Вы находитесь на странице: 1из 40

Copyright « « » & «A K -C »

На правах рукописи

РЫБАЛКО Анатолий Евдокимович

БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ВИРУСОВ ВЕГЕТАТИВНО РАЗМНОЖАЮЩИХСЯ ЦВЕТОЧНЫХ РАСТЕНИЙ, ТЕХНОЛОГИЯ

КАРТОФЕЛЯ, РЕСУРСОСБЕРЕГАЮЩАЯ ОЗДОРОВЛЕНИЯ

Специальность - 06.01.11 - защита растений

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

МОСКВА 1998

Copyright « « » & «A K -C »

РаГчпа BbinoiHtHa в Фишапе инетитлтабиоорганическои химии

Ю иее^доватечьском центре ' VlepucreMHbie кл лылры' Госстроя России

им

\1

\ Овчинникова

на\чно-

М Шемякин а

и

РАН

и

Официальные оппоненты Ю

Помазков корреспондент РАН биотогических на\к

профессор

И

академик

академик

доктор е<льско\озяиственны\ на\к,

доктор

биотогических

на\к, чтен-

РЛ.СХН

Р

Г

Бчтенко

доктор

РАСХН

В

С

Шеветуха

Вед\шее \-чре>кдение

Главный ботанический сад РАН

Защита состоится '/г

"

/?/; у &*'-<'-^>

1^98

в ?'/

\

г 120 35 0^ в Московской Тимирязева по адрес\

49

часов

Ученый совет ТСХА

на заседании диссерташгонно1 о совета Д

сельскохо $яйственноп академии им

К Тлмирязевстчая VT

127550

Москва И-550

С диссертацией можно ознакомиться в биотшотеке Московской гьеко-козяйственнои академии имени К А. Тимирязева (ТСХА)

//

Авторефератразостан

\

niui

секретарь

Д|-е1.е|)тационного совета

^

r jp >

юл ^гич'"'' "

нал к

/

В

А

Шкаликов

Copyright « « » & «A K -C »

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Потери урожая в мире, вызываемые разнообразными болезнями, составляют около 50 млрд. долларов в год (James, 1981). Среди них одно из ведущих мест занимают вирусные заболевания, которые отличаются широким распространением и исключительной вредоносностью (Атабеков, 1986). Особенностью вирусных болезней растений, определяющей сложность борьбы с ними, является гетерогенность вирусных популяций, представленных различными вирусами и их штаммами с разнообразными биологическими свойствами, что требует применения комплексных мер борьбы. В системе борьбы с вирусными болезнями растений важное место

занимает получение и применение здорового исходного материала. С целью наиболее эффективного использования разработок по борьбе с вирусными болезнями картофеля система семеноводства этой культуры в нашей стране

в конце шестидесятых годов претерпела существенную организационную

перестройку. В этом плане проведена концентрация товарного семеноводства

в благоприятных по фитосанитарным условиям регионах. Основной их

задачей было определено получение высококачественного семенного материала картофеля на основе серологических клоновых отборов (Онищенко с соавт., 1974). Однако в дальнейших исследованиях было установлено, что большинство сортов практически полностью заражены вирусами. Это потребовало применения активных методов получения исходных безвирусных растений. Показана полная зараженность вирусами и других вегетативно размножающихся растений, в частности плодово-ягодных (Вердеревская, 1971; Помазков, 1989), гвоздики ремонтантной (Петерсон и соавт., 1974; Oertel, 1974). В начале 70-х годов в нашей стране начаты работы по широкому применению для оздоровления растений активных методов лечения хронически зараженных сортов - культуры меристемы и термотерапии.

Отсутствие унификациии стандартизации технологических приемов и разработок по массовому применению оздоровленного материала в производстве даже для одной культуры стало причиной того, что метод культуры меристемы оставался достоянием отдельных лабораторий. Не были разработаны также принципы получения больших партий здорового материала, как исходного для получения элиты на безвирусной основе. Решение проблемы получения безвирусного посадочного материала возможно при создании эффективной, унифицированной технологии оздоровления, отражающей системныйподход в защите растений от вирусных эпифитотий. Цель и задачи исследований. Целью настоящих исследований явилось идентификация и изу^ние биологических свойств вирусов на различных вегетативно размножг .эщихся растениях, разработка, экспериментальное и теоретическое обос- безвирусного посадоч

шедрения ее в народное

Моск. сх-

Йнп

им.

К.

получения

исходного

Copyright « « » & «A K -C »

хо*°иство органииция проишодства иммунодиагностиктмов направленилх

обоснование

\ш'фишфованнон технологии массового о сгоровлсния растений от В1ф\сов

на основе дв\хфазного меюда регенерации растении m апикальных мернлсм, изыскание приемов получения бе Ш1ф\сных растении in заведомо u p ькенных вир\ сом стеб левых верхушек

и эксперимента 1ьное обоснование системы приемов

\скоренного рашножения оздоровленного uimrrv от реинфекции

массовой диагностики некоторых вир\<_ов для применения в прошводственных человиях

Исследования вени-ь В стедлющих

1

Pi'puooTKj

э^пернмента 1ьное и теоретическое

2 И учение

материала

обеспечивающей

*

Усовершенствование

4 Испытание унифицированной технологии оаоровления на цветочных

к\ ibnpax разработка общих принципов семеноводства этих ьллкпр на бе >вир\сной основе внедрение в прои шодство оздоровленного посадочного

магериала,

$аботев,ший на

5 Ит^чение видового состава возб\дитетеи вир\сны\

широко распространенных сортах картофетя цветочных декоративно- шетвенных к\ ibrvpax анали? стр\кг\ры В1ф\сны\ потляции 1П\-чение

СВОЙСТВ возб\д1гге 1 1еи,

6

Рафаботка

антисывороток

7

Разработка

пот\чения

и пригодных дтя проведения илпп ноферментного анати5а в

новых

способов

высокоактивных

области

концепции стандартизации биотехнотогии

клеточной инженерии и прои шодства ли гностических препаратов

8

Проведение

игысканпи

по созданию

специати !ированного

оиотехнотоппеского предприятия длч массового прои ?водства безвир\сного посадочного сывороток Научная повита реп ичпапюп исаедоватш На основе нп-чения вкр\сных попмяшш на раличных клльллрах и выявления общих принципов их стр\кт\ры делается вывод о целесообразности унификации основных гсхнологиче^ких приемов массового опоров.1ения Остановлена 10()°d > фалсенность промышленных насаждений вир\с 1ми в скрытой форме н i картофеле что вир\сы X М S Y, скручивания шетьев встречающиеся в ^мешанной инспекции, на гво!дике это В1ф\сы ipiiPtaTocni Л1тентный пршкилковоикрапчатости на хризантеме-В-вир\ с и х^пермш гомагов чртанлхмныишгаммвир\с iогуречной моиики Общим для этич icvibrvp является наличие вир\сов входящих в одн\ гакч.ономтгеч.клы ф\п т Это карлавир\еы (М и Ь-^рлос^еля мгентнын гво'лнкн В-вирм. хрнинтсмы) потивир\сы (\'-карто||)еля и прижнлковои кр шчатости гво иики) тоба\говирл>,ы (BTTvI на \ри интемс ро их, фатсиии юльцевои пятнистости одонтогло^\ма на растениях ра личных видов орхидеи) потексвир\сы (\-вир\1. картофеля вир-w моиики шшиидиума) \\л и$\чаемых кл хьгчрач выявлены и микопкпмы их поражает вир\с

4

широкого спектра растений и высокоактивных

материала

Copyright « « » & «A K -C »

огуречной мозаики, вирус мозаики резухи, на картофеле и хризантеме выявлен вирус табачной мозаики в естественных условиях, а на картофеле и гвоздике - вирус мозаики люцерны. Метьюз (1973) относит эти культуры в одну группу по характеру вредоносности вирусов. Разработаны и внедрены в массовое производство эффективные модификации серологического метода диагностики вирусов на основе радиальной иммунодиффузии и концентрированияантигена в нативном соке, а также повышения чувствительности метода электронной микроскопии путем увеличения адсорбции вирионов при помощи энергии СВЧ (заявка на патент № 04954358/13.) Организовано массовое производство высокоактивных антисывороток к вирусам, поражающих важнейшие цветочные культуры, и полифагам, имеющим значение при работе с различными растениями (цветочными, овощными, плодово-ягодными, техническим, лекарственными, эфиромасличными). Разработан способ повышения титра на основе полученного нового иммуномодулятора - камизола. Технологический процесс обеспечен нормативно-технической документацией. Разработан, экспериментально и теоретически обоснован двухфазный метод регенерации растений из истинных меристем (0,1 мм). Путем кондиционирования условий питания изолированных меристем на разных этапах морфогенеза удалось сократить сроки получения безвирусных растений, по признакам идентичным данному сорту. Этот метод апробирован на картофеле, гвоздике ремонтантной, хризантеме, гербере, орхидеях, землянике и других культурах. Выявлен феномен антивирусного кондиционированияпитательных сред от

при антивирусным веществ. Разработан способ микроразмножения растений в культуре in vitro, приемов для

помощи тканей-нянек, полученных

растений-продуцентов

обеспечивающий унификацию комплекса технологических различных культур.

Практическая

ценность

работы и реализация

результатов

исследований. В системе Минжилкомхоза РСФСР с 1980 г. по инициативе и при непосредственном участии диссертанта организовано крупномасштабное производство сертифицированного посадочного материала цветочных культур. Приказом министра ж^галпно-коммунального хозяйства РСФСР №205 от 15.04.1985 г. преобразовано в Производственное предприятие меристемных культур. В первый год работы предприятия получено продукции на сумму 550 тыс. руб., балансовая прибыль составила 265 тыс. руб., уровень рентабельности - 109%. В ассортименте - высокоактивные иммунодиагностикумы для выявления различных вирусов и микоплазм, оздоровленный посадочный материал цветочных овощных, картофеля, земляники, киви, винограда, мандарин. В 1996 г. предприятие преобразовано в Научно-исследовательский центр "Меристемные культуры". метода обеспечила возможность включения в процесс массового

5

Эффективность

применяемого

оздоровления

растений

производства

Copyright « « » & «A K -C »

о иоровленного посадочного материала клонального микроразмножения в стерильной кчльтуре, обеспечивающего абсолютнлю мщип or всех видов реинфекции \ ветичение на несколько порядков коэффициента размножения

и экономию плошади

и

утверждены

На основании материалов диссертации разработаны

"Методические

Минжичкомчозом УССР в маточных

(1978г)

вирлсньши ботешями

рекомендации

питомниках ремонтантной

по борьбе

с

гвоигаси"

Ллпериод работы Прои родственного предприятия меристемных клтьтур произведено и реализовано многочисленным предприятиям СССР около б т нативных антисывароток к различным вирусам, поражающим цветочные и др\гие клльтуры Получены высокоактивные сыворотки к микоплозмам

гвоздики цинерарии габридной гортензии столбл-ра пасленовых, различным \о !чиствам реализовано более 7 5 мтн оздоровленных черенков гвоздики ремонтантно й 1,6 мл н -хризантем ы широки й ассортимен т орнаментальны х клльтлр Вновь со uiHHOMv в 1990 г Краснодарское НИИ картофелеводства

и овощеводства переданы технотогические разработки и исходный материал

4 сортов картофехч В течение 1980-1997 гт материалы диссертации испотъ5ллотся в нал-чно- дечтеаьносги "Мернстемные кл тьтхры"

1988-1995гг материалы диссертации использованы для чтения лекции на гослаарственного л нивероитета Апробация работы Ре п тьгаты исследований доложены на (аседании Ученого совета Украинского налчно-исследовательского института сельско- \о5яиственной микробиотопга налчно-гехнических советах Мгаокилктхоза УССР в 1977 г и Минжилкомчша РСФСР - в 1981 г иседашга Президиллта ВА.СХНИЛ по вопросл ' Налчно-органииционные тдачи поллчения беширленого посадочного материата сьдьскохо{лиственных кллылр" 22 08 1984 г (протокол N 28)

по

производственнои

В

биотехнологии

Налчно-исследовательского

кафедре

физиотогии

растении

центра

Донецкого

на следующих съездах, конференциях, симпозиумах 1 IV Всесоюшом совещании по вирленым болешям растений - г Киев 1971 г 2 VI конференции молодых ученых

микробиологов Украины - г Киев 1972 г > III Всесою шом совещании по применению препарата ТУР в растениеводстве - г Москва, 1973 г 4 В^ьсоюшом семинаре-совещании по вирленым бочезням овощных кмьтлр - г Ереван 1974 г 5 VI Всесоюзном совещании по имм\нитетл

