Вы находитесь на странице: 1из 64

UNIVERSIDAD NACIONAL EXPERIMENTAL

FRANCISCO DE MIRANDA
REA CIENCIAS DE LA SALUD
PROGRAMA DE MEDICINA
U.C. MICROBIOLOGA I

MANUAL DE TRABAJOS
PRCTICOS DE MICOLOGA
MDICA
REALIZADO POR: Profa. LEYLA HUMBRA DE HEYLIGER

SANTA ANA DE CORO, 2011

NORMAS DE BIOSEGURIDAD E INDICACIONES A SEGUIR PARA EL TRABAJO


PRCTICO EN EL LABORATORIO DE MICOLOGA
Las tcnicas de laboratorio realizadas para la identificacin de los hongos, deben
llevarse a cabo cumpliendo con todas las normas de bioseguridad establecidas, para
evitar la contaminacin tanto del ambiente como

del personal encargado del

procesamiento. Es por ello que se deben cumplir las siguientes normas:


1. El uso de la bata es de carcter obligatorio.
2. Lavar las manos con agua y jabn antes y despus de cada actividad prctica.

3. No se debe ingerir alimentos ni bebidas en el laboratorio.

4. Mantener apagado el mechero cuando no est en uso, a fin de evitar


quemaduras o calor excesivo.
5. Los productos inflamables (alcohol, ter, etc.) deben mantenerse alejados de la
llama del mechero.
6. NUNCA se debe oler el cultivo de un hongo. Los hongos difieren de las bacterias
en que muchos de ellos producen gran nmero de esporas, que pueden
diseminarse en el aire y ser inhaladas. Los cultivos de hongos filamentosos
(sobre todo los agentes causales de micosis sistmicas cuya va de transmisin
es la inhalatoria) han de ser manipulados en el interior de una cabina de
seguridad biolgica clase II, sin excepciones.

7. Es permisible el manejo de los cultivos de levaduras en la mesa del laboratorio

8. Los cultivos de hongos deben ser sellados con cinta adhesiva para evitar la
contaminacin del laboratorio y deben ser esterilizados en autoclave o bien

Microscopio ptico

pero deben ser tratados como material infeccioso.

eliminarlos en los recipientes adecuados para residuos sanitarios grupo III o de


riesgo.
9. Nunca deben sustraerse cultivos de microorganismos del laboratorio.

10. Cualquier accidente como derrame de reactivos, cortes y quemaduras, deben


comunicarse inmediatamente al Profesor.
11. El orden y la limpieza son esenciales en todas las experiencias de laboratorio.
En

consecuencia,

al

terminar

cada

prctica

se

proceder

limpiar

cuidadosamente el rea de trabajo y descartar el material utilizado envases


dispuestos para tal fin. Todo material contaminado con

material biolgico

(lminas portaobjetos, puntas desechables) debe ser descartado en envases


adecuados que contengan hipoclorito de sodio al 0,5% u otro desinfectante
antes de ser lavado o eliminado.
Indicaciones:

1. Antes de cada prctica el profesor dar una breve introduccin y una


demostracin del trabajo a realizar.

2. Antes de realizar una actividad prctica, el alumno debe haber ledo con
anterioridad el material correspondiente a la misma. No comience a trabajar
hasta que no haya entendido con claridad las instrucciones. Ante cualquier duda
consulte al profesor.
3. Todo el material, especialmente los aparatos delicados, como lupas y

mecanismos.

4. Los alumnos debern

asistir a la actividad prctica equipados con: la gua

prctica, fsforos, tirro y lpices de colores.

Microscopio ptico

microscopios, deben manejarse con cuidado evitando los golpes o el forzar sus

5. Los alumnos no podrn cambiarse de turno o grupo despus de estructurada la


nmina de estudiantes para cada laboratorio e iniciado los trabajos prcticos.

Microscopio ptico

6. Los alumnos deben asistir a la prctica en el horario que les corresponde

El microscopio es un instrumento muy necesario para el microbilogo, ya que


permite la observacin de organismos que no pueden ser apreciados en detalle a
simple vista, es decir, los microorganismos. Existe una gran variedad de microscopios
que, segn la fuente de iluminacin utilizada, se agrupan en:

MICROSCOPIOS PTICOS: La fuente de iluminacin es la luz. Pueden ser:

- De campo claro: Permiten la observacin de preparaciones en su color natural


contrastadas mediante tinciones, resaltadas sobre un fondo ms brillante.
- De campo oscuro: Permiten la observacin de formas celulares que se
destacan brillantes sobre un fondo oscuro. Este efecto se consigue utilizando
diafragmas especiales.
- De contraste de fases: Gracias a la utilizacin de diafragmas y objetivos
especiales, que consiguen aumentarlas diferencias en el ndice de refraccin de las
clulas y el medio que las rodea, permiten la observacin de clulas vivas, ya que no
es necesario realizar ninguna tincin de las mismas.
- De interferencia: Permiten observar clulas vivas sin teir, obtenindose una
imagen en relieve de las mismas.
- De fluorescencia: La fuente de iluminacin proporciona luz ultravioleta que
excita ciertas molculas presentes en las clulas (bien de forma natural o aadidas a la
preparacin) que emiten fluorescencia en el espectro visible.

MICROSCOPIOS ELECTRNICOS: La fuente de iluminacin es un chorro de


electrones y las lentes son electroimanes. Pueden ser:

- De transmisin: Permiten la observacin de muestras teidas con sustancias

denominadas cortes finos. Los electrones no son visibles directamente por lo que stos
se envan a una pantalla que emite fluorescencia ms o menos intensa segn el
nmero de electrones que inciden en ella. Las estructuras celulares que se tian ms
intensamente impedirn el paso de electrones y por lo tanto no permitirn la emisin de

Microscopio ptico

que son resistentes al paso de electrones y cortadas dando lugar a lminas finas,

fluorescencia, por lo que estas estructuras aparecern oscuras en un fondo ms


brillante. Se consiguen entre 10.000 y 100.000 aumentos.
- De barrido: Permiten la observacin de clulas enteras, sin necesidad de cortes
finos, de modo que aparecen los relieves originales y las superficies externas. Alcanzan
entre 1.000 y 10.000 aumentos.

Durante las prcticas de micologa y parasitologa se emplear el microscopio


ptico de campo claro, cuyos componentes fundamentales (mecnicos, de iluminacin
y pticos) se muestran en la figura 1.

Figura

1:

Partes

de

un

microscopio

ptico.

http://cienciasept.blogspot.com/2008/09/caza-de-tesoros-1.html

a. Tubo: Soporta la parte ptica, tiene una longitud variable, segn el fabricante, en
su parte superior se encuentra el ocular y en la inferior el revlver con la serie de
objetivos.

Microscopio ptico

Parte Mecnica: Constituida por:

b. Columna o Brazo: Une el tubo con el pie, sta es la parte por la que se debe
tomar el microscopio para transportarlo.
c. Revlver: Es el extremo inferior del tubo donde estn colocados los objetivos
tienen movimientos de rotacin alrededor de su eje.
d. Platina: Sobre ella son colocadas las preparaciones. Es plana y presenta un
orificio central que permite el paso de los rayos luminosos, posee pinzas que aseguran
la inmovilidad de las preparaciones y un carro provisto de dos tornillos para
desplazarlas en direccin lateral y antero-posterior, con lo cual se logra visualizar toda
la preparacin.
e. Tornillo Macromtrico: Mueve la platina hacia arriba y hacia abajo.
f. Tornillo Micromtrico: Permite enfocar con precisin.
g. Pie: Sirve de base al microscopio y tiene el peso suficiente para dar estabilidad
al aparato.
Parte ptica: Constituida por:
a. Fuente de luz: Puede ser un espejo mvil con dos caras: una plana que se
utiliza para la iluminacin con luz solar y otra convexa para luz artificial. Su funcin es
dirigir los rayos luminosos hacia el eje ptico.
b. Condensador: Se encuentra colocado exactamente en el eje ptico del
microscopio, su finalidad es condensar la luz en un punto sobre la platina, donde va a
ser colocado la preparacin. Est constituido por un diafragma-iris para controlar la
cantidad y el ngulo de los rayos luminosos y por un sistema de lentes. Posee un
aparato enfocador, que consiste en un pin y una cremallera, que permiten bajar y
subir el condensador.
c. Objetivos: Son tubos que contienen en su interior un sistema de lentes de
diferentes aumentos, adems genera una imagen real e invertida del objeto. Los

objetivos pueden ser:


-

Secos: Son los que no necesitan interponer ninguna sustancia entre el


objetivo y la preparacin. La preparacin y la lente estn separadas por aire
(lupa, 10x-40x).

Microscopio ptico

microscopios suelen tener 3 o 4 objetivos colocados en la parte inferior del tubo. Los

Inmersin: En ellos se interpone un lquido entre la preparacin y la lente


(aceite de inmersin, 100x).

d. Ocular: Es una lente situada cerca del ojo del observador. Ampla la imagen del
objetivo. Su misin es captar y ampliar la imagen proporcionada por los objetivos. Un
microscopio puede tener uno o varios oculares: monocular, binocular o trilocular.
Actualmente se utilizan los binoculares porque son ms cmodos y tienen mejor
calidad de imagen.
Manejo del Microscopio ptico
1. Ajustar la iluminacin del campo de tal forma que ste quede bien iluminado,
para lo cual se coloca el objetivo de menor aumento, se abre todo el diafragma-iris y se
sube totalmente el condensador.
2. Montar la preparacin sobre la platina, fijarla de tal modo que el centro de la
preparacin coincida con el orificio central de la platina por donde pasarn los rayos
luminosos.
3. Observar lateralmente y con el tornillo macromtrico, bajar el tubo hasta que el
objetivo de menor aumento quede muy cerca de la preparacin.
4. Observar por el ocular, subir lentamente el tubo con el tornillo macromtrico
hasta que aparezca la preparacin y aclarar la imagen con el tornillo micromtrico. Si
una vez obtenida la imagen, la iluminacin es muy intensa, sta puede disminuirse
cerrando el diafragma-iris del condensador hasta que su margen sea igual al tamao
del lente posterior del objetivo. Con los objetivos secos, el condensador debe estar
abajo y el diafragma no muy abierto.
5. Al encontrar una parte del campo que merezca mayor anlisis de detalles, se
cambiar para un aumento mayor de la siguiente manera:
a. Centrar en el campo la parte que desea estudiar, ya que al cambiar el

del mismo.
b. Girar el revlver hasta que el objetivo de mayor aumento seleccionado quede
en la posicin indicada.

