mm . Vedere general ( 30 ) litera (a ) i zoom ( 1000)
a zonei compact ( b ) i lenticel ( c ) .

Nu exist nicio diferen evident sub observaie electronic microscopie ntre sunet i dopuri care
conin TCA , cu excepia lanuri Penicillium - cum ar fi de conidii care se disting n mod clar de
la dopuri care conin TCA (Fig . 2 ) .

Fig . 2 . Microscopie de scanare ( 1000) din dop de sunet (a , c ) i TCA coninnd dop ( b , d ) la nivel de tiere de 4
mm in apropiere de lenticel ( a , b ) i n zona compact ( c , d ) . Sgeile indic lanuri - Penicillium cum ar fi .

3.2.2 . Estimarea populaiei de mucegai din dopuri de plut i de identificare

Coloniile de mucegaiuri din dopuri au fost izolate i identificate ( tabelul 1 ) . Ele aparin genului
Aspergillus , Penicillium , Mucor , Trichoderma i Chrysonilia . Multe dintre ele au fost deja
detectate pe Plute care arat c flora plut caracterizate de aici ar putea fi considerate repre zentant al compoziiei plut flor ( Hill et al , 1995; . Alvarez - Rodriguez , 2002 i colab.) .
Nivelurile unor matrie au fost semnificativ mai mari la care conin TCA dopuri de plut dect n
dopuri solide , cu excepia Penicillium sp . Acesta din urm i Chrysonilia sitophila au fost
printre cele dominante n ambele dopuri . C. sitophila este adesea ciuperca dominant n timpul
produciei tradiionale de dopuri de plut unde dalele sunt supuse aa-numita etapa de coacere
dup fierbere . Prezena C. sitophila a fost considerat a fi favorabil , deoarece inhib dezvoltarea
altor ciuperci care contribuie la formarea gustului plut . Interes - ce mai mult aceasta ciuperca
nu are capacitatea sau are o capacitate foarte sczut de a produce TCA ( Silva Pereira et al . ,
2000b ) . Mai multe specii de mucegai au fost prezente la un nivel ridicat n TCA - contin -Ing
dopuri : Penicillium spp ( Penicillium chrysogenum , Penicillium glabrum ) , Aspergillus spp (

Aspergillus niger i Aspergillus oryzae ) , C. sitophila , Mucor racemosus , Paeci - lomyces sp .

i Trichoderma viride . Plut Flora este influenat considerabil de prelucrare , condiiile de
mediu i de stocare nconjurtoare , dar C. sitophila , Penicillium spp i Trichoderma sp . au fost
adesea printre matrite predominante n plci de plut sau dopuri de plut ( Fumi i Colagrande ,
1988; Lee i Simpson , 1993 ; Silva Pereira et al , 2000a , b ; . Alvarez - Rodriguez et al., 2002 ),
care este n acord cu prezentul studiu . Aspergillus sp . a fost gsit n studiul nostru la niveluri
destul de ridicate n TCA tentat dopuri . Cu toate acestea , acest gen nu a fost raportat frecvent
n studiile anterioare sau raportate numai la niveluri sczute n dopuri ( Silva Pereira et al , 2000a
, b ; . . Alvarez- Rodriguez i colab , 2002) . Unele tulpini au fost de asemenea detectate n
aceast lucrare , dar numai la un nivel sczut . Acremonium sp ,Cladosporium sp . i Fusarium
oxysporum .
Totalflora fungic a fost estimat prin numrarea numrului de colonii viabile de matri
identificat din dopuri ( Tabelul 1 ) . 2.970.3 105 UFC / g de plut a fost observat n dopuri care
conin TCA . Aceast valoare a fost destul de similar cu cel obinut n dopurile de sunet ( 2.670.8
105 CFU / g) . Aceste niveluri sunt apropiate de cele raportate n dopuri de plut pe Alvarez Rodriguez et al . ( 2002) . Mai mult dect att , starea fiziologic a celulelor fungice a fost
estimat prin microscopie cu epifluorescen dup ce a recuperat matriele de filtrare cu
membran ( tabelul 2 ) . Nivelul de mucegaiuri detectate a fost mai mic dect cele obinute prin
numrarea coloniilor . Acest lucru se poate datora pstrarea multor celule prin zdrobit moloz dop
timpul filtrrii. Nivelul de conidii a fost mai mic n dopuri de sunet ( 9.071.1 103 g per ) dect n
dopuri coninnd TCA ( 12.471.1 103 g per ) . Conidii de culoare verde au predominat att n
sunet i dopuri care conin TCA reprezentnd 61% i 63 % din populaie conidii , respectiv .
Acest lucru indic o stare fiziologic relativ proast de ciuperci n cele dou tipuri de opritoare .
Coninut TCA nu a avut nici o influen asupra starea fiziologic a celulelor fungice . Cu toate
acestea , aceast stare fiziologic ru a dus la o inciden buna de pe cultivability de micro organisme de la nivelul de UFC a fost semnificativ mai mare dect cea obinut prin microscopie
epifluores - de licen .
Populaia florei fungice a fost evaluat , de asemenea , acord ing la adncimea radial n dopuri
contaminate cu TCA de la suprafaa la centrul de numrareconidia viabil ( Tabelul 3 ) . Diferitele
Matriele au fost prezente la suprafaa lateral a centrului aa cum s-a observat prin microscopie
electronic de baleiaj . Nivelul de C. sitophila i M. racemosus sczut de la suprafa la centru .