с(-1ьскохозяйственныхрастений- г Одесса

по семеноводств\ картофетя - г Чернигов, 1975 г 7 Всесою 5ном семинаресовещании "Современные методы поллчения безвирленого картофеля" - г Москва 197^ г 8 Республиканской школе-семинаре по применению клтьтуры тканей органов клеток в генетике и селекции - г Киев ИНСТИТУТ молекллярнои биологии и генетики АН УССР 1977 г 9 Юбилейной конференции Черниговского фичиата Украинского

Материалы диссертации бьпи представлены

1975 г 6 Всесоюзнол!совещании

6

Copyright « « » & «A K -C »

микробиологического общества - г. Чернигов, 1977. 10. Всесоюзной научно- практической конференции "Выращивание цветочных культур меристемным способом" - г. Рига, 1977 г. 11. VII Всесоюзном совещании по вирусным болезням сельско-хозяйственных растений -г. Ленинград, 1978 г. 12. На координационных совещаниях по проблеме "Усовершенствование системы семеноводства и разработка эффективных приемов и методов вьфащивания высококачественного семенного картофеля на безвирусной основе" - в 1975, 1976, 1977, 1978 гг. в Украинском научно-исследовательском институте картофельного хозяйства, пос. Немешаево, Киевской обл., 13. II Республиканской научно-теоретической конференции молодых ученых микробиологов. Ташкент, 1978 г. 14. VI конференции молодых ученых- ботаников Украины, г. Киев, февраль 1979 г. 15. Республиканской школе

передового опыта по теме: "Передовые приемы выращивания цветочных культур в РСФСР" - г. Ростов на Дону, 1981 г. 16. Школе передового опыта по выращиванию цветочных культур меристемным способом - г. Рига, 1983 г., 17. ^Всесоюзно м совещании "Культура клеток растений и биотехнология" - г. Кишинев, 1983 г., 18. VIII Всесоюзном совещании по вирусным болезням сельскохозяйственных растений - г. Вильнюс, 1984 г., 19. VI съезде Украинского микробиологического общества - г. Донецк, 1984 г., 20. Международном симпозиуме "Культура тканей и клеток растений - применение в улучшении урожая" - г. Оломоуц, ЧССР, 1984 г., 21 . VIII региональном совещании "Биоценотические связи в насаждениях искусственных фитоценозов", г. Кишинев, 1986 г., 22. Всесоюзной конференции "Вирусы микроорганизмов и растений", - г. Ташкент, 1986 г.,

23. Всесоюзной конференции "Новые направлешгя биотехнологии", г.Пущино

на Оке, 1986 г., 24. Международной конференции "Биология культивируемых клеток и биотехнология" - г. Новосибирск, 1988 г., 25. Международной конференции "Биометрические и генетические методы в селекциирастений", г. Леднице, ЧССР, 1988 г., 26. Конференции по методам диагностики микоплазм, г. Махарадзе, 1988 г., 27. На международных выставках в 1989 г. в Чехословакии (Флора-Оломоуц), ГДР (Internationale Gartenbau Ausstellung) и Москве (Интербытмаш-89), в 1990 г. в Швеции (Советская Россия), неоднократно на ВДНХ СССР, 28. Научной конференции, посвященной 100-летию открытия вирусов Д.И. Ивановским (2-6 сентября 1992 г., г. Ростов-на-Дону), 29. Международном симпозиуме Breeding, propa- gation, disease control of glasshouse flowers and other ornamental plants, Salaspils, Latvia, 3-5 - September, 1991. Salaspils, 1992, 30. Всероссийском съезде по защите растений (Санкт-Петербург, декабрь 1995 г.), 31. Международной конференции "Биология культивируемых клеток и биотехнология" - г. Москва, 25-28 ноября 1997 г.

Публикации. научных работах, в т.ч. в монографии "Biotechnology in agricultural and for- estry", Vol. 20 "High-Tech and Micropropagation IV", Springer-Verlag, 1992 P. 427-447 ( главе 26 "Micropropagation of virus-free ornamental in the USSR"); изданы З обзорные информации,получено четыре авторские свидетельства.

Материалы диссертации обобщены в 72 опубликованных

Copyright « « » & «A K -C »

поданы три иявки на выдач\ патента Российской Федерации разработаны и мрегистрированы в органах Госстандарта 7 нормативно-технических документов (технические vставня методики) соаа н научно-популярный фильм' Болезнь века"

работы. анализа литераллтэных источников по теме диссертации 6 па в

введения, собственных исследований обсуждения ре лльтатов выводов ирекомендаций

прои5водств\ Библиографический \казатель содержит ^81 наименование, us них 18" на р\сском языке Работа изложена на 2f>5 страницах машинописного текста, содержит о2 таблицы и 46 рис\нков

Стр\ Kntypa и объем

Диссертационнач работа состоит HJ

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1лаве ВИРУСНЫЕ БОЛЕЗНИ РАСТЕНИЙ И СПОСОБЫ

В ПОЛУЧЕНИЯ БЕЗВИРУСНОГО ПОСАДОЧНОГО МАТЕРИАЛА (обзор литьрат\ры) приведен анали$ состояния илченности распространения вир\сных мбочевании на картофеле и важнейших цветочных культурах методах диагностики главным образом пригодных для проведения массовых анализов в условиях производства и ранней диагностики для обеспечения достоверности системы оздоровления в условиях комплексных инфекции и унификации для широкого спектра растении Особое внимание уделено методам оздоровления от хронической вир\сной инфекции Дается анализ работ по применению методов культуры»? v;rra а также критика технологий с применение термотерапии Намечены пути устранения недостатков в построении У инфицированной технологии о иоровления широкого спектра растений

Г.мва 2. МАТЕРИАЛЫ МЕТОДЫ И УСЛОВИЯ ПРОВЕДЕНИЯ ИССЛЕДОВАНИЙ В качестве материалов настоящих исследований исполыовали методы оиоровления растений от вир\сов и приемы ускоренного размножения пораженные вирусами и бетнрусные растения вир\сные препараты антивирусные сыворотки методы вьшвления вирлсов и пол\^ение анпшир\сных сывороток организационные формы производства безвир\ сного исходного посадочного материала Способы озОоровтснич и инкроразлшоженин т vitro из\чали на растениях райошфованных сортах картофеля (окочо 20 сортов) цветочных растеших (около 30 сортов гвооики ремонтантной, около 30 - хризантемы 12 - герберы 12 - орхидей более 40 видов орнаментальных к\ тьтур) В работе были использованы растения лилии гладиол\са фиклеов, филодендронов, кордплнны земляники, винограда киви, мандарина ананаса стевии, инжира

При разработке системы мероприятий,

Растения обеспечивающей получение больших партии здорового материала применяли картофеля, также

полученные

первой

озаороа1енные

нами безвирленые растения различных сортов

гвоздики ремонтантной

хризантемы

8

орхидей

герберы

В

работе

Copyright « « » & «A K -C »

применяли растения лилии, гладиолуса, фикусов, филодендронов, кордилины, земляники, винограда, киви, мандарина, ананаса, стевии, инжира. Были испытаны технологии оздоровления, основанные на сочетании культуры стеблевых верхушек с термо- и химиотерапией и культуры истинных меристем. Вирусные препараты, используемые в качестве объектов исследований, получали из инфицированных растений. Вирус крапчатости гвоздики (ВКГ) выделяли из различных сортов гвоздики ремонтантной (Вильям, Уайт, Скания, Шокинги др.) с симптомами слабой крапчатости или без симптомов. В качестве сывороточного препарата использовали штамм ВКГ, выделенный из меристемных растений гвоздики, выбракованных по электронной микроскопии непосредственно в стерильной культуре. Идентификацию вируса осуществляли по морфологии частиц (были выявлены икосаэдрические частицы размером около 30 нм), серологическолгу анализу против сывороток производства кафедры вирусологии МГУ им. М. В. Ломоносова, проблемной лаборатории вирусных болезней растений и насекомых, Латвийской сельскохозяйственной академии, предприятия "Юнгпфлянце" (ГДР), института фитопатологии (Вагенинген, Нидерланды), а также при помощи электронной имуноморфологии. Для работы были отобраны изоляты, соответствующие одному типу частиц по этим методам, а также по симптомам на листьях Chenopodium quinoa Willd., которые соответствовали вирусу крапчатости гвоздики. Указанные препараты были проанализированы на отсутствие вирусов кольцевой пятнистости, латентного, прижилковой крапчатости гвоздики сыворотками производства указанных учреждений, а также сывороткой на вирус кольцевой гравировки гвоздики производства института фитопатологии (Вагенинген, Нидерланды). В-вирус хризантемы (ВВХ) выделен из растений хризантемы сорта Монако в совхозе " Деснянский" (г. Чернигова). Вирус мозаики цимбидиума (ВМЦ) выделяли из массы бессимптомных растений орхидеи фаленопсис, и идентифицирован при помощи сывороток к вирусам кольцевой пятнистости одонтоглоссума (ВКПО) и ВМЦ производства института фитопатологии (Вагенинген, Нидерланды), что дало возможность установить моноинфекциюВМЦ. Вирус желтой мозаики фасоли (ВЖМФ) выделяли из растений донника, произраставшего изолированно вблизи от лесного массива вдали от других посадок бобовых с симптомами сильной желтой пятнистости. Патоген идентифицирован при помощи сыворотки к вирусу желтой мозаики фасоли, производства предприятия "Юнгпфлянце" (ГДР). Другой штамм ВЖМФ выделяли из растений фрезии, произраставшей в Дагомысском чайном совхозе. Неидентифицированные вирусы: были выделены из растений пуансеттии, антуриума, герберы, лавра благородного. Вирус огуречной мозаики (ВОМ) выделен из хризантемы сорта Москвичка в совхозе "Деснянский" г. Чернигова и идентифицирован сывороткой к ВОМхр производства института фитопатологии (Вагенинген, Нидерланды). Моноинфекция была установлена по отсутствию реакции преципитации против ВВХ нашего производства и электронной микроскопии (выявлены

Copyright « « » & «A K -C »

однородные икосаэдрические частицы размера 30 нм) Сферический вир\с ро5ы бьп вылечен и % рсны сорта Kvim Элизабет ивеинной in Болгарии Сферический вирус тпиш выделен из растений лилии Нт-евидныи В1ф\с

выделен л|>иромасличных культур (г Симферополь) Латентный вир\с гвоздики потучен от академика ВАСХНИЛ И Г Атабекова Чистые к\льтуры микоплазм гвощики, цинерарии гибридной, гортензии пол\чены от кандидата биологических наук Л П Малиновской Для идентификации вир\сов поражающих и rvчаемые к\льт\ры в настоящей работе были испочь юваны диагностические антисыворотки производства различных на\чных учреждений (проблемная чаборатория вир\ сных болезней растений и насекомых Латвийской се льскохо 5яиственнои 1калем1Ш. предприятие Юнгпфлянце (ГДР), ИНСТИТУТ (фитопатологии в Вагенингене (Нидерланды), кафедра вирусологии Московского государственного университета им M B Ломоносова полеченная в Украинском НИИ с ч микробиологии (г Чернигов) и в Производственном предприятии меристемных к\ льтур г Сочи (к 20 вирусам и 4 микоплазмам) Структуру и функцию вир\сных поттяцнй определяли в различных ф1ггоценозах изучаемых к\ лылр

1аванды бьп

и$ лаванды, поточенной из Всесоюшого НИИ

Чистые

препараты

вирхсоь

выделяли

из

естественно

инфицированных растений и при иск\сственном зараженш! соответствующих штаммовых растений Накопление вир\сов в растениях контролировали серологически и электронно-микроппчески Для выделения вирусов

растительнлю масел промывали проточной водой и замораживали в испарителе бытового холодильника а затем измельчали на чочоде в 1 /15 VI фосфатном б\фере рН 7,17 Вир\ссодержащии сок фильтровали через капроновое сито, эм\ льгировали с перегнанным хлороформом (1/5-1/6 объема), а итем центрифугировали при 5 тыс об /мин в центрифугах J2 -21 и L7-5^ (BECKMAN) на холоде Из частично очищенного сока выделяли чистые препараты вир\ссв гельфильтрациеп на еэфарозе 4В и дифференциальным \льтрацентриф\пфованием Для изучения фшических характеристик вирусов использовали седиментационныи анали$ (анал1ггт1ескаял'чьтрацентриф\гаМОМ 3170 В, снабнченнаяшлиреноптиюй) Образцы исследовали в 12 мм ячейке при скорости вращения ротора (W)