Microscopio ptico

objetivo, el campo se reduce y se corre el riesgo de que el objeto quede fuera

c. Enfocar la preparacin con el micromtrico si no se ha movido el tubo y con


el macromtrico si este se movi, procediendo de la misma forma que para el
enfoque con menor aumento.
d. En la medida que se incrementan los aumentos, la cantidad de luz requerida
va siendo mayor por lo que debe corregirse el diafragma-iris y el
condensador.
Cuando se desea utilizar el objetivo de inmersin (100x), se procede de la
siguiente manera:
a. Abrir el diafragma-iris y subir al mximo el condensador.
b. Colocar una gota de aceite de inmersin sobre la preparacin.
c. Colocar el objetivo de inmersin en su posicin efectiva, siguiendo el eje
ptico.
d. Bajar cuidadosamente el tubo por medio del tornilllo macromtrico, bajo
control visual lateral externo, hasta que el objetivo entre en contacto con el
aceite de inmersin, sin tocar la lmina.
e. Observar a travs del ocular y enfocar con mucho cuidado con el tornillo
micromtrico hasta que sea posible ver bien la preparacin.
Despus de utilizar el microscopio ptico se deber proceder de la siguiente
manera:
1. Apagar la lmpara
2. Quitar la lmina.
3. Bajar la platina.
4. Colocar el objetivo de menor aumento.
5. Mover el carro para que quede en la posicin correcta.

7. Limpiar los oculares y los objetivos.


8. Colocar el forro.

Microscopio ptico

6. Desconectar el cable que alimenta de corriente a la lmpara.

PRACTICA NMERO 1: CULTIVOS FNGICOS

OBJETIVOS:
Al finalizar la prctica el estudiante estar en la capacidad de:
Diferenciar los diferentes tipos de medios de cultivo.
Diferenciar el crecimiento de levaduras y mohos en medios de cultivo en
placa y en tubo.
Sealar los pasos para realizar un microcultivo.
Realizar el aislamiento de hongos contaminantes del medio ambiente: aire
agua y tierra.

MEDIO DE CULTIVO

Uno de los sistemas ms importantes para la identificacin de microorganismos


es observar su crecimiento en sustancias alimenticias artificiales preparadas en el
laboratorio. Al conjunto de estas soluciones lquidas o slidas que contienen los
nutrientes necesarios para el crecimiento de los microorganismos se les conoce como
medio de cultivo.
El medio de cultivo es aquella solucin que cuenta con los nutrientes necesarios
para recuperar, multiplicar, aislar e identificar los microorganismos (bajo condiciones
favorables de temperatura y pH, exento de todo microorganismo contaminante), as
como efectuar pruebas de susceptibilidad.
Los medios de cultivo pueden clasificarse:
Segn su consistencia:

a. Lquidos
b. Slidos

Microscopio ptico

Los medios lquidos son infusiones preparadas bien sea colocando carne picada
en agua o disolviendo en esta un extracto de carne comercializado, no llevan ninguna
solucin solidificante. Contienen protenas, factores esenciales de crecimiento y
oligoelementos. A estos medios se les pueden aadir otros nutrientes como peptonas y
glucosa as como cloruro de sodio y un tampn de pH.
Los medios slidos estn constituidos por un medio lquido ms una solucin
gelificante, como el agar en polvo que se disuelve por ebullicin, que los solidifica.
Pueden ser trasvasados en tubos o placas de Petri. Estas ltimas son recipientes de
vidrio o plstico transparente con una tapa y ofrecen una gran superficie para la
siembra.

Segn su aporte nutritivo:

a. Bsicos
b. Complejos
Los medios bsicos contienen las sustancias mnimas para el crecimiento de
hongos metablicamente no exigente. Pueden contener agar o no dependiendo si se
quieren slidos o lquidos, respectivamente; peptonas, glucosa. Deben poseer un pH y
una osmolaridad adecuada para la multiplicacin de los hongos. Estos medios tambin
pueden ser utilizados como base en la preparacin de otros medios como los
enriquecidos, selectivos, entre otros.
Los medios enriquecidos pueden contener suero, sangre o factores esenciales
especficos como vitaminas o cofactores para el crecimiento de hongos exigentes en
requerimientos nutritivos y que no crecen bien en los medios bsicos.

Segn su finalidad:

tcnica de agotamiento, han de ser slidos. Ejemplo: Agar Sabouraud, Agar


Lactrimel

Microscopio ptico

a. Medios de aislamiento: Utilizados para el aislamiento de levaduras por la

10

b. Medios selectivos: Son aquellos que permiten la recuperacin de un


hongo en especfico e inhiben el crecimiento de otro. Ejemplo, Sabouraud con
clicoheximida (inhibe hongos contaminantes como Aspergillus, etc).
c. Medios selectivos diferenciales: son aquellos medios utilizados para
recuperar o aislar un hongo en especfico, por ello, para diferenciar las distintas
colonias, se les aade sustancias que confieren un color diferente a las colonias
segn la distinta actividad metablica. Para este propsito se utilizan azcares
como el manitol, la lactosa, sorbitol y otros, junto a un indicador de pH como rojo
neutro, azul de bromotimol, etc. Ejemplo. CHROMagar Candida utilizado en la
identificacin de Candida albicans, Candida krusei y Candida tropicalis.
Los medios de cultivo utilizados en micologa contienen nutrientes suficientes
para

asegurar el desarrollo

de

los hongos (carbono,

nitrgeno,

vitaminas,

oligoelementos, etc). El pH ligeramente cido tiende a facilitar el crecimiento de los


hongos e inhibir al mismo tiempo el desarrollo de otros microorganismos.
A los medios de cultivo se les puede aadir antibiticos antibacterianos para
inhibir el crecimiento de las bacterias saprfitas que suelen contaminar las muestras.
Los ms usados son el Cloranfenicol y la Gentamicina. Se aade tambin actidiona
(Cicloheximida) que inhibe el desarrollo de hongos saprfitos ambientales. Los medios
cuya composicin contengan actidione no debe ser utilizados para el aislamiento de
Cryptococcus neoformans, ya que inhiben su crecimiento.
Entre los medios ms empleados en la Micologa se encuentran:
Medio Sabouraud Dextrosa (SAB):
Contiene un 2% de glucosa y es ligeramente cido (pH=6.9), se considera el

aislarse en el laboratorio de micologa clnica. Es el medio estndar para observar la


morfologa tpica de los hongos, pero no es el medio ideal de crecimiento o para
estudiar la esporulacin. Permite el crecimiento de actinomicetos aerobios. Se utiliza
indistintamente en tubo o en placa.

Microscopio ptico

medio estndar para recuperar y mantener una amplia variedad de hongos que pueden

11

Medio Sabouraud con Cloranfenicol y Gentamicina:


Es el medio Sabouraud clsico con la incorporacin de los antibiticos
Gentamicina y Cloranfenicol, que permiten el crecimiento de casi todos los hongos
filamentosos y levaduras al mismo tiempo que inhiben a una gran mayora de bacterias.
Se utiliza en tubo o en placa.
Agar Lactrimel de Borelli:
Se emplea para favorecer la produccin de pigmentos y la esporulacin de la
mayora de dermatofitos. Contiene harina de trigo, leche descremada en polvo, agar,
miel y antibitico.
Los medios de cultivo pueden ser preparados en placa o en tubo. Los medios en
placa tienen la ventaja de ofrecer mayor superficie para el aislamiento pero, para
soportar la deshidratacin durante el largo perodo de incubacin a que van a ser
sometidos (un mes o ms), has de contener una gruesa capa de medio (25 a 40 ml).
Son ms peligrosos a la hora de su manipulacin y fciles de contaminar. Mientras que
los medios en tubo tienen una superficie de trabajo mucho ms pequea, pero ofrecen
mxima seguridad en su manipulacin y buena resistencia a la deshidratacin y a la
contaminacin. (Figura 2 y 3)

Figura 3: Medio de cultivo en tubo

A la hora de elegir un medio de cultivo adecuado se debe tener en cuenta el tipo


de muestra y los microorganismos fngicos que requieren ser aislados. Si la muestra

Microscopio ptico

Figura 2: Medio de cultivo en


placa de Petri.

12

procede de zonas presuntamente contaminadas, es fundamental incluir, junto a los


medios normales, medios que contengan sustancias inhibitorias de bacterias y hongos
saprofitos (cloranfenicol, gentamicina, cicloheximida).
Tanto la muestra como las placas y tubos que se van a sembrar deben
manipularse por medidas de seguridad y para evitar contaminaciones ambientales, los
cultivos con crecimiento micelial (temperatura ambiente) de Histoplasma capsulatum,
Paraccoccidioides brasiliensis y Coccidioides posadasii o C. immitis deben ser
manipulados en campana de flujo laminar. Han de rotularse adecuadamente, con el
nmero de la muestra y la fecha en que se realiza la siembra. Las placas se precintan
con cinta de parafilm, en la que se realizan un par de aberturas, y los tubos se dejan
con el tapn de rosca a medio cerrar (para mantener la aerobiosis).
Para realizar un cultivo fngico, generalmente los especmenes se colocan sobre
la superficie del medio de cultivo y se conservan a temperatura ambiente (26 a 27 C);
en caso de micosis sistmicas, es mejor a 30-37 C. Las levaduras se siembran con
tcnica de agotamiento en placa. Los pelos y escamas se disponen en fragmentos en
diferentes puntos de la superficie del medio. En lquidos, heces y pus se deben
sembrar aproximadamente 0,5 a 1,0 ml por tubo. Las levaduras se desarrollan en 24 a
48 horas, los contaminantes en dos a cuatro das y la mayora de los hongos
patgenos requiere una a dos semanas o hasta un mes para su crecimiento.
La identificacin de los hongos se basa en el examen macroscpico de la
colonia y en sus caractersticas microscpicas. Semejanzas macroscpicas como la
forma de la colonia, el color de la superficie, la textura y la produccin de pigmentos
son muy tiles para la identificacin (cuadro 1). En los medios de cultivo las levaduras
forman colonias hmedas, cremosas, opacas o pastosas, y los hongos filamentosos

En general, la morfologa microscpica de los hongos es estable y presenta


pocas variaciones. La identificacin definitiva se basa en la forma caracterstica,
mtodo de produccin y ordenamiento de las esporas, siendo tambin importante

Microscopio ptico

producen colonias algodonosas, lanosas o pulverulentas.