A existat o tendin similar pentru T. viride ntruct Penicillium sp . niveluri a crescut de la

suprafapn la centrul dopului . Toate matriele detectate aici, n plut sunt specii de aerobic .
De aceea , limitare de oxigen n interiorul dopului devine o stare foarte nefavorabile pentru
creterea lor, care explic prezena lor de preferin n lenticele ( Moreau , 1978 ; . Lefebvre et al
, 1983 ; . Silva Pereira et al , 2000a ) . Poziia lor n lenticele ar putea fi legate de nivelul de
umiditate care regleaza cresterea ciupercilor ( Moreau , 1978; Lefebvre et al ., 1983 ) . Reducerea
progresiv a nivelului de oxigen i AW n inima dopului ar putea explica rezultatele obinute de
C. sitophila i M. racemosus . Ambele tulpini special C. sitophila sunt cunoscute a fi - exigente
oxigen . ntr-adevr, C. sitophila atunci cnd sunt cultivate n Petri - vas dezvolt colonii cu
smocuri neregulate n spe cial - la marginea Petri - antena ( Samson et al. , 1995) . Mai mult
dect att , aw de 0,87 s-a dovedit a fi mai favorabil pentru creterea Mucor i Trichoderma spp
izolate din plut n timp ce Penicillium spp ar putea crete la AW de 0,8 ( Castera- Rossignol ,
1983 )
3.3 . Producia TCA din TCP de matrie izolate
Aceast lucrare a fost realizat utiliznd celule fie de odihn ( bioconversie ) sau celule n
cretere . Celulele de odihn au fost recuperate din cultura ciupercilor , fie pe suport de plut
solid sau mediu lichid .

3.3.1 . Bioconversia TCP n TCA de ciuperci cultivate pe mediu solid sau lichid
Nou tulpini de fungi izolate din dopuri au fost testate pentru capacitatea lor de a transforma
TCP n TCA dup o cretere pe un mediu solid sau plut mediu lichid . apte tulpini TCA produs
( Tabelele 4 i 5 ) , cu excepia C. sitophila i Penicillium sp . Acest rezultat susine lipsa TCA n
dopurilor de plut de sunet de la ambele tulpini fungice au fost ciupercile dominante din aceste
dopuri special Penicillium sp . care a fost detectat la nivel de urme n dopuri care conin TCA .
Nu n afar de C. sitophila a fost gasit pentru a produce TCA de la TCP sau s-l produc la foarte
sczut niveluri ( Silva Pereira et al. , 2000b ) . Dei speciile Penicillium legate izolate din dopuri
de plut flora au fost printre cele mai eficiente matrie n producia TCA de la TCP , a fost
observat o diferen semnificativ ntre tulpini a randamentului de producie TCA ( Silva
Pereira et al , 2000a ; . Alvarez - Rodriguez et al . , 2002) . Unele tulpini au fost productori

foarte slabe , care ar putea explica de cesp Penicillium . care le-am izolat , nu a produs TCA la
niveluri msurabile .