26000 об/мин угле наклона (а) 45° и температуре (t) 20°C

седиментации определяли при концентрации вируса 0 28"о 0 21 % 0 14% и

о 0*6% растворенного в 0 (ПМ фосфатном б\фере Препараты

исследовали в электронных микроскопах ЭМВ-100Л, JEM-7a TESLA BS- э()() при инстр\ч!ентальном чвеличении 30-70 тыс раз и ускоряющем напряжении 75-90 киловольт Контрастирование препаратов проводили фосфорновольфрамовой кислотой и уранилацетатом в концентрации 1-2° о HMMV ноэлектроннлто микроскопию проводили методом декорирования и гр\ пшфования вир\сных частиц

так \рожасв картофеля применяли профилактические приемы предупреждения

Коэффициенты

вир\сов

В полевых условиях

при выращивании как первого

и второго

10

Copyright « « » & «A K -C »

заноса и распространения вирусов (внесения системных инсектицидов, индивидуальная санитария, в полевых условиях пространственнаяизоляция, применение гербицидов, исключение междурядных обработок, ранняя уборка). Регулярно проводили вирусологическую оценку выращиваемых растений. В теплице проверяли каждое растение, а в полевых условиях в первую очередь анализировали среднюю пробу клона, а во вторую - каждое растение. При разработке технологии оздоровления использовали рекомендации академика И.Г.Атабекова, а также многочисленных работ по использованию в этом аспекте культуры in vitro и результаты собственных исследований.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

В третьей главе "ИЗУЧЕНИЕ БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ВИРУСОВ И ИХ РАСПРОСТРАНЕНИЯ В КУЛЬТУРНЫХ ФИТОЦЕНОЗАХ" приведены результаты изучения пораженности вирусами ремонтантной гвоздики, хризантемы, орхидей, герберы, фрезии, лилии, нарцисса. В насаждениях гвоздики в большинстве случаев обнаружена крапчатая мозаика. При исследовании сока больных растений в электронном микроскопе выявлены сферические вирусные частицы размером около 30 нм. На листьях Chenopodium quinoa Willd. через 8 дней после инокуляции сока исследуемых растений появились светлые пятна. Вирус идентифицирован в реакции диффузионной преципитации в агаровом геле против сыворотки к вирусу крапчатости, полученной от различных учреждений. В выявлены растения, пораженные ВКГ. Моноинфекция ВКГ в этих растениях нами доказана электронно-микроскопическим методом - выявлены однородные сферические частицы диаметром 30 нм и серологически против сывороток к вирусам кольцевой пятнистости, прижилковой крапчатости, латентному, кольцевой гравировки гвоздики и ВОМ. Полученный штамм, обозначенный нами как "Сочи КР" (депонирован в коллекции ВИЗР), пригоден для получения чистых препаратов ВКГ как для изучения его биологических свойств, так и в дальнейшей работе по получению иммунодиагностических препаратов к этому патогену. Выделение и очистку ВКГ штамм "Сочи КР" выполняли по следующей схеме:

процессе работ по оздоровлению сортов гвоздики от вирусов

были

-Замораживание растительной массы гвоздики при -10°С на протяжении 24-48 час. -Гомогенизация вируссодержащего материала в фосфатном буфере рН

7,4;

-Отжим инфекционного сока через хлопчатобумажную ткань;

11

Copyright « « » & «A K -C »

-Прибавление к вир\ссодержащему

материал}

р-меркаптоэтанола и

тритона Х-100 в концентрации О 1-0,3%, -Выдерживание в течение 1 5-2,0 часа, -Прибавление в смесь бутилового спирта и ЭДТА до конечной концентрации 8 5% и О001 M соответственно, -Выстаивание в течение 18-20 часов и осветление взвеси центрифугированием при 6 тыс об/мин 30 мин -Удаление осадка, ценгрифчгирование стаернатанта при 32 тыс об/мин

в течение 100-110 мин,

НС1

-Удаление cvпернатанта, ресуспендирование осадка в0 01-0,12 Мтрис- буфере , р Н 7,5 ,

-Низкоскоростное центрифупфование при 5-7 тыс об/мин, -Удаление осадка, дополнительная очистка СУ пернатанта (вир\сный

препарат крапчатости гвоздики) в градиенте тотности хлористого цезия

в центрифуге L7-55

"BECKMAN" на протяжении 6 часов После центрифугирования очищенную вирусную ЗОНУ отбирали при помощи шприца Для освобождения от CsCl материал подвергали диализу против 0,01 М трис-HCl буфер рН 7,2-7 5 в течение 24 часов при 4-8°С Очищенный препарат ВКГ штамм "Сочи КР" спектрофотометрически имеет чистот\ Е^/Е 80 >1 7 При скоростной седиментации обнаружен один неразмываюицшся пик в течение 24 мин Электронно-микроскопически в поле фения обнаружены морфологически и стру кгурно однородные вирионы около 30 нм в диаметре При использовании электронной иммуноморфотогии (метод декор1пх>вання) бьпи покрыты все имеющиеся в поле зрения частицы что доказывает наличие только частиц В КГ Таким образом аналитическими исследованиями подтверждена моноинфекция ВКГ в полученном нами нюляте Это ПОСТУЖИТО основой применения его в процессе получения высокоактивных антисывороток, пригодных для сертификации о иоровленного посадочного материала

В растениях фатенопсиса этектронно-микроскопически выявлена высокая концентрация В1ф\са с нитевидной морфологией ПОЭТОМУ признаку патоген можно было отнести к потексвир\сам При помощи сывороток к вирусам мозаики цимбидиума и кольцевой пятнистости одонтоглоссума в препаратах идентифицирована моноинфекцияВ1ф\са мозаики цимбидиума Изучение биологических свойств % казанного изолята позволило использовать его препараты для получения диагностической антисыворотки к вирусу мозаики щшбидиума По нашим наблюдениям, сорта хризантемы в насаждениях цветоводческих \о$яиств полностью заражены вирусами Так насаждения сорта Петер Уайт в сов\О5е "Деонянскии" (г Чернигов) оказались на 100% пораженными мозаикой Электронно-микроскопическими исследованиями

в соке испытуемых растений выявлены нитевидные частицы которые по

1,2-1,4 в бакетроторе (SW-28) при 20000 об / мин

морфологии можно было отнести к карлав1фу сам Патоген идентифищфован

12

Copyright « « » & «A K -C »

при помощи сыворотки к В-вирусу хризантемы, полученной от К. Ортеля (ГДР). Необходимо отметить, что в указанном препарате отсутствовали сферические частицы (ВАТ, ВОМ и др.). Наши исследования были расширены для паспортизации вирусов на различных культурам. В частности были проведены исследования на орнаментальных культурах. По предварительным данным, орнаментальные культуры поражены вирусами, относящимисякразличным таксономическим группам. Выявлены вирусы: табачной мозаики, желтой мозаики фасоли, огуречной мозаики. Нами начато выделение вирусов из различных орнаментальных растений и их идентификация. Это позволит наметить пути ограничения их отрицательного экономического эффекта в цветоводческих хозяйствах, главным образом при выращивании оздоровленного посадочного материала гвоздики, орхидей, хризантемы, фрезии и др., как резерваторов инфекции для оздоровленных культур.

В четвертой

"УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ

МАССОВОЙ

главе ДИАГНОСТИКИ ВИРУСОВ В ОЗДОРОВЛЕННЫХ ФИТОЦЕНОЗАХ" приведены результаты исследования по разработке оптимальной технологии получения антисывороток. Разработка способа получения антисыворотки к ВКГ (Авторское свидетельство N1596530, приоритет от 16 февраля 1989 г.). Суть его в следующем. Высокоочищенный антиген ВКГ, штамм "Сочи КР", предварительно агглютинируют эритроцитами того же животного (кролика), которого иммунизируют препаратом указанного антигена. Для этого из ушной вены кролика берут 2,0-2;5 мл крови (консервант - 2,5% лимоннокислый натрий), отстаивают, сыворотку удаляют, а эритроциты в течение 5 мин. отмывают при 5000 об/мин, стерильным 0,85% NaCl. Затем к отмытым эритроцитам прибавляют антиген из расчета 5-10 мг белка на 1 кг массы кролика, смесь выдерживают при комнатнойтемпературе 15 мин. Указанный • антиген готовят перед каждой иммунизацией и вводят кроликам внутривенно с перерывом в 3 дн я по предложенной схеме: 1,2 день - по 0,25-0,5 мг белка в 1 мл смеси вируса и эритроцитов на 1 кг массы животного; 3 день-0,5-1,0 мг белка в 1 мл смеси вируса и эритроцитов на 1 кг массы животного; 4,5,6 дн и - перерыв ; 7 день-0,5-1, 0 м г белка в 1,5 м л смес и вируса и эритроцитов на 1 кг массы животного; 8 день - 1,0-2,0 мг белка в 2 мл смеси вируса и эритроцитов на 1 кг массы животного; 9 день - 1,25-2,5 мг белка в 2 мл смеси вируса и эритроцитов на 1 кг массы животного.

На 20 день животным вводят внутривенно 1,25-2,5 мг белка в 2 мл смеси вируса и эритроцитов. На 30 день производят отбор крови и определяют титр антисыворотки в реакции преципитации в агаровом геле (табл. 1).

13

Copyright « « » & «A K -C »

Тлб'иша

1

Эффективность базовой схемы иммтаимшш крочнков антигеном ВКГ (на 8 крочиках) Поточено антисыворотки

».

Потучено антисыворотки Г

по отборам, мт

, посте реимм\ шпации

мл I

1

i

_2_

77

^

76

]

3

итого ~Г

I

2_

i

итого]

62

\~ 215

j

79

79

[

Ь3_"[~37 1

В среднем на 1 кролика 46 4±10,8 мт На основе проведенных

2)

Таблица 2. Аналитический паспорг на <штисыворотк\ к ВКГ

исследований разработан аначитический

паспорт на аитисыворотки (табт

|

2

3

4

5

6

7

8

 

Прозрачный,

7,16

93,5%

9 , Содержание белка

12,6%

10 i Титр специфических антител

i

1 2048

Сказанные исстедования испотьзованы дтя разраоотки "Технических

УСЛОВИЙ" (ТУ) на HOBVTO продукцию- 'Сывороткидиагностические квир\сам

цветочных KvibTvp", которая яатяетсч основным

документом припроизводстве антисывороток к вир\сам цветочных к\льтур

Разработка способа повышения тнтра антисыворотки (А.вторское овидететьство N1448449 приоритет от I сентябри 1986 г) При работе с о иоровленным постдочным материатом как в процессе оздоровления так и при массовом размножении в первичных звеньях семеноводства важно повышение чувствитетьноети системы диагностики В этом плане необходима разработка методов потечение антисывороток высокого титра в процессе имммшишш животных в частности с применением адьювантов среди которых на первом месте иьювант Фрейнда (Гнутова 1985) Рез\ тьтаты его испо1ьювания показали выход 9090 относитетьных единиц в среднем из 7 критиков Габ.ища 3. Выход сыворотки по 7 кроликам при иммунизации антигеном ВКГ штамм "Сочи КР" с адьювантом Фрейнда (фирмы SIGMA-CIIIA)

нормативно-тех1гическим

1

1 отбор

|

|

.

85

1

3136

1

12,1

448

1

2

мл

67

9 6

отбор

титр

2816

402

14

оыход ант! ггел в единицах

относитетьных

1

2

L

V

36160

29192

63632

5165 7

4170

9090

Copyright « « » & «A K -C »

С целью получения большего эффектамы применилипрепарат из группы

"бромид-2,3,5,б-тетрагидро-7-карбомоилметил-6-

иммуномодуляторов - феншпши-дазо[2, 1-6]-тетразолия" - камизол (Б-58).

Таблица 4. Реакция животных на иммунизацию антигеном В КГ, штамм

"Сочи

КР" в сочетании с различными дозами камизола (средняя из

кроликов)

4-х

N

1 отбор

2 отбор

 

Б-58

1

2

S

1

100

16

1024

14

1024

16384

14080

30464

2

120

14,8

2048

13

2048

30208

26624

56830

3

150

13

1024

13

1024

13384,5

13568

26956

Как видно из приведенных материалов при помощи камизола нам

удалось в 3 - 5 раз увеличить выход диагностикума в расчете на

дляВКГ. Метод электронной микроскопии использовался в нашей работе как конечный тест отбора безвирусных линий, а также при паспортизациивирусов на многочисленных орнаментальных растениях находящихся в коллекции (Рыбалко, 1992).

Существующий способ повышения чувствительности этого метода - иммуноэлектронную микроскопию мы использовали в двух вариантах: для повышения чувствительности метода при отборе безвирусных линийза счет повышения адгезии вирусных частиц на опорной пленке-подложке, обработанной специфическими антителами и для доказательства моноинфекции штамма ВКГ "Сочи КР" при разработке способа получения диагностической сыворотки (АС N1448449). С целью выявления возможности неспецифического повышения чувствительности метода электронноймикроскопии при выявлении вирусов нами разработан способ (заявка N4954353/13-051667), основанный на применении энергии электромагнитных волн сверхвысокочастотного диапазона (длина волны 12.6 см), обработка пленок-подложек этим излучением при мощности 20 ватт в течение 5 мин. достоверно увеличивала количество вирусных частиц в поле зрения электронногомикроскопа.