13

conocer el tamao y la disposicin de las hifas en el caso de los hongos filamentosos,


en los levaduriformes se observa la presencia de blastoconidias, seudohifas,
clamidosporas. (Cuadro 2)
CARACTERSTICAS
MACROSCPICAS

HONGO FILAMENTOSO

HONGO LEVADURIFORME
Colonia

COLOR

Reverso
Pigmento del medio

TAMAO DE LA COLONIA
Dimetro
Aterciopelada,
ASPECTO

algodonosa,

Cremosa

pulverulenta

Cuadro 1. Descripcin macroscpica de los hongos

CARACTERSTICAS
MICROSCPICAS

HONGO FILAMENTOSO

SEPTADO
ASEPTADO
SEPTADO
ASEPTADO

HIALINO
MICELIO

HONGO LEVADURIFORME

DEMATIACEO
GRUESO

OBSERVACIN DE
BLASTOCONIDIAS,
SEUDOHIFAS Y
CLAMIDOSPORAS

DELGADO
PRODUCCIN, TAMAOY
DISPOSICIN DE LAS
CONIDIAS

DEPENDIENDO DE LA ESPECIE

Cuadro 2. Descripcin microscpica de los hongos

La preparacin del material para la observacin microscpica puede realizarse

PREPARACIN EN FRESCO
Este procedimiento es el que se utiliza en la mayora de los laboratorios, ya que
las muestras se preparan con facilidad y rapidez y adems permite identificar muchas

Microscopio ptico

en fresco, con cinta de celofn adhesiva o mediante cultivo en lmina o microcultivo.

14

de las especies de hongos ms frecuentes. El mayor inconveniente de la observacin


en fresco es que se puede alterar el ordenamiento caracterstico de las esporas al
presionar con el cubreobjetos, por lo que este procedimiento no es vlido en los casos
en que es necesario conocer la disposicin de las esporas.
Se realiza empleando el procedimiento descrito a continuacin:
1. Seleccionar una colonia aislada.
2. Calentar el asa en aguja (al rojo vivo) para esterilizar, dejar enfriar.
3. Extraer un fragmento de la colonia que contenga adems un poco de agar en
la parte inferior.
4. Depositar el fragmento extrado sobre un portaobjetos en el cual, previamente,
se ha depositado una gota de azul de lactofenol.
5. Cubrir con un portaobjeto y presionar suavemente para dispersar la colonia y
el agar; de esta forma, la muestra est disponible para su observacin al
microscopio.
PREPARACIN CON CINTA DE CELOFN ADHESIVA
Es un mtodo rpido para observar microscpicamente los mohos sin alterar el
arreglo de sus conidias.
Una de las desventajas es que si la cinta transparente no se presiona con
suficiente firmeza sobre la superficie de la colonia, la muestra no es adecuada, ya que
al no quedar bien adherida la cinta, las esporas o las hifas no se pueden identificar.
En los casos en que mediante este mtodo no se observen esporas deber
realizarse la preparacin en fresco.

1. Colocar una gota de azul de lactofenol sobre una lmina portaobjeto.


2. Cortar un pedazo de cinta adhesiva transparente (2 a 3 cm) y fijarlo a un asa
en aguja.

Microscopio ptico

El procedimiento se lleva a cabo como sigue:

15

3. Colocar la cinta sobre la superficie de la colonia de moho, haciendo presin.


4. Colocar la cinta sobre la lmina, cubrir con una laminilla.
5. Observar al microscopio.
MTODO DE MICROCULTIVO (Mtodo de Riddel):
Tambin llamado cultivo en lmina. Este cultivo se realiza una vez recuperado el
hongo del espcimen clnico. Es til para la identificacin de especies de hongos
filamentosos (exclusivamente).
La tcnica de microcultivo se realiza de la siguiente manera:
1. Introducir en una placa de Petri un papel absorbente, una varilla de vidrio en
forma de U y una lmina portaobjeto. Esterilizar con calor seco.
2. Tomar una placa de Petri con agar Sabouraud o Lactrimel y bajo condiciones
de esterilidad cortar con un bistur cuadros de 1 cm. de lado y colocar uno de
ellos sobre la lmina portaobjeto previamente esterilizada en el paso 1.
3. Inocular en el centro de los cuatro lados del agar con el hongo en estudio y
colocar encima una laminilla o lmina cubreobjeto (Figura 4).
4. Humedecer el papel absorbente con aproximadamente 5 ml de agua destilada
estril, para evitar desecacin.
5. Incubar a temperatura ambiente. La colonia crecer por debajo de la
superficie del cubreobjeto. Se examina el montaje peridicamente a simple
vista para determinar si la colonia ha crecido o se haya contaminado, se deja
por un lapso mnimo de 15 das.
6. Cuando es evidente el crecimiento, se retira cuidadosamente el cubreobjeto
con pinzas estriles y se coloca en un portaobjeto que contiene una gota de
azul de lactofenol. Si se desea un montaje permanente, se limpia la superficie

aplica esmalte para uas color claro.


7. Observar las dos lminas preparadas al microscopio ptico.

Microscopio ptico

del portaobjeto e inmediatamente adyacente al borde del cubreobjeto se

16

Lmina
cubreobjeto
Cubo de agar

Inculo del hongo a los


cuatro lados del cubo de
agar
Lmina Portaobjeto
Placa de Petri

Varilla de vidrio en
forma de U

Figura 4: Placa de microcultivo. Tomado de


Arenas.
Micologa
Mdica
Ilustrada.
McGrawHill. Mxico. 2003

HONGOS CONTAMINANTES
Los hongos filamentosos y levaduras son en su mayora saprfitos, hallndose
libres en la naturaleza, especialmente en la materia orgnica en descomposicin. Las
condiciones necesarias para que un hongo crezca en una superficie son: existencia de
esporas, base nutriente, humedad y temperatura entre 4 y 38 oC.
El crecimiento de hongos en sistemas de aire acondicionado y edificios puede
producir en sus habitantes determinadas patologas entre las que cabe destacar asma
y alveolitis alrgicas. La contaminacin ambiental por hongos en el medio ambiente y
en interior de edificios, es debida bsicamente a hongos filamentosos y levaduras.
Procedimiento para el aislamiento de hongos contaminantes
Aire:
Materiales: Placa de Petri con medio de cultivo Sabouraud o Lactrimel.

mediante 2 procedimientos:

Microscopio ptico

Las placas sern expuestas en diferentes ambientes (cerrados y externos),

17

a. Captura por sedimentacin:


1. Rotular una placa de Petri con el nmero del equipo de trabajo, profesor,
turno, fecha y lugar.
2. Destapar la placa y dejarla abierta por 10 minutos.
3. Cerrar la placa e incubarla a temperatura ambiente hasta la prxima
actividad prctica.

b. Captura por choque sobre la superficie de agar:


1. Rotular una placa de Petri con el nmero del equipo de trabajo, profesor,
turno, fecha y lugar.
2. Destapar la placa y agitarla 10 veces.
3. Cerrar la placa e incubarla a temperatura ambiente hasta la prxima
actividad prctica.
Agua:
Materiales: Un tubo con tapa de baquelita, estril; 1 placa de Petri con Agar
Sabouraud o Lactrimel, pipeta Pasteur, hisopo estril o asa de siembra.
1. Recolectar aproximadamente 10 ml de agua (poceta, filtros, entre otros.
Segn le indique el profesor), con la ayuda de la pipeta Pasteur y
colocarlos dentro del tubo con tapa de baquelita estril.
2. Rotular el tubo con el nmero del equipo de trabajo, profesor, turno, fecha y
lugar.
3. Sembrar la muestra en una placa de Petri con medio Sabouraud o
Lactrimel segn le indique el profesor.
4. Rotular la placa con el nmero del equipo de trabajo, profesor, turno, fecha

5. Incubar la placa a temperatura ambiente hasta la prxima actividad


prctica.

Microscopio ptico

y lugar. Sellar la placa con papel parafilm o tirro alrededor de la misma.

18

Tierra:
Materiales: 1 placa de Petri vaca y estril, 1 placa de Petri con medio de cultivo
Sabouraud o Lactrimel, 1 baja lengua estril, 1 tubo con tapa de baquelita que
contenga 1 ml de solucin salina fisiolgica (estril).
1. Recolectar la tierra con baja lengua estril y colocarla en la placa de Petri
estril, vaca.
2. Llevar al laboratorio. Agregar una porcin de tierra con la ayuda de un baja
lengua estril dentro del tubo que contiene 1 ml de solucin salina
fisiolgica (SSF), mezclar para homogeneizar.
3. Agregar esta mezcla (Tierra+SSF) en la superficie de la placa de Petri con
agar Sabouraud o Lactrimel.
4. Rotular la placa con el nmero del equipo de trabajo, profesor, turno, fecha
y lugar. Sellar la placa con papel parafilm o tirro alrededor de la misma.
5. Incubar la placa a temperatura ambiente hasta la prxima actividad
prctica.
Luego de la incubacin por una semana a temperatura ambiente, realizar el
estudio macroscpico de las colonias aisladas (a simple vista), anotando: color,
presencia de pigmento, textura, bordes de la colonia. Realizar tambin el estudio
microscpico a travs del reconocimiento de las especies por medio de la

Microscopio ptico

morfologa de las esporas.

19

ACTIVIDAD PRCTICA:
1. Describa las caractersticas macroscpicas de un hongo filamentoso y de un
hongo levaduriforme en medio de cultivo preparado en tubo y en placa de Petri,
siguiendo el siguiente esquema:
CARACTERSTICAS
MACROSCPICAS

HONGO FILAMENTOSO

HONGO LEVADURIFORME

COLOR

TAMAO DE LA COLONIA

ASPECTO

2. Describa las caractersticas microscpicas de un crecimiento micelial y uno


levaduriforme en lminas proporcionadas por el profesor, siguiendo esquema.
Dibuje las estructuras observadas.

CARACTERSTICAS MICROSCPICAS
HONGO
FILAMENTOSO

HONGO
LEVADURIFORME

MICELIO

PRODUCCIN, TAMAOY DISPOSICIN DE LAS


CONIDIAS

3. Realizar el aislamiento de hongos contaminantes del medio ambiente: aire, agua y

Microscopio ptico

tierra.

20

PRCTICA NRO 2: INMUNODIAGNSTICO DE LAS MICOSIS.

OBJETIVOS:
Al finalizar la prctica el estudiante estar en la capacidad de:
Sealar la importancia de las pruebas inmunolgicas en el diagnstico de
las micosis que afectan al hombre en nuestro medio.
Interpretar las pruebas de intradermorreaccin (IDR) en el diagnstico de las
micosis.
Describir e interpretar la tcnica de Inmunodifusin Doble (IDD) en el
diagnstico de las micosis.
Correlacionar los resultados obtenidos de la impresin clnica, el diagnstico
epidemiolgico, las pruebas intradrmicas y la serologa para realizar un
diagnstico adecuado de las micosis sistmicas.

