ESPECTROFOTOMETRIA

Los espectrofotmetros de reflectancia miden la cantidad proporcional de luz reflejada

por una superficie como una funcin de las longitudes de onda para producir un
espectro de reflectancia. El espectro de reflectancia de una muestra se puede usar, junto
con la funcin del observador estndar CIE y la distribucin relativa de energa
espectral de un iluminante para calcular los valores triestmulos CIE XYZ para esa
muestra bajo ese iluminante.

El funcionamiento de un espectrofotmetro consiste bsicamente en iluminar la muestra

con luz blanca y calcular la cantidad de luz que refleja dicha muestra en una serie de
intervalos de longitudes de onda. Lo ms usual es que los datos se recojan en 31
intrvalos de longitudes de onda (los cortes van de 400 nm, 410 nm, 420 nm 700 nm).
Esto se consigue haciendo pasar la luz a travs de un dispositivo monocromtico que
fracciona la luz en distintos intrvalos de longitudes de onda. El instrumento se calibra
con una muestra o loseta blanca cuya reflectancia en cada segmento de longitudes de
onda se conoce en comparacin con una superficie de reflexin difusa perfecta.
La reflectancia de una muestra se expresa como una fraccin entre 0 y 1, o como un
porcentaje entre 0 y 100. Es importante darse cuenta de que los valores de reflectancia
obtenidos son valores relativos y, para muestras no fluorescentes, son independientes de
la calidad y cantidad de la luz usada para iluminar la muestra. As, aunque los factores
de reflectancia se midan usando una fuente de luz concreta, es perfectamente correcto
calcular los valores colorimtricos para cualquier iluminante conocido.

Un espectrofotmetro es un instrumento usado en elanaliis quimico que sirve para

medir, en funcin de lalongitud de onda, la relacin entre valores de una misma
magnitud fotomtrica relativos a dos haces deradiaciones y laconcentracion o reacciones
qumicas que se miden en una muestra. Tambin es utilizado en los laboratorios de
qumica para lacuantificacion de sustancias y microorganismos.
Hay varios tipos de espectrofotmetros, puede ser de absorcin atmica, de absorcin
molecular (que comunmente se conoce como espectrofotmetro UV-VIS), y no debe ser
confundido con un espectrmetro de masa.
Este instrumento tiene la capacidad de proyectar un haz deluz monocromatica a travs
de una muestra y medir la cantidad de luz que es absorbida por dicha muestra. Esto le
permite al operador realizar dos funciones:

Dar informacin sobre la naturaleza de la sustancia en la muestra

Indicar indirectamente qu cantidad de la sustancia que nos interesa est

presente en la muestra

Fuente de luz
La fuente de luz que ilumina la muestra debe cumplir con las siguientes condiciones:
estabilidad, direccionabilidad, distribucin de energa espectral continua y larga vida.
Las fuentes empleadas son: lmpara dewolframio (tambin llamadotungsteno),lampara
de arco dexenn y lmpara dedeuterio que es utilizada en los laboratorios atmicos.
Monocromador
El monocromador asla las radiaciones delongitud de onda deseada que inciden o se
reflejan desde el conjunto, se usa para obtener luz.
monocromtica.
Est constituido por las rendijas de entrada y salida,colimadores y el elemento de
dispersin. El colimador se ubica entre la rendija de entrada y salida. Es unlente que
lleva el haz de luz que entra con una determinadalongitud de onda hacia unprisma el
cual separa todas las longitudes de onda de ese haz y la longitud deseada se dirige hacia
otra lente que direcciona ese haz hacia la rendija de salida.
ompartimiento de Muestra
Es donde tiene lugar la interaccin con lamateria (debe producirse donde no haya
absorcin ni dispersin de las longitudes de onda). Es importante destacar, que durante
este proceso, se aplica laley de lambert-beer en su mxima expresin, con base en sus
leyes de absorcin, en lo que concierne al paso de la molcula defundamentalmentalexcitado.