1 кролика

в

Усовершенствование системы массовой диагностики вирусов оздоровленных фитоценоза*. На основании известных и вновь разработанных методов определена система массовой диагностики вирусов на последовательных этапах технологического процесса производства оздоровленного посадочного материала различных культур. В процессе исследований по получению оздоровленного посадочного материала ремонтантной гвоздики нами определены следующие методы в системе диагностики: электроннаямикроскопия, иммуноферментный анализ, радиальная иммунодиффузия.

15

Copyright « « » & «A K -C »

Как покапл и наши исследования \cnex оиоровлення определяет испо1Ь5ованнс на первых этапах процесса производства товарного о иоровленного посадочного материала высохоч\вствительных методов диагностики вир\ сов Разработанная нами система диагностики включена в 'Типовую технологию поучения исходного безвир\сного посадочного материата ремонтантной гвоздики", \твержденную Научно-техническим Советом Г и в 5еленчо u VDKKX РСФСР в 1981 г (протокол МО) Указанная технология с 1981 г применяется в проншодстве товарного оздоровленного посадочного материала многочисленных сортов ремонтантной гвоздики и др\ гих цветочных к\льтур

реагентов

для

выявление

микоплазмонодобных

Получение организмов. Мы изучали возможности получения диагностических антнсывороток к МПО стотоура пасленовых, израстания гвоздики а также выделенные из растений цинерарии гибридной и гортензии хранящиеся в чистой к\ тьтуре Проведено потучение на их основе реагентов для имм\ ноферментного анаипа, а также и учение вошожности \вешчення специфичности антисывороток к этим патогенам путем имм\низании животных с\бклеточными стр\кт\рамн (мембранами), выделенными из МПО поражающих различные растения (Рыбалко А Е с соавт, 19926) На основе применения баюваи схемы имм\шнации получены первые партии антисывороток к чьлшнным патогенам и выдетенным из них мембранам Отработана методика пот\чения иммл ноглоб\ линов и пероксида шыч конъюгатов для постановки имм\ноферментного анализа на эти патогены

i.iaue

"ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ОБОСНОВАНИЕ И

В РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ МАССОВОГО ОЗДОРОВЛЕНИЯ РАСТЕНИЙ ОТ ВИРУСОВ МЕТОДОМ КУЛЬТУРЫ МЕРИСТЕМЫ" пложены регчьтаты исследования по разработке \инфицированной

технологии массового получения растений-регенерантов из эксплантатов

а нарастания малого размера (100 мкм) В этом плане осуществлено

кондишюшфование \словий питания т о Л1фованное ткани на разных этапах органогенеза с целью ускорения регенерации и \вечичения выхода безвир\сных растений, и с сохраняющими сортовые признаки исходных В связи с тем, что имеется ряд татерат\рных источшшов, в которых сообщается о наличии В1ф\са в меристеме методом фллоресцируюших антител были изучены степени попадаемости в1ф\сов в меристем\ Исполь ювали растения

ко т

пиши

16

Copyright « « » & «A K -C »

картофеля сорта Черниговчанка, пораженного МВК. В зонах 300, 200, 100 мкм вирусы выявлены в 100, 80, 20% случаев. Электронной микроскопией

при исследовании стеблевых верхушек (размером 300 мкм) картофеля сорта Искра вирионы МВК выявлены в 100% случаев. В препаратах, приготовленных из верхушек сорта Гатчинский размером 100 мкм, только в

4 из20 выявлены единичныевирусные частицы. Следовательно, значительная

часть меристем размером 100 мкм свободна от вирусов.

(Авторское

Разработка технологии оздоровления растений

свидетельство № N1608845 приоритет от 22.07.1990 г.) Для массового получения безвирусных растений мы провели исследования по разработке двухфазного метода регенерации их из истинных меристем (100 мкм). Двухфазность процессов органогенеза в культуре ткани выявлена Бутенко (1962). Суть ее заключается в подборе условий питанияна различных этапах органогенеза. При испытании питательных сред Мореля, Мурасиге-Скуга и ВанГофа наилучшие результаты получены на последней (табл. 5).- Изучение оздоровительного эффекта эксплантатов различного размера было проведено на растениях трех сортов картофеля (табл. 6). Поданным электронной микроскопии оздоровительный эффект эксплантатов размера

100 мкм достигал 50,0-83,3% от числа регенерировавших. В тоже время выход

свободных от вирусов растений из эксплантатов размера 250 мкм составил всего 4,7-28,5%. Данные таблицы свидетельствуют также и о сортовой разнице как в приживаемости эксплантатов, так и в выходе безвирусных растений по обоим размерам.

Таблица 5. Влияние состава питательной среды на регенерацию ростков го меристем различных сортов гвоздики ремонтантной */ Ван-Гофа образовало росток

Сорт

Мурасиге-Скуга

образовало росток

 

шт.

%

шт.

%

22

73,3

28

93,3

19

63,3

26

86,7

23

76,7

22

73,6

18

60,0

28

92,3

.

22

73,3

26

86,7

104

69,2

130

86,6

*/ - посажено по 30 меристем.

17

Copyright « « » & «A K -C »

6. Влияние размера

эксплантатов на выход безвир\сных

Таблица растении картофеля

по даньш электронной микроскопии*/

 

'

 
 

%

"*

100

'

12

40

0

10

83

3

100

6

20

0

50

0

100

!

15

50,0

 

8

S3 0

250

21

70,

6

28

0

250

21

70

0

1

4,7

250

26

86

6

4

13 3

Сафир '/посажено по 30 меристем каждого сорта

Изучение

приемов

антивирусного

кондиционировании

шиагельиьп сред

Дтч выявления возможности получения здоровых растений из стеблевых верхлшек мы использовали ингибиторы вирусов, выде ленные издрожжей в Институте микробиологии и вир\сологии им Д К Забочотного АН Украины (канд би т HOVK А Г Коваленко) а также обнаруженный нами эффект антивирусного кондицион1фования питательных сред тканями растении- продлцентов ингибиторов вир\сов Оценк\ действия изучаемых факторов проводили поданным электронной микроскопии

При к\льтивировании

из дрожжей. стеблевых верх\шек картофетя сорта Приекмьский ранний пораженного ХВК выход $доровых растений составил в контроле 40 % 41-КЛ 70 % 41 - ВН 2-ОДЭ-1 -76 6 % При эффективным было использование препарата 1-ОДЭ По обоим препаратам

до5ы в 100 и 250 мг/т имели гримерно одинаковое действие (табл

Использование препаратов

оздоровлении

ремонтантной

гвоздики

от

ВКГ наиболее

7)

Таблица 7. Влияние ингибиторов и$ дрожжей на оздоровление ремонтантной гвоиики от вир\са крапчатости в кмылре стеблевых верх\ шек*7

 

1

безвир\еных

 

мг/л

1

1

14

4

28

2

1- 1-ОДЭ II

100

15

12

78

"'

1-ОДЭ 1|

250

13

9

70

4

-2-ОДЭ

,

100

15

7

47

5

-2-ОДЭ

I

250

6

46

*7-ткажено по 15 стеблевых верх\шек размера 300 мкм в каждом варианте

18

Copyright « « » & «A K -C »

Совместная культура стеблевых верхушек с тканями различных растений. Вещества, в различной степени проявляющие антивирусный эффект, выделены из многих растеши! (Рыбалю, 1984), причем некоторые из них получены в чистом виде (Ragetly, Weintraub, 1962). Однако попытки использования этих веществ в терапевтических целях пока не увенчалось успехом, хотя в подавлении инфекционности вируса в соке положительные результаты получены (Бобырь, 1976). Известно кондиционирование питательных сред выращиваемой тканью; на этом основано применение тканей-нянек при выращивании растений из отдельно живущих клеток (Бутенко, 1971). Мы изучали возможность антивирусного кондиционирования питательных сред тканями растеши!, из которых выделены ингибиторы вирусов (Рыбалко, Харута, 1977а). При подсадке ткани Dianthus barbatus L. длина стебля, масса растения картофеля сорта Приекульский ранний увеличилась в трои раза. Вирусологическими исследованиями выявлено, что при использовании подсадки различных тканей значительно увеличился выход здоровых растений из заведомо зараженных вирусом стеблевых верхушек (табл. 8). В этих опытах были использованы стеблевые верхушки размера 300 мкм. Таблица 8. Сравнительное изучение эффективноститканей различных растений при оздоровлении картофеля сорта Юбелъ от X+M+S вирусов

Посажено Регенери- В т.ч. безвирусных Вариант верхушек. ровало,
Посажено
Регенери-
В т.ч. безвирусных
Вариант
верхушек.
ровало,
шт.
шт.
шт.
%
Контроль
100
22
2
9
Томаты
Dianthus barbatus L.
Dianthus cariophyllus L.
Chenopodium quinoa L.
80
24
4
6
100
43
23
52
100
20
18
90
100
33
22
78

Для выявления возможности получения здоровых растений из стеблевых верхушек размером 500 мкм испытывали ткань зверобоя обыкновенного в сравнении с ранее испытанными (табл. 9). В этом опыте в контроле не было получено здоровых растений. Ткань зверобоя обыкновенного превосходила по противовирусной активности ткани обоих видов гвоздики втрое. В этом варианте выход здоровых растений из стеблевых верхушек картофеля, пораженного вирусом X картофеля, составил 75%. Однако ткань зверобоя очень трудно вводить в стерильную культуру, так как только единичные культуры из многих десятков оставались неинфицированньши. Эти культуры выдерживали лишь несколько пассажей. Такое же положение сложилось и с тканью лебеды гигантской, что свидетельствует о необходимости отработки режимов выращивания и поддержания указанных тканей для использования в практическом оздоровлении сортов, а также в широком изучении форм использования их в оздоровлении многочисленных растений, для которых

19

Copyright « « » & «A K -C »

пока неотработаны режимы регенерации бе шир\сны\ растений из истинных меристем

Таблица 9. В таяние ра.личные тканей на о сюровленпе картофеля сорта И^кра от ХВК в к\льт\-ре стеблевыч верхмиек размера 500 мкм Регенерировало ростков

Коитро1Ь

Dunthus barbatus L

Dianthus ca n ophv llns L

H\pencum perforatum L

Вариант

 

[

 

0

8

2

10

2

12

9

ч ое ширусныч

1

1

~

°<>

0

25

20

75

i

1

i

*' посажено по 30 стеблевыч верх\шек Разработанная течнология использована дтя осуществления ^окрашенной куль-поры картофеля в \с"ювия\ Крайнего Севера, проведения опытов по разработке технологии поучения растительных ферментов (продуцент Ficus canca) природныч подстастителей (Ste\ m rebaudiana (Bert) Bertoni) ндушистых вешеств (paэтичные кчльтиварыдендратемы) в KVTbTvpe in i tiro

В шее гон главе ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ОБОСНОВАНИЕ

СИСТЕМЫ ПРИЕМОВ ПОУЧЕНИ Я ЗДОРОВОГО ПОСАДОЧНОГО М ЧТЕРИАЛА приведены материаты по разработке способов \скоренного

р имнолсенияоиоровленияот вир\(.овимикопла.5м\1атьриала Какишестно зтог прием не сообщает растениям иммлнитета к инфекции Нашчие широкого инфекционного фона ставит на первый та н !ащит\

^.^м^новодческич посевов на всьчэтапах\скоренного размножения и в перв\то очередь при интенсивном первичном размножении исчодныч бе?вир\ч-ныч

р lCTLHitii (оригинальныч меристемныч растении)

наибоче^ перспективным приемом являетст клона 1ьное микрора!мжъкение в клтьтлре иг \itto

В

зтом

тан е

Много 1етние данные

по \екоренном\

рашножению

картофеля в

прсчпфочнои к\чылре noiBoitnn нам определить ко )фф1шиентра!мнолсения

р шныи I ^ в месяц

н прсю1фке в течение ^ мее по пчить •?()()()растении чго огфеделяет мощность

раоагы мотьног о биоцентра Это котичество достаточно для посадки в

Это по шотяет при на шчшг одного бе шир\еного растения

?00 м

ити о^лш^ствченич дв\ члро/каинои кмылры

^ тошадью

тя на 1га

е Д1Ч \ rvчтения

приживаемости ингредиентов питательной среды (АС СССР N160S84S)

микрочеренков по юорано сочетание

20

Copyright « « » & «A K -C »

Изыскание

приемов

содержания

коллекционных

культлр.