INMUNODIAGNSTICO DE LAS MICOSIS


El diagnstico de las micosis se realiza mediante el estudio micolgico, el cual
consiste en la realizacin del examen directo de muestras clnicas y el aislamiento e
identificacin de los agentes etiolgicos en los medios de cultivos. Sin embargo, en
ausencia de una muestra clnica representativa, como es el caso de algunos pacientes
con micosis sistmicas, es de gran ayuda los datos epidemiolgicos y la aplicacin de
otras tcnicas diagnsticas, tales como estudios inmunolgicos, los mismos evalan
tanto la respuesta celular y humoral del paciente.

Se estudia mediante la reaccin de la hipersensibilidad retarda de tipo IV; estas


son reacciones inflamatorias las cuales se caracterizan por una infiltracin
principalmente con fagocitos. Estas reacciones se estudian haciendo uso de las
pruebas intradrmicas (IDR) utilizando antgenos obtenidos a partir de diferentes

Microscopio ptico

INMUNIDAD CELULAR

21

formas (micelial o levaduriforme) de los hongos causantes de las micosis. El antgeno


se inyecta en volumen de 0,1 c.c., por va intradrmica, en la cara anterior del
antebrazo (Figura 5) y la reaccin se observa a las 48 horas. Se considera positiva si
se obtiene una induracin igual mayor de 5 mm. de dimetro. (Figura 6)

Figura 5: Colocacin intradrmica de antgenos


fngicos.

Tcnica de Sokal
La IDR se utiliza bsicamente en estudios epidemiolgicos, para investigar la
existencia de infeccin subclnica en una poblacin y rara vez como orientacin
diagnstica, ya que una reaccin positiva de 5 mm. de dimetro o ms, significa que la

Microscopio ptico

Figura 6: Lectura de prueba intradrmica.

22

respuesta inmunitaria del paciente est intacta y slo seala exposicin al agente. Por
el contrario, una reaccin negativa no necesariamente excluye infeccin y se puede
observar en pacientes con casos de micosis diseminadas, lo que indica un estado de
anergia de la respuesta inmunitaria celular. La IDR se considera una prueba auxiliar en
el diagnstico, pronstico y valoracin del estado inmunitario de los pacientes con
micosis sistmicas.

Las pruebas intradrmicas ms utilizadas en nuestro medio son las siguientes:


Candidina:
Antgeno obtenido a partir de la levadura Candida albicans. Resulta positiva en
quienes han tenido contacto previo con el hongo; no indica enfermedad; en adultos la
positividad es de 60%. En casos diseminados puede ser negativa.
Esporotriquina:
Antgeno obtenido a partir de la forma levaduriforme de Sporothrix schenckii. En
presencia de lesiones clnicas la esporotriquina es diagnstica en un alto porcentaje de
los casos. Las pruebas positivas perduran por aos en sujetos que viven en zonas
endmicas; un resultado positivo en personas sin antecedentes de enfermedad sugiere
contacto previo con el hongo, probablemente por va pulmonar, por lo que es til en
estudios epidemiolgicos. Resulta negativa en ausencia de infeccin o en pacientes
anrgicos.
Histoplasmina:
Glicoprotena que se prepara a partir de la forma micelial de Histoplasma
capsulatum. Una respuesta positiva indica infeccin presente o pasada. Es positiva en

histoplasmina puede traducir una ausencia de infeccin o un estado anrgico del


paciente, ya sea por una histoplasmosis diseminada o por la presencia de alguna
enfermedad intercurrente.

Microscopio ptico

50 a 80% en personas que habitan reas endmicas. Una respuesta negativa a la

23

Paracoccidioidina:
Se prepara a partir de la forma micelial y levaduriforme de Paracoccidioides
brasiliensis. Se utiliza en estudios epidemiolgicos y para evaluar la respuesta del
organismo al tratamiento sobre todo en aquellos casos en los cuales la respuesta a la
paracoccidioidina antes del tratamiento fue negativa.
Coccidioidina:
Existen dos tipos de antgenos fabricados a partir de Coccidioides posadasii o C.
immitis utilizados en el estudio de hipersensibilidad retardada. La esferulina, fabricada a
partir de las esfrulas y la coccidioidina a partir de la forma filamentosa o micelial del
hongo. Es positiva 2 a 3 semanas despus del inicio de los sntomas y puede persistir
durante aos. En pacientes sintomticos la positividad a la IDR se considera de buen
pronostico; mientras que su negatividad se traduce en una inadecuada respuesta
celular, anergia y por lo tanto, mal pronstico.

INMUNIDAD HUMORAL

La inmunidad humoral en las micosis se estudia mediante tcnicas ideadas con


el fin de revelar in vitro las interacciones especficas que tienen lugar cuando se
mezclan antgenos y anticuerpos homlogos en proporciones adecuadas.

Las tcnicas de laboratorio usadas en la seccin de micologa para el estudio de


la inmunidad humoral del paciente son: pruebas de inmunoprecipitacin tales como
inmunodifusin

doble

(IDD),

inmunoelectroforesis

contrainmunoelectroforesis;

pruebas de aglutinacin de partculas de ltex, fijacin de complemento (FC) e

La tcnica IDD se fundamenta en los principios de doble difusin descritos por


Oudin y Ouchterlony. Consiste en la determinacin de anticuerpos especficos contra
extractos antignicos de los hongos causantes de micosis, los cuales migran hasta un
punto, en el que interaccionan originando bandas de precipitacin, que son

Microscopio ptico

inmunoanlisis enzimtico (IAE).

24

evidenciadas mediante tincin de protenas. La especificidad de esta banda se


corrobora comparando la banda producida por el suero del paciente con la originada
por el suero de referencia; si ambas se fusionan formando un arco continuo, se
produce la llamada lnea de identidad, que se traduce en un resultado positivo,
poniendo en evidencia que el paciente posee anticuerpos especficos contra el
antgeno en estudio. Si la banda del suero del paciente se contina con la del suero
control pero sin fusionarse por completo, se denomina banda de identidad parcial,
originada porque los anticuerpos del suero de paciente reaccionan en una forma
incompleta con los antgenos fngicos y puede deberse a reacciones cruzadas con
fracciones antignicas comunes a varios hongos. La banda de identidad parcial no se
interpreta

como

positiva,

pero

debe

considerarse

realizar

otras

pruebas

complementarias como la fijacin de complemento o inmunoanlisis enzimtico para


evaluar la especificidad de los anticuerpos. Por otra parte, si no se produce banda de
precipitacin en el suero del paciente o si esta se entrecruza con la del suero de
referencia (banda de no identidad), constituye un resultado negativo (Figura 7).

Lneas de identidad

Lneas de identidad
parcial

Lneas de no
identidad

Figura 7. Reacciones de Identidad, identidad parcial y no identidad


usando suero control. Tomado de:
http://www.monografias.com/trabajos911/interaccion-antigenoanticuerpo/interaccion-antigeno-anticuerpo.shtml.

1.- Enumerar lminas portaobjetos limpias y secas (25x75mm) con lpiz de


diamante.

Microscopio ptico

Procedimiento de la IDD:

25

2.-Adicionar a cada lmina 3 ml de agarosa fundida al 1% (preparada con agua


destilada) y dejar solidificar a temperatura ambiente.
3.- Labrar en el gel el diagrama para IDD (Figura 8), orificio central de un (1) mm
de dimetro para el antgeno y seis orificios perifricos de cuatro (4) mm de
dimetro para los sueros a ensayar.

1
6

1
2

1
2

3
4

Figura 8. Diagrama para Inmunodifusin Doble con sueros de


referencia en el estudio de micosis subcutneas y sistmicas. 1,4:
Suero control positivo para el antgeno a evaluar. 2,3,5 y 6: Suero de
paciente. O antgeno a evaluar.

4.-.Agregar 40 l de los sueros controles y sueros de los pacientes a evaluar,


seguidamente agregar 10 l de antgeno, en los pozos correspondientes.
5.- Colocar las lminas en cmara hmeda (placa de Petri con papel de filtro
humedecido con agua destilada), por 24 horas a temperatura ambiente y luego
por 24 horas a 4 C. Luego de transcurrido este tiempo realizar la lectura
preliminar.
6.- Sumergir las lminas en solucin de Citrato Trisdico al 5% por 90 minutos.
7.- Lavar las lminas con agua de chorro y sumergirlas

en placas de Petri

por completo la lmina) durante 48 horas (cambiando la solucin tres veces al


da).

Microscopio ptico

conteniendo Solucin Salina Fisiolgica 0,85% (volumen suficiente que cubra

26

8.- Lavar las lminas con agua destilada y cubrirlas con papel de filtro
humedecido con agua destilada. Colocarlas en estufa a 50-60 C hasta obtener
una deshidratacin total.
9.- Colorear las lminas con solucin colorante de protenas (Amidoschwarz)
durante 5 a 10 minutos y decolorarlas con Acido Actico Glacial al 4% hasta
obtener visualizacin de las bandas.

Lectura e interpretacin de resultados:


Un resultado es considerado positivo al observar bandas de identidad. Las
muestras que resulten con bandas de identidad parcial deben ser verificadas mediante
otras pruebas complementarias como Inmunoanlisis enzimtico o la tcnica de fijacin
de complemento. Si no se produce banda de precipitacin en el suero del paciente o si
esta se entrecruza con la del suero de referencia (banda de no identidad), se interpreta
como negativo.
Al ser positivo el resultado es importante que el suero del paciente sea sometido
a la prueba semicuantitativa de la IDD para determinar el ttulo de anticuerpos
presentes en ese suero.
En la IDD semicuantitativa se emplean los mismos antgenos que para la IDD y
la tcnica es similar variando en lo siguiente: Se coloca en el pozo N 1 el suero control
o de referencia, en el N 2 el suero del paciente sin diluir y en los N 3, 4, 5 y 6 el suero
diluido con solucin salina a 1:2, 1:4, 1:8 y 1:16, etc. En el hoyo central se coloca el
antgeno especfico de la micosis a evaluar. El resto del procedimiento se contina
igual al de la IDD (Figura 9). El ttulo del suero del paciente va a ser la ltima dilucin

1/16

1/8
1/4

1/16

1/2

1/8

1/4

1/16

1/2

1/8

S
1/2

1/4

Figura 9: Diagrama para IDD semicuantitativa. Evaluacin de ttulos de anticuerpos. C:


Suero control. S: Suero problema sin diluir. 1/21/16 diluciones del suero. O: Antgeno

Microscopio ptico

donde se observe la lnea de identidad.