Pe medii plut solid , nivelul TCP a sczut cu 30-85 %, n funcie de tulpina fungic utilizat
dup 7 zile de incubare (Tabelul 4 ) . Doar o mic parte din TCP a fost transformat n TCA de
ciuperci pe suport de plut . Intr-adevar randamentul bioconversia TCP pentru TCA a fost de la
0,06 % la 5,21 %, n funcie de tulpin fungic . Acest fenomen a fost deja raportat n literatur
i s-a sugerat c metaboliii TCP ar fi putut fi includerea de informaii - evaluat n material
celular ( Silva Pereira et al , 2000a ; . Alvarez - Rodriguez i colab ., 2002 ) . Studii suplimentare
ar trebui s fie efectuate pentru a clarifica acest punct .
Mai mare producie a fost obinut cu Paecilomyces sp . , Urmat de P. chrysogenum i T. viride ,
respectiv . Cu excepia M. racemosus care a fost identificat pentru prima dat n studiul nostru
n flor plut , celelalte tulpini au fost deja cunoscute a fi productori de TCA ( Silva Pereira et al
, 2000a ; . . Alvarez - Rodriguez et al , 2002) . Niger A. i A. oryzae convertit TCP , de
asemenea, la TCA , dar ntr-o msur mai mic dect alte tulpini fungice .
Printre ciuperci T. viride , P. chrysogenum , Paecilomyces sp , i P. glabrum demonstrat
capacitatea bun de cretere pe termen mediu plut . Rezultate similare au fost obinute ntr -un
studiu anterior cu T. viride i P. chrysogenum ( Alvarez - Rodriguez i colab . , 2002) . Am

observat cele mai mari randamente de producie TCA de biomas cu P. chrysogenum ,

Paecilomyces sp , i P. glabrum .
In culturile lichide ( tabelul 5 ) , randament bioconversia TCP pentru TCA a fost mai mare pentru
toate tulpinile dect n mediu de plut cu excepia A. niger . Cu toate acestea , degradarea TCP
de tulpini fungice fost semnificativ mai mare n mediul plut dect n culturile lichide . Aceasta
poate avea legtur cu imobilizarea ciuperci pe dopuri . De fapt Pallerla i Chambers ( 1998) a
raportat c imobilizare biomas fungic poate mbunti att capacitatea de degradare compus
chlorophenolic ciupercilor i a toleranei la toxicitatea compuilor .
n mod surprinztor A. niger au crescut bine n mediu lichid , dar nu a metilat TCP . n plus ,
cultura lichid a fost mai convenabil pentru M. racemosus la pro - ducerea TCA dect mediul de
plut . Toate aceste rezultate arat importana mediului de cultur atunci cnd tulpini fungice au
fost testate pentru capacitatea lor de a sintetiza TCA .

3.3.2 . Formarea TCA din TCP n timpul cultur n mediu lichid

Cnd TCP -a adugat la mediul lichid la nceputul culturii la acelai nivel utilizat pentru
bioconversie ( tabelul 6 ) , creterea fungilor a fost nu a influenat semnificativ comparativ cu
cultura realizat n acelai mediu , n absena TCP ( Tabelul 5 ) . Aceasta indic faptul c TCP nu
a avut un efect toxic asupra creterii fungilor . Randamentul de transformare a TCP la TCA
timpul culturii cu TCP ( Tabelul 6) a fost mai mare dect cea observat n condiii bioconver Sion n mediu lichid ( Tabelul 5 ) . Acesta a fost cazul mai ales pentru culturile cu Paecilomyces
sp , P. glabrum , P. chrysogenum , A. oryzae i A. niger . A. niger nu a fost n msur s produc
TCA de la TCP n condiii de bioconversie n timp ce adugarea de TCP la nceputul culturii
permis . Aceasta poate fi atribuit la inducerea sintezei enzimei de metilare TCP n acest caz .

4. Concluzie
Dopuri de plut cu pat a artat o populaie fungice cantitativ puin diferit de cea din dopuri de
sunet , dar a artat o diversitate mai mare de specii. Tulpinile de multe ori observat n sunetului
sau au fost identificate Plute contaminate , cum ar fi Chysonilia sitophila , Penicillium spp ,
Trichoderma spp , Mucor spp , etc. . Cu toate acestea , izolarea tulpinilor de
Aspergillus niger , A. oryzae i Mucor racemosus este nou n plut tentat dopuri . Din cele 9
tulpini predominante testate doar 7 au fost capabili s produc TCA din TCP precursorul su
prezumtiv , att ca odihn i celulelor n cretere . C. sitophila i Penicillium sp . nu produce
TCA n condiiile noastre de cultur i de bioconversie . n toate experi - mentelor efectuate n
acest studiu fungi care produc cel mai TCA au fost P. chrysogenum , Paecilomyces sp , i

P. glabrum . Este demn de remarcat faptul c n industria de plut pata de mucegai este legat n
mod tradiional de apariia ciupercilor negru, dar studiul nostru arata ca ciupercile verzi au fost
un productor TCA foarte puternic de la TCP .