Актчальным является создание коллекций оздоровленных сортоооращов в к\чьт\ре т vitro обеспечивающей saunrn от всех видов реинфекшга С 1976 г в лабораторной коллекции Укр НИИ с \ микробиологии мы поддерживал и более 20 сортов различной скороспелости Не выявлено сортовых различий

в росте растений

проведена контрольная электронномикроскопическая проверка растений некоторых сортов на вир\соносительство Оказалось что все проверяемые сорта были безвир\сными

vitro

выращиваемых

в кчльтуре т

В дальнейшем была

Нами проведено и$ыскание приемов консервации коллекционных

к\ тьтгр Известно использование для этой цели низких температур (Шмыгтя,

1974)

а также ингибиторов роста (Трофимец с соавт, 1974, Фенина, 1975)

Для консервации коллекционных к\ льтур мы испытывали препарат ТУР (члорхолинхлорид) и некоторые метаболиты почвенных микроорганизмов,

в частности пишлгатовую (ГГ) и феназин-1-карбоновую (ФК) кислоты (ПИНЧУК

с соавт, 1979) Препараты в до sax на 1 л питательной среды ТУР - 2 мл, П

и ФК по 10 мг достоверно влияли науменьшение длины стебля \ двух сортов В последействия не выявлено влияния этого приема на морфологические признаки и проду ктивность растений

Получение мшшклубнен in vitro (тлбернзация) имеет важное шачение

в плане транспортировки на большие расстояния и при ведении коллекций гак как МННИКЛУОНИ могут сохраняться длительное время на ограниченной площади Появление «ептшеи мы нередко наблюдали при выдерживании растений без пересадок в течение 3-S месяцев или при слабом освещении Имеются сведения о кондиционировании мловии туберизации \ картофеля т vitro в нашей стране (Морозова Мелик-Саркисоп 1У78) и и рубежом (Palmer Smith 1969) Это позволяет считать вопросы клуонеобразования в стерильной к\лылре (тиЗеризошш) экспериментально обоснованными Для

планомерного поучения клубней в стерильной к\льт\тре мы использовали методикл Пальмира и Смита Она иключается в следлтошем черенки или к\ сочки ростков в сахарных стаканчиках по 5 шт высаживают на питательную среду Murashige-Scoog с повышенньгм содержанием сахарозы (до 6° о) и кинетина (до 2 5 мг/л) К\ льпры выдерживают в темноте при

2(hr2° С

К тш и обраллотсл

в паз\хах

листьев в течение

1-1 5 месяцев

Разработка меюдики получения миничеренкон При пересадке пробирочныч растений в ПОЧВУ наблюдается шачительныи отпад Нами ра фаботан прием потоляющий избежать этих затруднении При выращивании растении в пробирках в фазе 5-6 междо\ пи й от них в стърильны\\с ювияхотделяютMifflii4epcHKH(BepwuiK\ с2-Ч межаомлиялш) И\ основания обрабатывают стимуляторами роста в (0 <)<П°о спиртовом растворе и-НУК в течение 1^ сек ) высаживают в герметические камеры и 5 оргстекла и выдерживают до укоренения

21

Copyright « « » & «A K -C »

В этих камерах размещается 250-350 миничеренков. Камеры с миничеренками мы выдерживали при освещенность около 10 килолюксов и 16 часовом фотопериоде и температуре 25±2°С. В этих условиях укоренение миничеренков ремонтантной гвоздики происходит в течение 20±3, хризантемы 12-15 дней. В опыте показаны преюгущества миничеренков в сравнении с пробирочными растениями после пересадки в почву. Миничеренки быстрее приживаются и более интенсивно растут.

Размножение растений черенками и в двухурожайной культуре. Для ускоренного размножения безвирусного картофеля мы использовали методы отводков и черенкования в сочетании с двухурожайной культурой. При этом первый урожай получали в весенние месяцы с использованием защищенного грунта, что обеспечивало защиту от заноса инфекций извне, поскольку вегетация растений протекает в период, когда нет посадок картофеля и других культур - резерваторов вирусов (временная изоляция). Отработка этой методики начата в 1971г. на примере сорта Приекульский ранний. Для получения первого урожая в период март - май использовали защищенный грунт, второй урожай получали на изолированном торфянике в пойме реки Замглай (Черниговская обл.), с начала июня по конец августа, используя проращенные в теплице клубни. Потомство каждого растения, вьфащенного в теплице, высаживали отдельно. Таким образом, можно считать выращиваемые в теплице растеши как клоны первого, а на изолированном торфянике - второго года. Вирусологическими исследованиями установлено, что первичное размножение картофеля отводками, черенкованием интактных растений и делением пробирочных растений по количеству междоузлий (клональное микроразмножение) практически не влияет на пораженность потомства вирусами. Во всех случаях на последующих этапах размножения обнаруживали лишь единичные растения, пораженные X, У, S - вирусами. При массовом размножении материала в различных опытах 1973 г. пораженность вирусами составила: ХВК -0.02%, SBK - 0.05%, МВК - 0.25% (по данным серологических анализов) и скручиванием листьев - 2% (по визуальной оценке). ИнфекцияМВК прогрессировала и в 1974 г. составила 3%. Между тем 28 безвирусных клонов 1971 г., размноженных индивидуально, были свободны от вирусов. Половина тех же клонов, размножаемых обезличенно в двухурожайной культуре, была поражена МВК на 0.036%. FBK и ВТМ ни в одном случае не были обнаружены. элиты различалась как по уровню зараженности, так и по составу возбудителей. Если обычная элита была поражена ХВК и комплексной инфекцией, пораженных растений было 82-92%, то меристемная - в основном МВК, причем пораженных растений было всего 4-15%. При полевом размножении сортов Гатчинский, Огонек и других также обнаруживали только единичные растения, пораженные X и S -вирусами. Это свидетельствует о том, что тщательное соблюдение мер профилактики распространения вирусов позволяет сохранить материал в оздоровленном

Пораженность

вирусами

меристемной и обычной

резко

Copyright « « » & «A K -C »

Оздоровление цветочных кмьтур начато в 1976 г Первым объектом исстедования выбрана гвоздика Основным патогеном на этой клтьтуре является вир\с крапчатости гвоздики, так как он первым поражает оздоровленные насаждения (Eskenaz\ et al , 198"?) и может СЛУЖИТЬ критерием санитарного состояния насаждении (Poupet 1975) При массовом производстве о шоровленного посадочного материала на базе безвирусных мериклонов полученных us истинных меристем (100 мкм) и отобранных при помощи электронной микроскопии ежегодно формируется суперэлитный маточный питомник В 1981 г эти растения выращивали и изучали на продуктивность и пораженность ВКГ клоновым методом, те анализировали каждое растение в рамках тинии (потомство отдельной меристемы) В ре !\ тьтате было установлено, что линии полученные из истинных меристем (100 мкм) были свободны от этого патогена в течение года (срок использования насаждения для получения коммерческой проду кции) В поражение вирусами промышленных насаждений гвоиики на предприятии

низкое

(рис

целом

1)

1ыс

растении

38

36

34

32

зо

28

26

24

22

20

18

16

14

12

10

S

б

4

2

I

;

|

I

'

же многолетними

исследованиями установлено

1981

1982

1УЯЗ

19X4

№<

1986

1987

инфицированных растении

тгоровьгх растении

1 Пораженность маточника гво иики ВКГ по данным многолетних исследовании

Рис

Copyright « « » & «A K -C »

глава.

ФОРМ ВНЕДРЕНИЯ МЕТОДОВ БИОТЕХНОЛОГИИ В ПРОИЗВОДСТВО посвящена выбору стратегии использования достижений биотехнологии, в частности разработок диссертанта, в интересах народного хозяйства. В системе коммунального хозяйства Российской федерации создано научнопроизводственное предприятие для разработки и внедрения ресурсосберегающих биотехнологий оздоровления растений от вирусных заболеваний и иммунодиагностикумов для выявления широкого спектра вирусов и микоплазм, поражающих цветочные и другие растения с целью создания интегрированной системы борьбы в оздоровленных фитоценозах. С этой целью была разработана и утверждена Минжилгомхозом РСФСР "Типовая технология получения исходного безвирусного посадочного материала ремонтантной гвоздики". Она включает нормативно-технические требования к материалам и оборудованию, применяемым при производстве оздоровленного посадочного материала и все звенья технологического процесса - от выделения меристем до получения элиты на меристемной безвирусной основе (рис. 2)

Седьмая

ИЗУЧЕНИЕ

ОРГАНИЗАЦИОННЫХ

Рис. 2. Схема технологического процесса производства оздоровленного посадочного материала ремонтантной гвоздики

Указанный технологический процесс является базовым для оздоровления и других цветочных культур. Данные производства оздоровленного посадочного материала гвоздики и хризантемы приведены в табл. 10.

24

Copyright « « » & «A K -C »

10. Прои шодство оздоровтенных

шт )

:Гне

i

i

1

1

Таблица чримнтемы за 1982-1989 гг( в тыс Годы

Гвоздика

vкорененные

1982

f

529

99

i

j

1983

870

78

1984

i

910,12

 

1985 65

1428

1986 ,

1110

09

1987 47

1670

 

1988 81

1916

1989 '

 

,его укоре

не

1

1

черенков гвоздики и

\ корененные'

vкорененные

 

1

56 58

48 09

14 64

,

12 47

149 23

134 57

172,45

13841

221,70

191,37

279,95

707,79

vкорененные

354,29

735 3S

'70 07

1104,8

910.05

1186,44

1314,32

1026 64

756Т.98 ~

Разработка принципов стандартизации биотехнологии п цветоводстве (техночогии оздоровтения растений, о!доровленныи посадочный материал биопрепараты для диагностики возб\дителей вирлсных и вир\ соподобных шболеваний) Требованиями управления качеством и необходимостью включения в номенклатуру новых видов прод\ кции продиктована необходимость разработки нормативно-технических документов на продукцию так как получаемая в процессе нсспедований продукция мопа быть отнесена к новым видам Первым прои5водство новой для народного хозяйства продукции - бе$вир\сных мериклонов цветочных растений, бьпа "Типовая технология пол\чения исходного безвир\сного посадочного материала ремонтантной гвоздики", разработанная нами на основе собственных экспериментальных материалов и утвержденная Научно-техническим советом МЖКХ РСФСР в июне 1981г Указанная технология стала базовой для производства оздоровленного посадочного материала и других цветочных растений и обеспечила внедрение в производство новой для народного хозяйства продукции с высоким экономическим эффектом Это послужило основанием для расширенияработ, а также включением их в Общесоюзную научно-техническую программ} 074-06 "Разработать биотехнологические методы пол\чения ценных дтя медицины и сетьского хозяйства продуктов и внедрить их в производство". Задание 03 "Ослществоть клонатьное микроразмножение и оздоровление ценных сельскохозяйственных к\льтур создать исходные формы для получения новых сортов сельскохозяйственных растений с использованием методов клеточной инженерии", 03 01 т Осмцествить клоначьное микроразмножение и оздоровление ценных форм хозяйственно важных растений с помощью культуры клеток и тканей в т ч 03 01 08 - цветочно- декоративных растений" Дтя осуществления массового производства безвир\сного посадочного материала и проведения исследований по

нормативно-техническим

документом,

узаконившим

25

Copyright « « » & «A K -C »

упомянутой теме Минжилкомхозом РСФСР по разработке диссертанта организовано Производственное предприятие меристемных культур. В задачу предприятия входит разработка и внедрение в производство ресурсосберегающих технологий оздоровления и микроразмноженияценных цветочных и продовольственных культур, производство имигунодиагностических препаратов к патогенам, поражающим цветочные и продовольственные культуры (вирусы, микоплазмы). Для производства новых видов продукции и управления качеством необходимо обеспечение нормативно-технической документацией (Рыбалко, 1988в).

С 1986 г. совместно с Краснодарским филиалом ВНИИстандартизации

приступили к разработке нормативно-технической документации. Разработанная схема (рис. 3) предусматривает стандартизацию технологического процесса, готовой продукции на всех стадиях жизненного цикла, методов контроля (Рыбалко, 1988, Рудоминская с соавт., 1988; Рыбалю, Рудоминская, 1988).

стандартизации с современных требований государственной стандартизации к качеству продукции.