27

CORRELACIN

INTERPRETACIN

DE

LA

IDR

IDD

EN

EL

INMUNODIAGNSTICO MICOLGICO.
ESTUDIO

IDR

IDD

Directo y

Positivo:

Positivo:

cultivo:

Estuvo en contacto con el

Presenta anticuerpos

POSITIVO

hongo

precipitantes frente a

RESULTADO

MICOLGICO

Presenta la enfermedad

los antgenos fngicos


Negativo:

Positivo:

Directo y

No estuvo en contacto con

Presenta anticuerpos

cultivo:

el hongo o se encuentra

frente a los antgenos

Positivo

en estado anrgico

fngicos

Presenta la enfermedad

(inmunosuprimido).
Directo y

Positivo:

Negativo:

Estuvo expuesto al

cultivo:

Estuvo en contacto con el

No presenta

hongo. Presenta la

Positivo

hogo

anticuerpos frente a los

micosis puesto que se

antgenos fngicos

hizo la observacin
microscpica del hongo
y aislamiento del mismo
en el medio de cultivo

Directo y

Positivo:

Negativo:

Estuvo expuesto al

cultivo:

Estuvo en contacto con el

No presenta

hongo ms no presenta

Negativo

hogo

anticuerpos frente a los

la enfermedad.

antgenos fngicos
Directo y

Negativo:

Negativo:

El paciente puede:

cultivo:

No estuvo en contacto con

No presenta

1. No presentar

Negativo

el hongo o se encuentra

anticuerpos frente a los

en estado anrgico

antgenos fngicos

enfermedad mictica.
2. Estar

(inmunosuprimido).

inmunosuprimido y
presentar enfermedad

ACTIVIDAD PRCTICA:
1. Realizacin de la tcnica de Inmunodifusin doble. (Demostrativa)
2. Discusin e interpretacin de las pruebas inmunolgicas.

Microscopio ptico

por otro agente.

28

PRCTICA NMERO 3: DIAGNSTICO DE LAS MICOSIS SUPERFICIALES

OBJETIVOS:
Al finalizar la prctica el estudiante estar en la capacidad de:
Establecer la importancia mdica del diagnstico micolgico de las micosis
superficiales.
Realizar el diagnstico micolgico de las micosis superficiales
Describir las caractersticas macro y microscpicas de las especies de
dermatofitos.
Describir las caractersticas macro y microscpicas de colonias de Candida
spp.

Ante la sospecha clnica de una micosis superficial, el clnico tiene que confirmar
la infeccin recurriendo a una serie de procedimientos de laboratorio que incluyen la
deteccin del agente causal en el tejido, por examen directo, y el aislamiento del
patgeno en el cultivo. Al conocer el agente etiolgico se confirma la sospecha clnica
de la micosis, permitiendo as la eleccin del tratamiento especfico y la valoracin del
mismo.

DIAGNSTICO MICOLGICO DE LAS TIAS:

RECOMENDACIONES PARA LA TOMA DE MUESTRA:


La muestra debe ser tomada antes de instituido el tratamiento o cuando ste

para las uas).


Explicarle al paciente que no se coloque el da de la toma de muestra cremas
ni talco porque pueden producir artefactos que obstaculicen la visualizacin
del hongo y dar resultados falsos negativos o positivos.

Microscopio ptico

se ha suspendido previamente (1-2 semanas, para piel o pelo; varios meses,

29

Antes de realizar la toma de muestras de una micosis superficial es


aconsejable examinar las lesiones de la piel y cuero cabelludo, en una
habitacin completamente oscura bajo la luz de Wood (luz ultravioleta de 365
nm. de longitud de onda, que pasa a travs de un filtro de cristal que contiene
xido de nquel). La piel normal muestra un color azul. Los pelos afectados
con tinea capitis de tipo ectothrix por Microsporum canis o M. gypseum
emiten fluorescencia de color verde brillante. Las infecciones bacterianas
como el eritrasma, emite fluorescencia rojo y las escamas parasitadas por
Malassezia sp fluorescentes de color amarillo oro.
Antes de realizar la recoleccin de la muestra, la piel, pelos o uas afectados
deben limpiarse con una gasa humedecida en alcohol o en agua destilada
estril, con el fin de eliminar el polvo y los contaminantes ambientales
depositados en la piel. No se recomienda las torundas de algodn, ya que
sus fibras pueden interferir con el examen directo.
En caso de toma de muestra en las uas, se debe remover con anterioridad
el esmalte de uas, si estn pintadas y no deben ser cortadas.
La obtencin de la muestra, as como su transporte y procesamiento debern
realizarse con estricta tcnica estril.

Una vez cumplidas estas indicaciones se procede a tomar la muestra.

TOMA DE MUESTRA PARA EL DIAGNSTICO DE LA DERMATOFITOSIS:

Realizar asepsia con alcohol. La muestra debe incluir tanto cabellos alterados
como escamas del cuero cabelludo o de piel (Figura 10). Para la obtencin de los
cabellos (cuero cabelludo) y vellos (de la barba), deben preferirse aquellos que estn
opacos, quebradizos y fracturados dando aspecto de puntos negros; igualmente

Microscopio ptico

Tinea capitis y barbae (tia del cuero cabelludo o de la barba):

30

aquellos que se extraigan fcilmente con una pinza de depilacin. Las escamas se
obtienen por raspado con bistur estril.

Las lesiones pueden ser examinadas con lmpara de Wood (luz ultravioleta, 365
nm), en busca de zonas fluorescentes que indicarn la presencia de cabellos y pelos
infectados por dermatofitos, lo cual permite recolectar muestras apropiadas con mayor
seguridad.

Figura 10. Lesiones de Tinea capitis. Foto cortesa Profa. Leyla Humbra

Remisin: Los cabellos o vellos pueden ser enviados al laboratorio en sobres,


tubos o cajas de Petri plsticas estriles, identificndolas adecuadamente con el
nombre y edad del paciente, as como del sitio donde fue tomada.

Tinea facie, corporis, cruris, pedis y manuum (tia del cuerpo, crural,

MUESTRA: Escamas.

Las escamas son recolectadas con bistur romo, raspando los bordes de la
lesin, donde est el crecimiento activo del hongo (Figura 11 y 12). Se recogen

Microscopio ptico

del pie y de la mano):

31

directamente sobre la lmina portaobjeto. En caso de lesiones eritematosas, hmedas


o con exudados, la muestra debe tomarse tambin con bistur y, si hay vesculas, stas
pueden romperse y el material recolectado se transfiere a una lmina portaobjeto.

Figura 11: Borde (flecha) lesin de Tinea facie.


Foto cortesa Profa. Leyla Humbra.

Figura 12: Borde (flecha) lesin de Tinea


corporis. Foto cortesa Profa. Leyla Humbra.

Remisin: Si el examen directo y cultivo no va a ser realizado por la persona


que toma la muestra o que la misma no vaya a ser procesada de inmediato en el
laboratorio, las escamas pueden ser remitidas en un sobre nuevo, entre dos lminas
portaobjetos unidas con cinta adhesiva o en una caja de Petri plstica estril,
acompaada de la identificacin del paciente y de las descripcin de la lesin y del
rea donde fue tomada. Se debe enviar material suficiente para ser directo y cultivo.

Tinea ungium (tia de la ua):

Lecho ungueal (Onicomicosis subungueal distal o proximal):

Previa limpieza con alcohol, la muestra debe ser tomada con bistur
haciendo raspado profundo del lecho ungueal o de la lmina afectada partiendo del

Microscopio ptico

MUESTRA: Depender del tipo de lesin (figura 13):

32

extremo distal al proximal y recolectando el detritus el detrito subungueal de la parte


incolora, pigmentada, distrfica y ms dbil de la ua; si las uas son distrficas
pueden cortarse con tijera o cortauas estriles.
En la ua misma (onicomicosis superficial blanca, endonixis):

Se raspan las reas alteradas o se cortan pequeos fragmentos de las uas


afectadas.
Reborde ungueal (onicomicosis proximal subungueal o paroniquia):

La muestra debe tomarse por presin sobre el reborde ungueal, o por debajo de
este, tratando de recuperar el material caseoso.
A)
B)
C)
D)

Onicomicosis distal y lateral subungueal


Onicomicosis blanca superficial
Onicomicosis blanca proximal subungueal
Onicomicosis distrfica total

Figura 13: Formas clnicas de onicomicosis.


www.uv.es/derma/CLindex/CLdermatofit/onicomic.jpe

Remisin: El exudado proveniente del reborde ungueal debe ser tomado y


procesado de inmediato en el laboratorio. El detrito, los raspados ungueales y los
fragmentos de la uas pueden enviarse en sobres o cas de Petri plsticas estriles,
acompaados de los datos del paciente.

tias o dermatofitosis. El mtodo del cuadrado de moqueta de Mariat y Adan-Campos.


El cual consiste en frotar 5 veces con un cuadrado de alfombra de lana estril la
totalidad de la superficie a examinar (piel glabra o cuero cabelludo); posteriormente, la

Microscopio ptico

Existe una tcnica complementaria para la recoleccin de las escamas en las

33

moqueta se guarda en un sobre de papel o en una caja de Petri y se enva al


laboratorio de Micologa para su procesamiento.

Este procedimiento posee varias ventajas:


1. No es cruento para el paciente.
2. Es til para realizar tomas de tinea capitis con fluorescencia negativa.
3. Permite estudiar a portadores asintomticos de dermatofitos o pacientes ya
tratados, cuando la lesin clnica ha desaparecido.
4. Facilita los estudios epidemiolgicos de las tineas o tia.
5. Permite estudiar animales (gatos, perros, etc.) que pueden ser reservorio de
dermatofitos. Sin embargo, tiene el inconveniente de que no se puede realizar la
observacin directa, solamente el cultivo.

EXAMEN DIRECTO
Una vez recolectadas las muestras de piel, pelos o uas se procede a realizar el
examen directo. Este se realiza colocando la muestra entre lmina y laminilla con una o
dos gotas de KOH, solucin aclarante de la queratina (10-40% dependiendo de la
muestra), se flamea para acelerar el aclaramiento (sin dejar hervir) y se observa al
microscopio con objetivos de 10x y 40x. Si el material es muy denso, se puede
disgregar presionando la laminilla con el borrador de un lpiz o con el dedo. Este
procedimiento tambin ayuda a separar las clulas y evitar artefactos como el mosaico
del hongo. Para favorecer la visualizacin, se puede agregar unas gotas de azul de
lactofenol o tinta Parker.

Tinea capitis (tia de la cabeza):

(figura 14).

Microscopio ptico

Pueden presentar cinco tipos de parasitacin, dos endothrix y tres ectoendothrix

34

Del tipo endothrix se distinguen:


1. Parasitacin tricoftica (Trichophyton tonsurans), con una gran
cantidad de esporas agrupadas densamente en el interior del pelo.

2. Parasitacin fvica (T. schoenleinii, poco frecuente en nuestro medio),


con escasa esporas y filamentos, as como con vesculas de aire en el interior
del pelo.
Del tipo ectoendothrix se distinguen:
1. Parasitacin

microsprica

(Microsporum

canis),

con

esporas

pequeas que forman un manguito alrededor del pelo.