Detector
El detector, es quien detecta unaradiacion y a su vez lo deja en evidencia, para posterior
estudio. Hay de dos tipos:
a) los que responden a fotones
b) los que responden al calor
Fotodetectores
En los instrumentos modernos se encuentra una serie de 16 fotodetectores para percibir
la seal en forma simultnea en 16 longitudes de onda, cubriendo el espectro visible.
Esto reduce el tiempo de medida, y minimiza las partes mviles del equipo.
Cubetas

Cubetas de espectofotometra. En un primer plano, dos de cuarzo aptas para el trabajo

con luz ultravioleta; en segundo plano, de plstico, para colorimetra (es decir,
empleando luz visible).
Son los recipientes donde se depositan las muestras liquidas a a analizar. Dependiendo
de la longitud de onda a medir, sern hechas de cuarzo, vidrio o de material plstico. Se
caracterizan por tener dos paredes correspondiente a los lados opticos por donde cruza
el haz de luz.

Qu se entiende por curva de calibracin?

Se trata de una curva de referencia construida con cantidades conocidas de una
sustancia (por ejemplo la albmina srica bovina que vimos antes) que se utiliza para
determinar la cantidad de esta sustancia (protenas) presente en una muestra incgnita.
En muchas determinaciones se cumple una relacin proporcional entre la magnitud o

intensidad de color que da una reaccin y la cantidad del reactivo que la provoca. Por
ejemplo: si la presencia de 10 ug de protenas en una solucin genera la aparicin de un
color azul plido cuando es agregada a una mezcla reactiva, la presencia de 20 ug de
protena dar lugar a que la solucin se torne azul ms oscuro y as sucesivamente.

Para realizar la experiencia debemos preparar unas diluciones seriadas de albmina

srica bovina como las que hicimos antes (ser nuestro estndar o patrn) y
dispondremos as de por lo menos 5 concentraciones, luego realizaremos la reaccin
qumica correspondiente para desarrollar color y mediremos la intensidad de color de
cada solucin. Por ej., partiendo de una solucin madre de 1mg/ml, tendremos 6 tubos
as:

La relacin entre intensidad de color y concentracin de la sustancia (una medida de la

cantidad de esa sustancia) es proporcional y as, si se grafica el valor de intensidad de
color medido con un aparato adecuado (espectrofotmetro o colormetro) en funcin de
las concentraciones crecientes de la sustancia se obtiene una recta. Es decir, a mayor
cantidad de protena, mayor cantidad de producto de reaccin y por lo tanto, mayor
intensidad de color.
Curva de Calibracin
Dado que se ha trabajado con datos reales, los grficos que se obtienen no son tan
ideales, pero esta situacin no es un obstculo ya que dentro de ciertos valores es
posible trazar la recta ms probable que une una serie de puntos, con el uso de los
programas de clculo de las computadoras.

Hay que advertir que una respuesta lineal no se obtiene en todo el rango de
concentraciones posibles sino dentro de un conjunto de valores que dependen de
numerosos factores dependientes del mtodo de medicin. Por otra parte, este tipo de

curvas no se limita solamente a la determinacin de un elemento o compuesto qumico

sino que tiene mltiples aplicaciones.

BIBLIOGRAFIA
http://es.wikipedia.org/wiki/Espectrofot%C3%B3metro
http://www.quimicaviva.qb.fcen.uba.ar/contratapa/calibracion/calibracion.htm

CONCLUCIONES
En esta practica obtuvimos los conocimientos necesarios para construir una curva de
calibracin, para ello se efectan diluciones de unas muestras de concentracin
conocida y se produce su lectura y el consiguiente establecimiento de una funcin
matemtica (regresin lineal)que relacione ambas; despus, se lee el mismo carcter en
la muestra problema y, mediante la sustitucin de la variable independiente (
absorbancia) de esa funcin, se obtiene la concentracin de esta.