сформулирована

Концепция

учетом

биотехнологий

специфики объектов

в

цветоводстве

стандартизации

и

СТАНДАРТИЗАЦИЯ ПРОИЗВОДСТВА БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКОЙ ПРОДУКЦИИ

ТЕХНОЛОГИЯ РЕГЕНЕРАЦИИ ПРОИЗВОДСТВО
ТЕХНОЛОГИЯ
РЕГЕНЕРАЦИИ
ПРОИЗВОДСТВО
КОНЕЧНАЯ РАСТЕНИЙ ПРОДУКЦИЯ БИОПРЕПАРАТОВ
КОНЕЧНАЯ
РАСТЕНИЙ
ПРОДУКЦИЯ
БИОПРЕПАРАТОВ

ИЗ МЕРИСТЕМ

ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ

ТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ

ОПЕРАЦИЙ

ОСТ

РЕЖИМЫ

РЕГЕНЕРАТ

ТУ

ОРИГИНАЛЬНОЕ МЕРИ- СТЕМНОЕ РАСТЕНИЕ

ТУ

МИНИ-ЧЕРЕНКИ,

ПРЕПАРАТЫ

ДИАГНОСТИЧЕСКИХ

АНТИСЫВОРОТОК

ТУ, ГОСТ

ПРЕПАРАТЫ ЧИСТЫХ

КУЛЬТУР ТУ ОСТ ВИРУСОВ
КУЛЬТУР
ТУ
ОСТ
ВИРУСОВ

ЧЕРЕНКИ,

ТУ, ГОСТ

ТУ

Рис. 3. Схема стандартизации биотехнологической продукции

26

Copyright « « » & «A K -C »

В схеме представлены направления, объекты и уровни стандартизации производства меристемного посадочного материала и диагностических препаратов В документах регламентируются требования к исходным растениям-донорам меристем методам их отбора и контроля Определена последовательность выполнениятехно логических операции культшлгрования меристем с момента извлечения из исходного растения до выхода готовой прод\кшш Требования к качеству готовой продукщш дифференцированы в зависимости от технологической стадии ее получения Стандартизации подвергал ты показатели качества биопрепаратов используемых для тестирования оздоровленного материала на наличие вир\сов и препаратов чистых культур вир\сов применяемых для получения соответствующих диагностических антисывороток Разработанный комплекс документов по стандартизацпн способствует внедрению прогрессивной высокоэффективной технологии в производство и органгоации широкомасштабного выращивания оздоровленного от вирусных инфекций высококачественного посадочного материала цветочных растений Практическая реализация налчно-технических стандартизацию позволяет унифицировать методические подходы к решению вопросов по обеспечению производства высоко эффективнымитехнологиями, а потребитетя - продукцией высокого качества Опыт разработки комплекса нормативно-технических документов для биотехнологическои продукции в отрасли промышленного цветоводства может сТУЖИТЬ на\чно-методической базой для организации работ по стандартшации аналогичной продукции агропромышленного комплекса

достижений

через

Массовое производство безвирлсного посадочного материала. С самого начата исследований поллченные резллыаты проходили производственную проверку Так, с 1 кг бе!вир\сных клубней сорта Приек\ льский ранний выращено в 1971 г -0 5 т, в 1972 г - 3, От, в 1973 г - •>0 О т в 1974 г - 2000 0 т (в различных хозяйствах Украины) До 1974 г внедрение проводили в опытном хозяйстве Украинского НИИ с х микробиологии (г Чернигов) а с 1974 г начато испытание о щоровленного в КУЛЬТУре меристемы картофеля непосредственно в семеноводческих хозяйствах а также в научно-исследовательских учреждениях Результатом проведения этой работы было получение в 1975 г опытным хозяйством института элиты на меристемной безвирчснои основе В ряде хозяйств доказаны преимущества этого материала в сравнении с полученным при помощи серологических клоновых отборов

С материала цветочных растений на примере гво шпси ремонтантной С целью повышения производительности труда проведено изучение возможности унификации основных приемов оздоровления и микроразмножения для различных растений Установлено, что для картофеля гвошпси хризантемы орхидей герберы лилии гладиоллса фиклсов филодендронов, кордилины, !емляники винограда киви мандарина ананаса стевии, инжира,

27

1981 г начато массовое производство оздоровленного посадочного

Copyright « « » & «A K -C »

папоротников, стевии, и др. возможно применение общего технологического процесса на этапах приготовления питательных сред, введения растительных тканей в стерильную культуру, регенерации, микроразмножения, акклиматизации. Это дало возможность расширить ассортимент растений, включенных в процесс массового размножения методом стерильной микрокультуры. Только за 1986-1990 гг. (в рамках выполнения общесоюзной научно-технической программы 074-06 "Разработать биотехнологические методы получения ценных для медицины и сельского хозяйства щюдуктов и внедрить их в производство") получено 175599 мериклонов различных культур (табл. 11). Таблица 11. Производство безвирусных мериклонов для формирования оздоровленных маточников в различных хозяйствах СССР (1986-1990 гг.)

1986

1987

1988

1989

1990

27200

31980

39600

46221

25618

170619

40

234

1626

3030

4930

27200

32020

39834

47847

28648

175549

иммуноднагностикумов. В связи с широким внедрением методов массового оздоровления в практику производства коммерческого посадочного материала цветочных растений, мы провели работу по организации производства широкого ассортимента иммунодиагностикумов (табл. 12). Это обеспечивает замкнутую систему безвирусного семеноводства (Рыбалко, 1988а; Харута с соавт., 1984, 1986). В 1990-1991 гг. проведены работы по получению диагностических антисывороток к микоплазмоподобным организмам, выделенным из гвоздики, цинерарии гибридной, гортензии, а также столбура томатов. Проведены разработки по получению реагентов для иммуноферментного анализа : имигуноглобулинов и пероксидазных конъюгатов. Эти реагенты были получены к 14 антисыворткам, в т.ч. на ВЖМФ, ВКГ,ВЖМФ(фрезия), Реттл, вирусу антуриума, ВМЦ, ВВХр, ВТМ, ВАТ, ВМЛилии, ЛВГ, ВМНарцисса, ВОМХр, а также 4 антимикоплазменным сывороткам.

Производство коммерческих препаратов

Таблица 12. Производство

1990

гг.

(вмл )

антисывороток диагностических за

1985-

 

1985

1986

1987

1988

Итого за год (мл)

1390

1457

1202

1845

5894

На базе указанного ассортимента полученных нами антисывороток НПО "Биолар" (г. Олайне, Латвия) в 1985-1988 гг. осуществило

производство диагностических наборов для ИФА (Приказ N66/3126 от 25.07.1986 г.).

28

Copyright « « » & «A K -C »

Экономический анализ производства безвирлсных мериклоиов Благодаря \ нификащштехночогического процесса для различных видов

и бочыпих объемов производства как видно из табч 13 установлено что себестоимость одного мериклона сравнитечьно небольшая и находится в

преде чах цены на оздоровленные черенки гвоздики (в ценах

1984 г)

Таблица 13. Стр\ кт\ра затрат по стадиям выращивания мериклонов

I

Виды затрат

1 Оплата тр\да

2 Стоимость

оборудования

3 Прочие затраты

Себестоимость единицы, коп j

Доращивание

Лаооратория

коп

о/

36,9

28 9

34,2

%

39,4

115

49,1

Итого

|

,

17,6

13 8

16,3

коп

11,3

03 3

14,1

коп

28,9

17,1

30,4

,

|

%

37,8

22 4

39,8

 

47,7

28,7

0-76,4

%

 

62 ,4

37,6

100 0

Анализ итрат на производство мериклонов свидетельств\ет том, что основная доля их приходится на чаборатортто фаз\ - примерно 2/3 (62 4%)

а 1/3 (37 70) - на фаз\ акклиматизации и доращивания в теплице На обеих

(разах наибольшая доля итрат приходится на опчат\ тр\да и чабораторного оборудования В тан е снижения !атраг как на лабораторной фазе, так и при проращивании планир\ется разработка автоматизированной технологической тании включающей автоматизацню технологических режимов по подготовке чабораторной посуды приготовлению питатетьных сред применению новых ботее эффективных методов клонального микроразмножения, инертных с\бстратов автомати мции регулирования климатических факторов, передвижения материачов и к\чьт\р в технологических узлах техночогаческой чинии (Рыбалко, 19916)

Обеспечение

разработки

опытно-констрлкторскон линий иммунодиагностику мов Материалы иссчедовании по диссертации были исполь юваны нами для разработки опытно-производственной базы предприятия и модульного биоцентра Разработкл технического задания на мод\чьный быстроразвертываемый промышленный биоцентр в рамках МНПК "Биотехническая индустрия" проводили совместно с проектным ИНСТИТУТОМ ГипроНИИмедбиопром Минмедмикробиопрома СССР При этом нами были

и

типовых

технологических

производства

29

мернклонов

Copyright « « » & «A K -C »

разработаны и выданы технические условия, включающие опытно- промышленный регламент на производство безвирусных мериклонов широкого спектра растений по схеме, предложеннойГипроНИИмедбиопром, для чего была использована "Типовая технология получения исходного безвирусного посадочного материала ремонтантной гвоздики".

ПРАКТИЧЕСКИЕ И МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНАДАЦИИ

1.

По материалам

диссертации

разработаны

и утверждены

в

установленном порядке нормативно-технические документы:

а) "Типовая технология получения исходного безвирусного посадочного материала ремонтантной гвоздики" (утверждена Минжилкомхозом РСФСР 1981 г.), б) ТУ "Сыворотки диагностические к вирусам цветочных культур", в) ТУ "Препараты вирусов растений", г) ТУ 204 РСФСР 2.187-89 - "Миничеренки цветочных растений оздоровленные (технические условия)"

- оздоровленные, посадочный материал (технические условия)" е) ТУ 427-975-86 - "Гвоздика горшечная оздоровленная (технические условия) " ж) ТУ 427-970-86 - "Саженцы цимбидиума оздоровленные (технические условия)" з) ТУ 427-969-86 - "Оригинальные меристемные растения (технические условия)"

культур

д)

204

2.186-89

"Черенки

ТУ

РСФСР

цветочных

и) Технологическая инструкция "Технология производства безвирусного посадочного материала"

производства

ТУ препаратов вирусов цветочных культур",

2. Разработаны и изданы: Методические рекомендации по борьбе с

вирусными болезнями в маточных питомниках ремонтантной гвоздики. - Киев: Минжилкомхоз УССР. 1978. 13 с. (авторы Рыбалко А.Е.,ХарутаЛ.Г, Козар Ф.Е., Сивере Н.А., Копейченко М.И.).

к)

204-2-01-91 - "Технологическая

инструкция

3. НПО "Биолар" переданы антисыворотки, которые использованы в

производстве диагностических наборов для ИФА.

4. Совместно с Минжилкомхозом Российской Федерации в 1985 г.

создано Производственное предприятие меристемных культур (приказ 205 от 15.04.1985 г.) В 1996 г. в преобразовано в федеральное государственное унитарное предприятие Научно-исследовательский центр "Меристемные культуры" Минстроя России (Устав №557, свидетельство о регистрации серия АДГ№ 1336 от 12.07.1997 г.),

5. На протяжении 1983-1990 гг. произведено и реализовано многочисленным предприятиям СССР 7501,98 тыс. элитных черенков гвоздики ремонтантной и 707,79 хризантемы.

30

Copyright « « » & «A K -C »

6 С 1986 по 1990 г произведено для НУЖДсобственного производства и

pea ти 5овано раличным предприятиям 5894 мл высокоактивных нативных антисывороток специфичных к 15 вир\сам и 4 микопчазмам

7 Технология оздоровления и микроразмножения инфокого спектра

к\1ьт\р передана по договорам Невском\ карантинном\ ПИТОМНИКУ Ленинградского объединения "Цветы", Краснодарском\ НИИ картофелеводства и овощеводства, совхозам "Tavrvib", "Жодинскии", "Надымский"

8 Получены авторские свидетельства на 4 изобретения

9 Подано 3 заявки на выдачу патента Российской Федерации На все виды продукции разработаны технологические карты

10

11 В течение 1988-1995 гг материалы диссертации исполь ювались для

чтения лекций по биотехнологии на кафедре физиологии растений Донецкого университета

государственного

12 Разработан проект и технико-экономическое обоснование

строите тьства опытно-производственной базы федерального гос\дарственного v янтарного предприятия Научно-исследовательский центр "Меристемные к\тьтуры"

13 Совместно с ГипроНИИмедбиопром Минмедмикробиопрома СССР

!аданию междуведомственного

индустрия"

по

"Биотехническая

развертываемого биоцентра

научно-производственного

комплекса проект мод\льного

быстро

рафаботан

14 Создан учебный фильм "Болезнь века"

ВЫВОДЫ

1 Электронно-микроскопическими и серочогическими анализами

\становчено полное шражение насаждении вегетативно размножающихся растений в1ф\самн Большинство из них находится в скрытой форме На

картофете в основном распространены X, VI S Y

Зараженность растений ремонтантной гвошики в1ф\сом крапчатости в большинстве сл\чаев сочетается с В1ф\сами кочьцевой пятнистости, чатентным, прижилковой крапчатости Исследованные сорта хризантемы полностью сражены В-вир\ сом часто в смеси с вир\ сами табачной мозаики аспермии томатов огуречной мо *аики Сорта и виды орхидей заражены вир% салт мозаики цимбидиума и кольцевой пятнистости одонтоглоссума

2 Проведенные обследования изч-чаемых к\ тылр (герберы, пчансетпш,

ант%тэи\ма. тилии падиол\са, нарцисса фрезии, розы, различных орнаментальных культур - 48 видов) привели к выяснению комплексного поражения В1ф\сами относящихся к различным таксономическим группам Определены наиболее часто встречаемые комбинации биологические и физикохшнсческие характеристики

- вир\сы их комплексы

3 Разработаны методы получения высокоактивных диагностических

антисывороток к некоторым В1ф\сам поражающим цветочные культуры, на

31

Copyright « « » & «A K -C »

основе нового иммуномодулятора камизола.