2. Parasitacin microide (Trichophyton mentagrophytes), con esporas


con disposicin laxa alrededor del pelo.

3. Parasitacin megasporada (T. verrucosum, poco frecuente en


Venezuela): con grandes esporas alrededor del pelo.

Figura 14: Tipos de parasitacin del pelo. (Modificado de Segratain G.

Tinea corporis, cruris, peds, manuum, barbae y ungium: Se observan hifas


hialinas (Figura 15), de 3 a 15 um de dimetro, septadas y ramificadas, con o sin
artroconidias.

Microscopio ptico

Mariat F, Drouhet E. Diag Lab Muc Md 1979).

35

Figura 15: Hifa hialina (Hh) con septos (S), sin


artroconidias, obtenida del estudio directo de una Tinea
pedis, (KOH 10%), 1000 x. Tomado de Atlas de
Micologa. Auristela Snchez de Mirt.

Dibujo

CULTIVO
Para la identificacin definitiva del agente causal es fundamental realizar cultivo
en tubos de ensayo o placa y, cultivo en lmina. El cultivo de la muestra se realiza
sobre agar Lactrimel, Sabouraud o DTM (medio para probar dermatofitos), el cual es un
medio con antibacteriano y rojo fenol como indicador; de esta manera se inhiben
bacterias y si crece un dermatofito hay viraje de color amarillo a rojo. Se incuban a
temperatura ambiente durante 7 a 15 das, despus de lo cual crecen colonias

Microscopio ptico

caractersticas para cada gnero y especie (cuadro 3, 4 y 5).

36

Actividad: Dibuje el crecimiento filamentoso de las principales especies de


dermatofitos (Anverso y reverso de la colonia).

Microsporum
gypseum

Trichophyton
mentagrophytes

Trichophyton
rubrum

Epidermophyton
floccosum

Microscopio ptico

Microsporum
canis

37

Gnero: Microsporum
Tcnica: Microcultivo

Especie

M. canis

Anverso de la colonia:
Caractersticas Color blanco amarillento, de
macroscpicas aspecto lanoso o algodonoso.
Reverso:
Pigmento amarillo anaranjado
caracterstico.
Se observa un micelio septado,
con macro y microconidias. Las
macroconidias son en forma de
huso, con extremos afilados,
Caractersticas pared gruesa, con abundantes
microscpicas tabiques (6 o ms). Permiten la
identificacin de especie. Las
microconidias son alargadas en
forma de maza, ssiles, en
nmero variable, sin valor
diagnstico.

M. gypseum
Anverso de la colonia:
Color
canela,
con
superficie
pulverulenta, granulosa plana.
Reverso:
Pigmento de color caf.
Se observa un micelio septado, con
macro
y
microconidias.
Las
macroconidias son fusiformes con
puntas romas, paredes gruesas y
con menos de 6 tabiques. Permiten
la identificacin de especie.

Dibujo

Microscopio ptico

Cuadro 3: Cuadro comparativo Gnero Microsporum

38

Gnero: Trichophyton
Tcnica: Microcultivo
Especie

T.rubrum

Caractersticas
macroscpicas

Caractersticas
microscpicas

T.
mentagrophytes

Anverso de la
colonia:
Color blanco, de
aspecto
algodonoso,
pulverulento, con
formacin
de
pliegues en su
centro,
algunas
colonias
se
observan
agrietadas,
mientras
que
algunas cepas son
menos vellosas.
Reverso:
Pigmento rojo vino
caracterstico.

Anverso
colonia:

Presenta
un
micelio muy fino,
septado;
las
microconidias son
piriformes en forma
de lgrima, ssiles
o pedunculadas y
adoptan
una
disposicin
irregular en ambos
lados del filamento.
Las macroconidias
son muy escasas o
ausentes,
digitiformes,
en
forma de salchicha,
de pared celular
delgada y lisa.

Presenta
abundantes
microconidios
esfricos y nacen
en acmulos, as
como a lo largo de
las
hifas;
las
macroconidias son
cilndricas y de
paredes delgadas
y frecuentemente
se ven hifas en
espiral.

de

la

Color
blanco
crema, de aspecto
granular,
pulverulenta con
los
mrgenes
radiados.

T. interdigitale

T. tonsurans

Anverso de la
colonia:
Color
blanco
crema,
de
aspecto velloso
o algodonoso.

Anverso de la
colonia:
Puede presentar
4
variedades
morfolgicas:
crateriforme,
cerebriforme,
sulfrea
y
acuminada, de
aspecto
algodonoso
o
pulverulento.
Reverso:
Pigmento
amarillo azufre,
pardo-rojizo
o
negruzco
que
puede
ser
difusible.
Se observa un
micelio
ramificado
en
ngulo
recto,
septado,
y
microconidias
grandes (2-5 x 37 um), piriformes
o en forma de
maza, ssiles o
penducludas.
Las
macroconidias
son escasas o
estn ausentes.

Reverso:
Pigmento
color
rojo (no siempre) o
caf.

Presenta
abundantes
microconidios
subesfricos o
piriformes. Las
macroconidias
son
multiseptadas y
ocasionalmente
presentes. Se
observan
escasas hifas
en
espiral.
Clamidosporas
presentes
en
cultivos viejos

Microscopio ptico

Cuadro 4: Cuadro comparativo especies del gnero Trichophyton

39

Microscopio ptico

Dibujo

40

Gnero: Epidermophyton
Especie: E. floccosum
Caractersticas

Anverso de la colonia:

macroscpicas

Colonias blancas, pulverulentas o algodonosas, formando


al principio una colonia plana que con el tiempo suele
presentar pliegues en su parte central.
Reverso:
Pigmento de color amarillo-verdoso, en ocasiones un
poco amarillo-parduzco.

Caractersticas

Posee numerosas macroconidias, de paredes lisas,

microscpicas

gruesas, con el extremo distal redondeado, fusiformes o


en forma de maza de 7-9 x 20-35 m, generalmente con
2-5 tabiques. Ausencia de microconidias.

Cuadro 5: Cuadro descriptivo Epidermophyton floccosum

Microscopio ptico

Dibujo

41

DIAGNSTICO DE PITIRIASIS VERSICOLOR

CARACTERISTICAS DE LAS LESIONES:

Presencia de maculas hipo o hiperpigmentadas y rara vez ligeramente


eritematosas; solitarias o confluentes, puntiformes, redondeadas a mapiformes y de
bordes bien definidos. Suelen estar acompaadas de descamacin fina y el paciente
puede relatar prurito, especialmente cuando hay sudoracin. Los lugares ms
comnmente afectados son: el trax, los hombros y el cuello.

Figura 16. Lesiones en cara (flechas) de


Pitiriasis Versicolor. Foto tomada de:
atlasdemicologia.blogspot.com/2008/11/3pitiriasis versicolor.html

MUESTRA

Tcnica de la cinta adhesiva: Se corta un pedazo de cinta adhesiva, un poco


ms largo que una lmina portaobjeto, se delimita la lesin con un bolgrafo y se
dispone a frotar, con la ua, la lesin con la cinta adhesiva (tratando que las escamas

Microscopio ptico

Escamas obtenidas por raspado con bistur o la tcnica de la cinta adhesiva.

42

se adhieran a la pega de la misma), una vez recolectada la muestra se coloca sobre


una lmina portaobjeto con una o dos gotas de azul de metileno al 0,05%.

ESTUDIO MICOLGICO

EXAMEN DIRECTO: Azul de metileno a 0,05%

Al microscopio se observan blastoconidias de Malassezia sp, de 3-8 m de


dimetro, de paredes gruesas y refringentes, aisladas o dispuestas en acmulos y
asociadas con hifas cortas y gruesas, poco ramificadas de 2,5 a 4 m de dimetro. Con
estos hallazgos se establece el diagnstico de pitiriasis versicolor.

H
B

Figura 17: Examen directo de Pitiriasis


versicolor. Se observan blastoconidias (B) de
Malassezia sp. en acmulos e hifas (H)
cortas y gruesas. Tcnica de cinta adhesiva.
Coloreada con Azul de metileno 0,05%. Foto
tomada por Profa. Leyla Humbra

DIBUJO

Generalmente no requiere cultivo, a menos que los resultados sean atpicos o


que se desee determinar la especie implicada.

Microscopio ptico

CULTIVO

43

DIAGNSTICO MICOLGICO DE LA CANDIDOSIS MUCOCUTNEA

MUESTRA

Escamas, detrito subungueal, fragmentos de uas, exudado de mucosas,


secreciones, flujo vaginal. Las cuales pueden ser tomadas por raspado de bistur o
haciendo uso de un hisopo estril en el caso de exudados, secreciones o flujo vaginal.

Remisin:
Las escamas pueden ser remitidas en un sobre nuevo, entre dos lminas
portaobjetos unidas con cinta adhesiva o en una caja de Petri plstica estril,
acompaada de la identificacin del paciente y de las descripcin de la lesin y del
rea donde fue tomada. Se debe enviar material suficiente para ser directo y cultivo.
El exudado proveniente del reborde ungueal debe ser tomado y procesado
de inmediato en el laboratorio. El detrito, los raspados ungueales y los fragmentos de la
uas pueden enviarse en sobres o cajas de Petri plsticas estriles, acompaados de
los datos del paciente.
En el caso de la toma de muestra en mucosas, las mismas deben enviarse
en tubo con tapa de rosca que contenga 1 ml de solucin salina o agua destilada
estril. La muestra debe ser procesada en la hora siguiente a su recoleccin; por ello
debe anotarse en la orden de remisin la hora de toma de muestra. Si no es posible la
remisin inmediata al laboratorio de muestras de mucosa vaginal, genital masculina o

con el fin de controlar la cantidad de blastoconidias y seudohifas al momento de tomar


las muestras.

Microscopio ptico

perianal, se recomienda realizar un extendido para su posterior coloracin con Gram,

44

ESTUDIO MICOLGICO

EXAMEN DIRECTO

Se realiza con la observacin al microscpico del material colocado entre una


lmina portaobjeto y una laminilla con KOH al 10-20%. Se observan blastoconidias
ovaladas o redondeadas de diferentes tamaos dependiendo de la especie. Aunque la
presencia de seudohifas asociadas con blastoconidias, caracterizan el gnero Candida,
al examen directo no siempre se observan ambos elementos.

En candidosis cutnea la presencia de seudohifas e hifas es diagnstico, debido


a que el hongo no es flora normal de la piel, con la excepcin de la piel de las reas
periorificiarias donde ocurre contaminacin por proximidad con las mucosas. En la
candidiasis de membranas mucosas, es indispensable observar las blastoconidias y/o
seudohifas para establecer el diagnstico (Figura 18).