4. В производственных условиях разработан прием повышения

чувствительности реакции путем концентрированиявируса насыщением ПЭГ мм 6000 до конечной концентрации 8%. Применены прогрессивные методы

диагностики вирусов: на основе радиальной иммуно-диффузии и иммуноферментного анализа. Разработан перспективный способ приготовления препаратов вирусов для электронной микроскопии, обеспечивающий неспецифическое повышение чувствительности метода (приоритетная справка N4954353/13-051667).

5. В комплексе защиты картофеля, гвоздики ремонтантной, хризантемы

и других вегетативно размножающихся культур от вирусных заболеваний

первостепенную роль играет получение и применение здорового исходного

материала на основе культуры меристемы в сочетании с приемами ускоренного размножения и защиты от реинфекции.

6. На основе изучения локализации вирусов в стеблевых верхушках и

усовершенствования методов ранней диагностики вирусов разработана и экспериментально обоснована унифицированная ресурсосберегающая технология получения безвирусных растений и клонального микроразмножения в культуре in vitro с учетом оптимального сочетания ингредиентов питательных сред для осуществления двухфазного метода регенерации растений, позволяющего сократить сроки получения генетически однородных и одновозрастных растений в промышленных количествах.

7. Выход безвирусных растений ряда сортообразцов картофеля, гвоздики

и хризантемы, полученных их эксплантов размера около 100 мкм без

предварительной термотерапии составил у картофеля 50-83 %,у гвоздики и хризантемы - около 60%.

8. Разработаны приемы повышения оздоровительного эффекта культуры

стеблевых верхушек (300-500 мкм), альтернативные термообработке исходных растительных тканей. При использовании полисахаридов, выделенных из дрожжей получено до 70% здоровых культуру картофеля и гвоздики в результате подсадки к стеблевым верхушкам тканей-продуцентов антивирусных метаболитов (гвоздика турецкая и садовая, лебеда гигантская, зверобой обыкновенный) получено 50-75% здоровых растений картофеля.

9. Разработана и экспериментально обоснована система приемов

массового производства безвирусного исходного материала. Клональное микроразмножение in vitro растений картофеля, гвоздики, хризантемы, орхидей и других культур обеспечивает не только защиту от всех видов реинфекщш, но и позволяет получить коэффициент размножения 1:3000 и более в течение 5 мес. Для получения безвирусных растений и клонального микроразмножения в культуре in vitro растений, пригодных к пересадке в почву, разработана питательная среда со сбалансированным сочетанием макроэлементов (АС 1608845). Использование интенсивного размножения на первых этапах в комплексе с приемами защиты от реинфекции позволяет поддерживать насаждения различных культур в относительно здоровом состоянии.

32

Copyright « « » & «A K -C »

10 Предтожены принципиально новые приемы ускоренного размножения на основе применения рег\ ляторов роста и физических факторов

а) предпосадочное повьппает урожаи картофетя на 23% и коэффициентразмножения - на 29% б) применение им т тьсного освещения при проращивании посадочного

имачнвание клтоней в растворе препарата ТУР

материала способств\ет получению ботее коротких ростков, чем
материала
способств\ет
получению
ботее
коротких ростков, чем при
темновом

И Разработана концепция стандартизации биотехнологий в цветоводстве, которая сформ\ тирована с учетом специфики объектов стандартизации и современных требовании государственной стандартизации к качеетт продукции

12 Прои шодственная проверка разработанной ресурсосберегающей

технологии оздоровления растений позволила рекомендовать включение ее

элементов в технико-экономическое обоснование проекта модлтьного биоцентра в рамках конверсии

СПИСОК

работ опубликованных по материалам диссертации

1 Марченко В А , Рыбатко А Е УССР и мероприятия

по борьбе Выставки передового опыта в народном хозяйстве УССР Киев

Вир\ сные боле ши картофетя в Полесье с нимп//Отдел

информации и прессы

1969

4 с

Рептьтаты применения

кл\бней картофетя//

2 Марченко В А

VI

Всесоюзное совещание от вирусным ботезням растений (Киев, 3-5 мая 1971

г)- М

И распространенных в Почесье Украинской CCP//V1 Всесоюзное совещание по вирусным болезням растений (Киев 3-5 мая 1971 г ) - М ВАСХНИЛ 1971 - С 58

вирлеными бочешями некоторых сортов картофетя

комплекса методов

Рыбалко А Е , Ющенко Н И при отборе бе$вир\сных

1971

-

С

57

, Рыбатко

В

А

А

Е

,

ВАСХНИЛ

Марченко

3

Ющенко

Н

Пораженность

4

Рибалко А С Впливскр\-ч\вання

тастя(Ь-в1р\са)навм1стхтороф1л\

р1зних сорив ьартопт1//Бюлопчн1 особливост1

\пкрооргашзм1в

Материалы I Республиканской конференции молодых ученых микробиологов

и вирусологов

Г оздоровлено1 вщ вф\сно1 шфекцп методом кутьтури ашкально1 меристеми //Бюлопчш особтивосп М1крооргашз\лв Матер1али конференца молодих учених-чпкробюлопв i вф\солопв -Киев Нагеова думка 1972 С 67

Рыбалко А Е Перспективы использования метода

апикальных меристем в семеноводстве овощных кутьтур//Тезисы докладов

Всесоюзном\ семинарл -совещанию по вирусным болезням овощных

Киев Начкова думка, 1972

С

,

Хар\та

Л

С

67

5

Прискорене розмноження картопл!,

Рибалко А

6

Шетудько

Ю

М

KVTWJP M

1974а

51

 

7

HOBI методи одержання безвгрусно1

33

Copyright « « » & «A K -C »

елгги картошпУ/Шсник альськогосподарсько! науки. 19746. №10. С. 53-57.

8. Шелудько Ю.М., Рыбалко А.Е. Пути повышения устойчивости

растительных тканей для получения безвирусных растений/ЛV Всесоюзное совещание по иммунитету сельскохозяйственных растений к болезням и вредителям. М.: ВАСХНИЛ, 1975. С.62.

, .диагностику скручування листя та застосування термотерапп в 6оротьб1 з ним //Картоплярство. Киев: Урожай, 1974а. С. 44-46.

9. Шелудько Ю.М., Рибалко А.

С

Харута Л.Г.

До

питания про

10. Шелудько Ю.М., Рибалко А. €. , Харута Л.Г., Жук 1.П., Горбаренко

M.I. Перспективи одержання безв1русно1 елгга картотп// Картоплярство.

Киев: Урожай, 19746. N5. С. 41-45.

11. Шелудько Ю.М., Рыбалко А.Е., Харута Л.Г. Использование метода меристемы картофеля для создания исходного безвирусного

культуры материала в Украинской ССР//Современные методы получения безвирусного

картофеля, тез. докл. кВсесоюз. семинару-совещанию. М.: ВАСХНИЛ, 1975.

С. 25-26.

, 12. Рыбалко А.Е., Харута Л.Г. Усовершенствование метода культуры

меристем для оздоровления картофеля от вирусов//Современные методы получения безвирусного картофеля. Тез. докл. к Всесоюзн. семинару- совещанию. -М.: ВАСХНИЛ, 1975. - С. 24-25.

13. Козар Ф.Е., Сивере Н.А., Рыбалко A.G. Очистка ХВК, YBK, ВТМ

та сферичного Bipyca гвоздики з застосуванням шмпетиленппколю та гельфшьтрацШ/Мкробтлопчний журнал. - 1976. - Т. 38. Вил. 5. С. 637.

14. Рыбалко А.Е., Харута Л.Г. Использование клубней разного размера

при размножении безвирусного меристемного картофеля//Картофельиовощи.

1976а. N5. С. 19.

15. Рибалко А.С, Харута Л.Г. Застосування метод} 7 культури меристеми

для оздоровления промислових сорт1в ремонтантно* гвоздики. М1кробюлопчний журнал. 19766. Т.38. Вип.6. С. - 645.

16. Рыбалко А.Е., Харута Л.Г., Шелудько Ю.М. Применение ТУРа при

ускоренном размножении безвирусного картофеля, полученного методом культуры меристемы//Отдельное приложение к методическим указаниям по работе с препаратом ТУР в плодоводстве и овощеводстве по материалам 3- го Всесоюзного совещания. М.: МСХ СССР, 1976. С. 22-24.

17. Шелудько Ю.М., Рыбалко А.Е., Харута Л.Г, Жук И.П., Горбаренко

Н.И. Исходный материал для семеноводства картофеля на безвирусной основе/ЛЗирусные болезни растений Дальнего Востока. Владивосток: ДВНЦ АН СССР, 1976, новая серия, Т25(128). С. 146-149.

антив1русного

кондишонування живильних середовищ 1мунними няньками// Мшробюлопчний журнал. 1977а. Т.39. Вип.5. С. -667.

18. Рибалко A.G., Харута Л.Г.

Вивчення ефекту

19. Рибалко A.G., Харута Л.Г. Про удосконалення методцв оздоровления

картошй вад в1рус1в/Л31сник с1льськогосподарсько1 науки. 19776. N8. С. 108-

110.

34

Copyright « « » & «A K -C »

20 Е Рыбалко А Получение исходного безвир\сного посадочного
20 Е
Рыбалко
А
Получение
исходного безвир\сного
посадочного
материала ремонтантной гвоздики и хризантемы в Укра1гаской ССР//Научно-
практическля конференция "Выращивание цветочных культур меристемным
способом"
хоз
21 Шетчдько Ю М , Рыбалко А Е , Харута Л Г
Рига
Мин
ком
Лат ССР, 1977
С
26-27
Ускоренное размножение
меристемного бе$вир\сного картофеля/ЛЗестник сельско-чозяиственной
науки
1977а N7(250)
С
26-40
22
к\1ьтлры
Шетчдько Ю М , Рыбалко А Е , Харута Л Г
меристем
для создания исходного
безвирусного
Использование метода
материала
картофеля в YCCP//Hav4
С
23 Рыбалко А Е Изучение условий массовой регенерации безвирусных
тр
НИИКХ
М
19776
вып
30
51-57
растений в к\льтуре меристемы//Вир\ сные боле irai растений и меры борьбы
сними VI
ВАСХНИЛ, 1978
С
10-11
А
свойства вир\ са выявленного в промышленных насаждениях ремонтантной
гвоздики//Вир\ сные бочезни сельскохозяйственных растений и меры борьбы
24 Сивере
Рыбалко
Е
Н
А
, Харута Л Г
Изучение биологических
с
ними
Тез
докл
Всесоюзн
совещ
(Ленинград, сентябрь, 1978 г)
-
М
ВАСХНИЛ
25
С
Рыбалко А Е , Харута Л Г
1978а
-
131
Применение метода клльтуры меристемы
д
!
я
оздоровления от вир\сов ремонтантной гвоздики// Физиология и
биохимия к\тътурных растений
1978
Т
К)
Вып
5
С
535-540

26 Рыбалко

Харута Л Г,

А Идентификация вир\са крапчатости гвоздики в промышленных посадках Киевского интроду кционнокарантинного питомника декоративных растении //II республиканская научно-теоретическая конференция молодых \ченых- микробиотогов Тез докл Ташкент Фан 1978 С 126-127

А

Е

Н

,

Кощ> Ф Е , Сивере

, Фомин В В

27 Харута А Методические рекомендации по борьбе с вирусными
27 Харута
А
Методические рекомендации по борьбе с вирусными болешямн в
Рыбалко
А
Е
Л
Г,
Козар Ф Е , Сивере
Н
, Копеиченко
VIИ
маточных питомниках ремонтантной гвоздики - Киев Минжилкомхо! УССР
19786 13 с
,
Исполь ювание препаратов из дрожжей для повышения оздоровительного
эффекта клльтуры меристемы при получении безвир\сных гвомик/ЛШ
Киев
28 Ермотаева
НГ ,
Латаш
ЛМ
Рыбалко
АЕ ,
Коваленко
А
Г
конференция молодых ученыч-ботаников Украины Тезисы докладов
На\кова думка 1979 С m
Л
роста при некоренном размножении безвир\сных гвоздик//У11 конференция
Киев Наукова думка. 1979
29 Латаш
М
Ермолаева
Н
Г
Рыбалко
Применение регуляторов
молодых ученых-ботаников Украины Тез докл
С
131
30
Пинч\к ИН
Рыбалко
АЕ ,
Харута
Л
Г,
Патыка
В
Ф
Изучение
действия некоторых синтетических
и природный ингибиторов роста на
меристемный картофель//У1 конференция молодых ученых-ботаников
Украины Те$ докл -Киев Наукова думка
1979
С
155

Copyright « « » & «A K -C »

31. Рыбалко А.Е. Изучение условий массовой регенерации безвирусных

растений в культуре меристемы/ДЗирусные болезни растений и меры борьбы с ними. Владивосток: ДВНЦ АН СССР, 1980. С. 94-99.