Seudohifa
Blastoconidia

Clamidospora
Figura 18: Blastoconidia, seudohifa y clamidosporas de

DIBUJO

Candida albicans.

Es importante resaltar que el solo aislamiento en cultivo no es significativo


debido a que las levaduras constituyen parte de la flora normal de las mucosas. Una
vez aislada la levadura en el medio de cultivo (Sabouraud, Mycosel, Lactrimel), se

Microscopio ptico

CULTIVO

45

procede a la diferenciacin de especies a travs de la realizacin de diferentes pruebas


bioqumicas: como lo son la formacin de tubo germinal, filamentacin, produccin de
clamidosporas, hidrlisis de la urea y asimiliacin de azcares o Auxonograma).
(Esquema 1)

En el informe de resultados se debe informar la cantidad de elementos micticos


observados, de acuerdo a los siguientes datos:

Cantidad

Uas (cm x 40)

Flujo (cm x 40)

Escasa

1-5

1-10

Moderada

6-10

10-20

Abundante

>10

>20

Actividad: Describir las caractersticas macro y microscpicas del cultivo de

Microscopio ptico

Candida albicans.

46

MUESTRA CLNICA

LEVADURA AISLADA (SABOURAUD O LACTRIMEL)

BILIS AGAR (Clamidosporas)


Candida albicans, Candida dubliniensis
FILAMENTACIN (Corn Meal Tween 80)

UREASA

UREASA

Trichosporum

Candida spp

+
Cryptococcus
Rodotorula (Anaranjada)

Para identificacin de especies de Candida no albicans


Esquema 1: Identificacin de levaduras

Microscopio ptico

Auxonograma, crecimiento: 37 C y 42 C

47

PRCTICA NMERO 4: DIAGNSTICO DE LAS MICOSIS SUBCUTNEAS

OBJETIVOS:
Al finalizar la prctica el estudiante estar en la capacidad de:
Reconocer la importancia mdica del diagnstico micolgico de las micosis
subcutneas.
Realizar el diagnstico micolgico de las micosis subcutneas.
Describir las caractersticas macro y microscpicas de los agentes causales
de las micosis subcutneas.

DIAGNSTICO DE LA CROMOBLASTOMICOSIS

La cromoblastomicosis (CBM) es una enfermedad crnica, granulomatosa, que


afecta

predominantemente

hombres,

trabajadores

del

campo,

en

edades

comprendidas entre los 20 y 70 aos, aunque tambin se han reportado casos en nios
y adolescentes. Es causada por varios hongos filamentosos con melanina, clasificados
en la familia Demateacea y denominados cromomicetos por Borelli Se adquiere por
inoculacin accidental del hongo saprofito en la piel a travs de traumatismos
ocasionados con espinas de plantas o restos vegetales que contienen el agente.

Para establecer el diagnstico de la cromoblastomicosis se hace necesario


conocer la epidemiologa, impresin clnica y recuperar el agente causal de las
muestras clnicas.

La cromoblastomicosis se presenta especialmente en hombres adultos,


agricultores entre la tercera y cuarta dcada de la vida, quienes han estado
repetidamente expuestos a pequeos traumas. Los nios y adolescentes tambin
pueden ser afectados principalmente por Cladophialophora carrionii. La distribucin

Microscopio ptico

Estudio epidemiolgico

48

geogrfica es mundial, pero el mayor nmero de casos se han informado en las


regiones tropicales y subtropicales de Amrica y frica.

En Venezuela las reas endmicas ms importantes se localizan en la regin


noroccidental, en los estados Lara, Zulia y Falcn. Esta rea endmica incluye dos
reservareas segn el agente causal implicado.

Fonsecae pedrosoii se encuentra en regiones de clima clido y hmedo


descritas como "Bosque deciduo montano".

Cladophialophora carrionii es el agente causal ms frecuentemente asilado y es


considerado el responsable de la endemia de CBM en la zona semirida del estado
Falcn. C. carrionii se encuentra en zonas ridas descritas como "bosque xerfilo de
espinar"

Impresin Clnica
La cromoblastomicosis se caracteriza clnicamente por la presencia de lesiones
ppulo postulosas o ndulo abcesado que evolucionan lenta y progresivamente a placa
verrugosa de superficie irregular con diminutas hemorragias, visibles como puntos
negros, escamo-costrosas, de bordes activos y zonas con tendencias a la cicatrizacin,
dejando reas atrficas, acrmicas o hipocrmicas. Al cabo de varios aos

de

evolucin, estas lesiones pueden llevar a deformaciones irreversibles e invalidez parcial


del miembro afectado. Las lesiones son generalmente nicas, se encuentran
principalmente en extremidades aunque tambin pueden ser observadas en manos,

Microscopio ptico

espalda, tronco, regin gltea y cara. (Figura 19).

49

Figura 19: Diferentes lesiones clnicas de cromoblastomicosis. Fotos cortesa


Profa. Leyla Humbra.

Estudio Micolgico
Muestra:
Previa asepsia con alcohol, las escamocostras son recolectadas con bistur
romo, raspando la lesin, con preferencia donde se encuentran los puntos negros
drmicos, los cuales contienen las estructuras del hongo. Se recogen directamente
sobre la lmina portaobjeto.

En algunos casos es necesario recurrir a la biopsia debido a la hiperqueratosis

Remisin: Las escamocostras pueden ser remitidas en un sobre nuevo, entre


dos lminas portaobjetos unidas con cinta adhesiva o en una caja de Petri plstica

Microscopio ptico

que impide penetrar al lugar donde se encuentra el hongo.

50

estril, acompaada de la identificacin del paciente y de la descripcin de la lesin y


del rea donde fue tomada. Se debe enviar material suficiente para ser directo y cultivo.

Examen Directo:
Se realiza entre lmina y laminilla con KOH al 10-20%, slo o adicionado con
tinta, Negro de clorazol E y haciendo uso de coloraciones histolgicas como
Hematoxilina-Eosina (HE) o cido Perydico de Schiff (PAS).
En un paciente con cromoblastomicosis se observan las clulas esclerticas,
clulas fumagoides o esclerotes de Medlar, las cuales son clulas redondeadas, de
color caf o amarillo ocre, de 4 a 12 m de dimetro, de pared gruesa, con inclusiones
citoplasmticas y con particiones (Figura 20). Estas clulas pueden dividirse en varios
planos, con septos en diferente orientacin. No son blastoconidias ni tienen
reproduccin por gemacin. En casos muy crnicos, se pueden observar tambin la
presencia de hifas cortas, septadas, de pared gruesa y dematiaceas.
En la biopsias teidas con HE los cuerpos esclerticos conservan su color
caracterstico. La respuesta tisular es mixta con una respuesta supurativa y predominio
de granulomas, con acmulos de neutrfilos en el centro. Las clulas esclerticas se
localizan en los microabscesos drmicos, mientras que las hifas pueden verse en la
epidermis.

Figura 20: Cuerpos esclerticos. (S) Septos. Escamocostras.


KOH, 40x. Foto cortesa Profa. Leyla Humbra

DIBUJO

Microscopio ptico

51

El examen directo es muy importante ya que la observacin de las clulas


esclerticas establece el diagnstico de enfermedad, pero el cultivo es indispensable
para determinar el gnero y la especie del agente etiolgico y ulterior aplicacin de
tratamiento.
Reporte: al examen directo se observan clulas esclerticas compatibles con
agentes de cromoblastomicosis.
Cultivo y microcultivo:
La siembra se realiza sobre agar Sabouraud o Lactrimel, en placa o tubo, se
incuba a temperatura ambiente por 8 15 das.
Caractersticas

macroscpicas:

Todas

las

especies

causantes

de

cromoblastomicosis producen colonias de crecimiento lento, micelio areo corto, de


color variable entre pardo oscuro, verde oliva o negro; con aspecto aterciopelado,
superficie plana o ligeramente elevada y plegada; al reverso la colonia es de color
negro.
Caractersticas microscpicas: El estudio de los microcultivos facilita la
observacin de la conidiognesis, permitiendo la identificacin por especie del agente
causal.
Cladophialophora carrionii:
Presenta fructificacin tipo Cladophialophora con conidiforos simples, erectos,
de longitud variable, que dan origen en su extremo distal a cadenas de conidias
brotantes, de color pardo, unicelulares o bicelulares, ovoides, elpticos o cilndricos de 2
a 4 m, que se disponen en cortas cadenas acrpetas y ramificadas. En los puntos de
unin de las conidias, se observan zonas engrosadas de la pared celular que actan

Microscopio ptico

como disyuntores, favoreciendo su desprendimiento. (Figura 21)

52

Cadena de
conidias

Conidiforo
simple

Hifa septada

Figura 21. Cladophialophora carrionii. Azul


de lactofenol. 40x. Foto cortesa Profa.
Leyla Humbra

DIBUJO

Phialophora verrucosa:
Presenta fructificacin Phialophora, la cual se caracteriza por la produccin de
conidiforos terminales o dispuestos a los lados de las hifas vegetativas, en forma de
florero (filides), con una zona estrecha o cuello y una porcin distal ms ancha. Las
conidias son ovales, lisas, ligeramente pigmentadas y de 2 a 3 m de dimetro; se
forman en el interior de la filide, salen del exterior acumulndose en pequeos
conglomerados en forma de cabezuela. (Figura 22).

Conidias

Hifa septada
Figura
22:
Phialophora
verrucosa.
http://overcomingcandida.com/mycology/phialop
hora.jpg

DIBUJO

Microscopio ptico

Fialide

53

Rhinocladiella aquaspersa:
Presenta la fructificacin de tipo Rhinocladiella, exhibe un conidiforo poco
diferenciado, erecto, cilndrico, ligeramente dilatado en su extremo distal, en forma de
clava o maza; en esta porcin se ven cortas prolongaciones del conidiforo en forma
de dientes, donde se implantan las conidias con disposicin acropleurogena. Las
conidias son ovales, unicelulares, de 2 a 5 m de dimetro y forman brotes que dan
origen a cortas cadenas de 2 a 3 elementos. (Figura 23)

Conidioforo

Conidias
Hifa septada
DIBUJO

Figura 23: Rhinocladiella aquaspersa.


www2.ac-lyon.fr/.../rhinocladiellaaquaspersa.gif

Fonsecaea pedrosoi:
Presenta los tres tipos de formacin de conidias que exhiben los agentes
causales

de

esta

enfermedad:

Cladosporium,

phialophora

Rhinocladiella,

generalmente predominan las dos primeras. (Figura 24)

Conidias

Conidiforo

Microscopio ptico

Hifa
septada

54

Figura
24.
Fonsecaea
pedrosoi.
www.doctorfungus.org/thefungi/img/fon1_l.jpg

DIBUJO

DIAGNSTICO DE LA ESPOROTRICOSIS

La Esporotricosis es una micosis endmica, producida por la penetracin del hongo


dimrfico Sporotrhrix schenckii. Ocasionando lesiones cutneas y extracutneas.