32. Рыбалко А.Е. Результаты многолетнего использования метода

культуры меристемы в практическом семеноводстве//Культура клеток

растений и биотехнология. Кишинев: Штишща, 1983. С. 136-137.

33. Рыбалко А.Е. Организация производства безвирусного исходного

материала для промышленного цветоводства в совхозе "Южные культуры" //Промышленное выращивание цветочных культур на юге СССР. Сочи: НИИ горного садоводства, 1984а. С. 32-34.

34. Рыбалко А.Е. Оздоровление растений от вирусных заболеваний (на

примере цветочных растений)//Сельскохозяйственная биология. 19846. N4.

С. 80-81.

35. Рыбалко А.Е. Оздоровление цветочных растений//3ащита растений.

1984B. N4,

С.23.

36. Рыбалко А.Е. Экспериментальное обоснование и принципы

внедрения в производство технологии оздоровления растений от вирусов//

VIII Всесоюзное совещание по вирусным болезням растений. Тезисы докладов. Вильнюс: ВАСХНИЛ, 1984г. С. 96-97.

37. Рыбалко А.Е. Вирусы цветочных культур и меры борьбы с ними.

Обзорная информация. - М.: ЦБНТИ Минжилкомхоза РСФСР, 1984д. - 42 с.

38. Rybalko A. On the improvement of large scale of meristem culture re-

lease from virus and clonal multiplication of plants'/International symposium

"Plant tissue and cell culture -application to crop improvement". Abstracts (Olomouc, Czechoslovakia, 24-29 September, 1984). Olomouc. 1984. (Appen-

dix).

39. Rybalko A. On the improvement of large scale of meristem culture re-

lease from virus and clonal multiplication of plants/flnternational

"Plant tissue and cell culture -application to crop improvement". Procedings.

symposium

24-29 September, 1984). Olomouc. 1984. P. 549-

550.

40. Кишко Я.Г., Рыбалко А.Е., Харута Л.Г., Рубан В.И. Изучение

структуры вирусных популяций, какэлемент общей программы оздоровления цветочных кулыур/Л/Ш растений. Тезисы докладов. - Вильнюс: ВАСХНИЛ, 1984.С. 158-160.

41. Рыбалко А.Е., Кишко Я.Г. Карлавирусы растений: распространение

и меры борьбы//У1 съезд Украинского микробиологического общества. - Донецк: Нукова думка, 1984. С. 195.

(Olomouc, Czechoslovakia,

Всесоюзное совещание по вирусным болезням

42. Харута Л.Г., Рыбалко А.Е., Рындина Н.А. Массовая диагностика

вирусных болезней в меристемных маточниках цветочных культур// Промышленное выращивание цветочных культур на Юге СССР. Науч. тр.

НИИ горного садоводства и цветоводства. Сочи. 1984. С. 34-41.

43. Рыбалко А.Е. Профилактика вирусных болезней цветочных культур //Защита растений. 1985. N2. С. 22-23.

36

Copyright « « » & «A K -C »

44 Рыбалко А Е Система оздоровления интродуцированных цветочных

растении от фитопатогенных виру сов//Биоценотические связи организмов в Тез

насаждениях искусственных фитоценозов

Киштев

45 Воробьев Г В Xapvra Л Г, Рыбалко А Е Унификация технологии

ПОТУЧСНИЯ безвирусного исходного материала для интродуцированных

цветочных фцтоценоадв//Биоценотические связи органи шов в насаждениях искусственныхфитоценодав Те! докл регион совеш Кишинев 25-26июня

докл

региональн

совеш

1986а

С

125-12ь

Шгиинца

1986 г Кишинев Минжитаомхоз МССР, 1986

125-12о

С

46

А хризантем от комплекса вир\ сов методом культуры ткани//Биоценотические Тез регион совещ Кишинев 25-26 июня 1986 г Кишинев Минжилюмхоз МССР

Опыт оздоровления

Рыбалко

Е

Се шванова

ВВ ,

Коев

Г

В

докл

связи организмов в насаждениях искусственных фитоцежпов

1986

107-108

С

47

А цветочных растений от вир\ сов//Тезисы докладов Всесоюзной конференции "Новые направления биотехнологии" (13-15 октября 1986 г, ПУЩИНО) АН СССР Научный центр биологических исследований Пущино 19866 С 198-

Рыбалко

Е

Ресурсосберегающая

биотехнология

оздоровления

199

48 Хар\та Л Г, Рындина Н А Рыбалко А Е Организация прошводства

сывороток для массовой диагностики вир\ сов в оздоровленных цветочных фитоцено »ах//Биоценотические свяш органи шов в насаждениях искусственных фнтоценозов Те i докл регион совещ Кишинев 25-26 июня

1986 г Кишинев Минжилюмхоз МССР, 1986

116-117

С

и ктонапьное мнкроразмно^сние

цветочно-декоративных растений Обзорная информашп, М ЦБНТИ

Миююпкомхоза РСФСР, 1987

производства

иммунодиагностикумов дтя внр\сологического контроля в цветочных фитоценоих//Биотогия кутьтивируемых клеток и биотехнология Тез докл

между нар конфер т2

мериклонов

цветочных к\льтур//Биология культивируемых клеток и биотехнология

докл

К1еточная инженерия - принципиально новый этемент

технологии производства растите чьной проду кции//Актуальные проблемы повышения эффективности АПК Тешсы докладов научной конференщш Краснодарского фтиала ВНИИС Краснодар 1988в С 50-51

49

50

Рыбалко

Оздоровление

А

Е

А

Е

- 47 с

Органи!ация

1988a

С

Рыбалко

массового

308

HoeociroirocK

51

Массовое производство безвир\ сных

т2

HoBOCiroitpCK

19886 С

378

Рыбалко

А

Е

Тез

конф •>2 Рыбалко А Е

между нар

53 Кишко Я Г

,

Л Толмачев А И

Е

Рыбалко

В И , Xapvra Л Г,

Рубан Авторское свидетельство 448449, от I 09

Ковтун

Ю

1988г

цветочных

П

Романов Н Н и (обретение "Способ получения антисыворотки к вирусам

на

растении"

,

•^4

Котомиец

характеристика

Хлр\та

Е новых сортов ремонтантной гвоздики в Kyitrype in vitro//

Т

М

Л

Г

Рыбатко А

Биометрическая

37

Copyright « « » & «A K -C »

Biometricko-geneticke metody ve clechteni rostlin. Sbornik referatu IV. mezinarodniho vedeskeho symposia (Lednice 30.8-1.9 -1988). Brno, Lednice. 1988. P. 411-416.

55. Рудоминская СИ., Матюкова И.С., Рыбалко А.Е. О нормативно-

техническом обеспечении биотехнологий в растениеводстве//Программа "Качество". Проблемы и опыт. Тезисы докладов Всесоюзного совещания. Москва, Госстандарт СССР, 1988. С. 116-117.

56. Рыбалко А.Е., Рудоминская СИ . Стандартизация растительной

продукции, разработанной на основе клеточной биотехнологии//Акгуальные проблемы повышения эффективности АПК. Тезисы докладов научной конференции Краснодарского филиала ВНИИС, Краснодар, 1988. С. 64-65.

57. Харута Л.Г., Рыбалко А.Е. Микроразмножение промышленных

сортов роз//Биология культивируемых клеток и биотехнология. Тез. докл. междунар. конф. т.2. Новосибирск, 1988. С. 306.

58. Рыбалко А.Е., Харута Л.Г., Кишка Я.Г., Рубан В.И., Петухова Н.П.

Авторское свидетельство N1596530 от 1.06.1990 г. "Способ получения сыворотки для диагностики вируса крапчатости гвоздики".

59. Способ получения оздоровленного

Рыбалко А.Е.

посадочного

материала in vitro. Авторское свидетельство СССРN1608845 от 22.07.1990г.

60. Рыбалко А.Е. Способ размножения орхидей в культуре Авторское свидетельство СССР N1693736 от 1990 г.

61. Рыбалко А.Е., Харута Л.Г., Оздоровление и микроразмножение

орхидей//Экспресс информация, 1990, вып. 4(8), С

62. Рыбалко А.Е. Методическое обеспечение получения исходного

материала для селекции на устойчивость гвоздики ремонтантной//Флора нижнего Дона и северного Кавказа: структура, динамика, охрана, проблемы использования. Тез. докл. науч.прак. конф. Ростов-на-Дону: Ростовский университет, 1991а. С. 124.

производства

ткани.

10.

63.

Рыбалко А.Е.

Экономическая характеристика

безвирусных мериклонов цветочных культур//Биология культивируемых клеток и биотехнология растений. М.: Наука, 19916. С. 227-232.

64. Rybalko А.Е. Micropropagation of virus-free ornamentals in the USSR

//Biotechnology in agriculture and forestry, Vol. 20 "High-Tech and Micropropagation IV", Springer-Verlag. Berlin, Heidelberg, New-York, Lon- don, Paris, Tokyo, Hon Kong, Barcelona, Budapest, 1992 P. 427-447.

65. Kharuta L.G., Rybalko A.E. Promising selection of ornamental plants

by in vitro techniques//Breeding, propagation, disease control of glasshouse flow- ers and other ornamental plants. Theses of the international symposium, Salaspils, Latvia, 3-5 -September, 1991. Salaspils, 1992, P. 24.

66. Рыбалко А.Е., Караманян М.И., Харута Л.Г., Дворяшшова И.Н.

Размножение орнаментальных растений//Обзорная информация. Институт

экономики Академии коммунального хозяйства Госкомжилкомхоза России.

1992.

38

Copyright « « » & «A K -C »

67

Рыоалко

А

Е

Хлр\та

Л

Г

Молюга

Т

А

Малиновская

Л

П

Скрыпаль И Г Раковская В И Сакалиева Д Почччение реагентов для

выяв1ения

конференции 2-ь сентября 1992 г Ростов-на-Дон\

А

Разработка систем массовой диагностики вир\сов в

0 иоровленных цветочных фитоценоза\//Материалы научной конференции, посвященной 100-летию со дня открытия вирусов Д И Ивановским 2-6

сентября 1992 г Ростов-на-Дот

микоплаш в к\льт\рных

фитоцено г 5Лх//Материалы на\чнои

посвященной 100-летию открытия В1ф\сов Д И Ивановским

Е

1992

1992

105-107

С

104-105

68

Рыиачко

С 69 Рыбалко А Е Опыт разработки комплекса приемов по оздоровлению

растении от вир\сов и внедрения его в народное хозяйство //В кн Защита растении в \словия\ реформирования агропромышленного комплекса экономика эффективность экологичность Тезисы докчадов к Всиэоссийскомч съезду по защите растений (Санкт-Петербург, декабрь 1995

1

) C

81-S2

70 Рыбалко А Е , Xapvra Л Г

Регенерация растений Ficus canca L из

//В кн "Биология клеток к\тьтивир\емых растений т

vitro

конференции Москва

А микроразмнолению кучьтиваров дендратемы с различным содержанием

стеблевых верхушек

биотехнология и сохранение генофонда " Материалы

25-28 ноября 1997а

71 Рыбачко

Е

Харута

Л

Г,

461

международной

С Исследования по оздоровлению и

эфирных масеч //В кн "Биочогия клеток к\чьтивир\емых растений m v/fro, биотехно югия и сохранение генофонда " Материалы международной

конференции Москва 25-28 ноября 19976 С

504

72 Рыбалко А Е Xapvra Л Г, Разработка метода микроразмножения

Ste\ia геЬалс11апа дчя пол\чения генетически однородного посадочного материала //В кн "Биочогия клеток к\льтивир\емых растений in vitro, биотехночогия и сохранение генофонда " Материалы международной

конференции, Москва 25-28 ноября 1997в г С 459

39

Copyright « « » & «A K