Para establecer el diagnostico de la esporotricosis se hace necesario conocer la


epidemiologa, impresin clnica y recuperar el agente causal de las muestras clnicas.

Estudio epidemiolgico

S. schenckii es de distribucin mundial, aunque es ms frecuente en areas


tropicales, tiene su hbitat ms comn en la tierra y en los vegetales.

La enfermedad se presenta en todas las edades y en ambos sexos, con mayor


incidencia en el sexo masculino, que por su ocupacin estn expuestos a cualquier tipo
de trauma.

Entre los factores de riesgos conocidos para las formas cutneas se han descrito el
contacto traumtico con material vegetal (plantas espinosas, helechos, paja, musgo).
En las formas sistmicas, el alcoholismo y la inmunosupresin han sido sealados
como factores de riesgos importantes.

Se recomienda realizar diagnstico diferencial con leishmaniasis mucocutnea,


sfilis, tuberculosis, epitelioma, cromomicosis, acn, piodermitis, criptococosis cutnea,
sarcoidosis, lepra tuberculoide, lesiones queloideanas, dermatofitosis y enfermedades

Impresin Clnica
Esporotricosis cutnea primaria: se describen dos formas.

Microscopio ptico

malignas.

55

Cutnea primaria fija: se caracteriza por la presencia de una lesin ulcerada,


verrucosa o vegetante, solitaria o con lesiones satlites perifricas, contiguas, rojizas o
violceas, que crecen por contigidad.
Cutnea primaria linfangtica: Se caracteriza por la presencia de un chancro
de inoculacin, la cual es una lesin nodular, verrucosa o ulcerada, seguida de
mltiples lesiones nodulares a lo largo de los canales linfticos adyacentes. En los
adultos se localiza principalmente en las extremidades superiores e inferiores, mientras
que en los nios predomina en la cara.

Figura 25: Lesin de Esporotricosis linfangtica.


http://www.virtual.unal.edu.co/cursos/medicina/2010828/l
ecciones/cap6/cap6-3.htm

Esporotricosis pulmonar primaria o extracutnea: esta forma se adquiere por


inhalacin del hongo. En los individuos normales es asintomtica y puede estimular
inmunidad especfica, pero en el hospedero inmunocomprometido, suele ocurrir
Microscopio ptico

diseminacin hematgena.

56

Estudio Micolgico
Muestra:
Se solicitan usualmente:
Exudados
Material purulento
Biopsias

En las formas diseminadas se solicita:


Esputo
Liquido sinovial
Liquido cefalorraqudeo

Examen Directo:
Se realiza haciendo uso de la coloracin de Giemsa o histolgicas (HE, PAS,
plata-metenamina), inmunofluorescencia directa y tcnicas de inmunoperoxidasa.
Usualmente no se observan estructuras micticas y ocasionalmente se observa
el cuerpo asteroide. Las blastoconidias son adems, difciles de diferenciar de otros
hongos, como Histoplasma capsulatum, especialmente en fresco o con la coloracin de
plata metenamina.
En biopsias teidas con HE o PAS, se observan blastoconidias rodeadas de
espculas eosinfilas en forma de estrella (reaccin de Splendore-Hoeppli), conocida
con el nombre de cuerpo asteroide. Estas estructuras rara vez se observan al examen
en fresco.
Por inmunofluorescencia o inmunoperoxidasa se observan blastoconidias de S.

Microscopio ptico

schenckii.

57

Figura

26:

Cuerpo

asteroide.

http://www.virtual.unal.edu.co/cursos/medicina/20108
28/lecciones/cap6/cap6-3.htm

Cultivo:
Caractersticas macroscpicas: A temperatura ambiente los cultivos son de
crecimiento rpido (4 a 5 das), de aspecto micelial, de color gris claro que con el
tiempo se tornan ms oscuros, de superficie vellosa, muy plegada y de consistencia
membranosa. A 37 C se observan colonias blancas, cremosas, de aspecto
levaduriforme.
Caractersticas microscpicas: el micelio est constituido por finos filamentos
hialinos, ramificados y septados. Las conidias tienen forma elptica, de pared lisa y
delgada, se originan en forma simpodial, en el extremo distal de conidiforos simples,
erectos y finos, presentando en su conjunto el aspecto del tallo y ptalos de una flor de
margarita. El estado levaduriforme est constituido por blastoconidias esfricas, ovales
o en forma de cigarro, mono o multigemante de 1 a 3 m por 3 a 10 m. en algunos
casos se hace necesario demostrar el carcter dimrfico del hongo inoculando

Microscopio ptico

animales de experimentacin como ratas o cobayos.

58

H
H
S
Figura 27: Cultivo en lmina de Sporotrhrix schenckii. Hifa
septada (H), Conidiforo simple (C) y conidias (c)
dispuestas
en
flor
de
margarita.
www.facmed.unam.mx/.../pages/sschenckii2_jpg.htm

DIBUJO

Inmunodiagnstico:
Inmunidad celular: Se estudia mediante la aplicacin intradrmica de 0,1 c.c. de
esporotriquina, la cual es un antgeno que se prepara bien sea de la fase micelial o
levaduriforme del hongo, se realiza la lectura a las 48 horas. Una lectura mayor o igual
de 5 mm indica que la persona ha estado expuesta al hongo. A pesar de que la
intradermorreaccin carece de valor diagnstico, una prueba positiva ante un cuadro
clnico sugestivo de esporotricosis orienta hacia el diagnstico de la enfermedad, el
cual debe ser confirmado con el aislamiento e identificacin del agente causal.
Inmunidad humoral: La prueba de eleccin para el estudio de los casos de
esporotricosis cutnea linftica y la extracutnea es la ID. En los casos de
esporotricosis cutnea fija las pruebas de eleccin, usando un antgeno levaduriforme,

Microscopio ptico

son la aglutinacin, el ltex y la electrosinresis.

59

DIAGNSTICO DE MICETOMA
El Micetoma es una infeccin crnica, supurativa de los tejidos cutneo,
subcutneo y seo. Se caracteriza por la presencia de edema, fstulas y granos que
drenan a travs de las fstulas, esta triada es usada en un sentido estricto para definir
el trmino Micetoma. Puede estar causado por bacterias (actinomicetos) u hongos
(eumicetos).
Estudio epidemiolgico:
El Micetoma se produce por la implantacin traumtica o heridas en el tejido
subcutneo, de ciertos hongos o bacterias, presentes en espinas o astillas de madera,
entre otros. Es frecuente en regiones tropicales y subtropicales, presentndose
espordicamente en regiones templadas. La enfermedad es endmica en la India y en
algunos pases del frica y de Latinoamrica. En Venezuela, la enfermedad predomina
en la regin Centrooccidental del pas, en los estados Lara y Falcn. As mismo, se
han reportado casos en las regiones: Central, Zuliana y de Guayana.
La enfermedad se ha observado en nios de 3 aos de edad y en individuos de
80 aos, pero predomina entre la 2a dcada de la vida. Es ms comn en hombres que
en mujeres, en una relacin 2:1, y predomina en campesinos, por lo que esta entidad
es considerada una enfermedad ocupacional. Afecta principalmente los miembros
inferiores, pero tambin puede producirse en manos, rodillas, regin gltea, brazos,
cabeza, cuello y tronco.
Agentes etiolgicos:
El Micetoma puede ser ocasionado por bacterias aerbicas (Micetoma
actinomictico) los cuales producen granos claros a excepcin de Actinomadura

producen granos de color negro, excepto Cephalosporium. (Tabla 1).

Microscopio ptico

pelletieri que es rojo, y por hongos verdaderos (Micetoma eumictico), los cuales

60

Tabla 1. Agentes etiolgicos del Micetoma

En Venezuela, los principales agentes de Micetoma son:


Actinomicetoma:
A. madurae
N. brasiliensis
Eumicetoma:
Pyrenochaeta mackinonnii
P. romeroi
Microscopio ptico

Madurella grisea

61

Impresin clnica:
La lesin inicial se localiza en el tejido celular subcutneo. Se caracteriza por
ser una masa firme, indolora y no adherida a los planos superficiales. Luego se
extiende hasta el tejido subcutneo donde forma reas de tumefaccin con produccin
de abscesos que alcanzan la piel y drenan a travs de mltiples fstulas. En el lquido
seropurulento que de all drena, se encuentran los granos caractersticos de la
enfermedad. El progreso de la lesin lleva a compromiso seo, el cual ocasiona
deformacin marcada del miembro comprometido.
Diagnostico micolgico:
Muestra:
Granos
Material purulento
Liquido serohemtico
biopsias
Examen directo:
Se realiza con la observacin directa de los granos entre lamina y laminilla con
KOH al 10%, tambin se puede realizar coloracin de Gram. Como los granos pueden
ser producidos por bacterias u hongos, es importante estudiar sus caractersticas
macro y microscpicas de su tamao, forma, consistencia y color, as como el dimetro
de los filamentos que lo conforman y la configuracin interna son caractersticas
importantes.
Los granos producidos por actinomicetos se observan al microscopio como
filamentos delgados, ramificados, de aproximadamente 1 m de dimetro y poseen

metenamina; algunos son parcialmente cido alcohol resistente.


Los granos producidos por hongos pueden ser duros o blandos. Sus filamentos
pueden ser delgados o gruesos, pero siempre mayores de 1 m de dimetro,

Microscopio ptico

algunas formas cocoides y bacilares; se tien con Gram, Kinyoun, Giemsa, HE y plata-

62

ramificados y a veces tortuosos, poseen usualmente clamidoconidias de diferentes


dimetros.
Las biopsias se procesan y colorean con HE o con coloraciones especiales
como PAS. Alrededor del grano se observa un depsito de material eosinfilo
(reaccin de Splendore-Hoeppli), polimorfonucleares, clulas gigantes multinucleadas,
clulas plasmticas e histiocitos.
Cultivo:
Los granos constituyen la fuente fundamental del material para el cultivo; stos
deben estar vivos y libres de contaminacin. As mismo, se pueden usar para el cultivo
las secreciones serosanguinolentas del rea afectada. El cultivo se puede realizar en
medio de mycosel, medio de Sabouraud o medios nutrientes, tales como infusin
cerebro-corazn (en caldo o en agar), y esperar por lo general de 2 a 3 semanas de
cultivo, incubndose a 30 37C. Tambin pueden incubarse en atmsfera de C0 2.

Microscopio ptico

ACTIVIDAD: Describa los granos producidos por hongos y por bacterias.

63