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UNIVERSIDAD NACIONAL DEL ALTIPLANO

FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA


LABORATORIO DE BIOQUIMICA

•Cinética enzimática
•Medición de la Actividad Enzimática (AE)
•Factores que afectan la AE
•Inhibición enzimática
•Regulación enzimática
•Problemas  Pedro Coila
Cinética enzimática
Estudia la velocidad de las
reacciones enzimáticas y los
factores que la afectan.
La Velocidad o Actividad
Enzimática (AE) puede ser
determinado midiendo la
cantidad de S consumido
(o P formado) en una
unidad de tiempo bajo
condiciones adecuadas de
Tº y pH.
En la práctica es muy difícil determinar la cantidad de
enzima, ya que se encuentran en cantidades muy
pequeñas y por que la mayoría se encuentran
formando complejos. También pueden existir enzimas
que no estén catalizando.
Por eso es más fácil determinar la AE ya que es
directamente proporcional a su concentración.
Expresiones de Actividad Enzimática (AE)
La AE o velocidad de las enzimas puede ser expresado de
las siguientes formas:
Nomenclatura común  Unidades Internacionales de AE
(UI o U).- Son los micromoles de S
transformado (o P formado) en un
minuto (μmol/min).
Nomenclatura SI  Katal (kat).- Son los moles de S
transforma-do (o P formado) en un
segundo (mol/s). Se pueden usar
prefijos SI.
Problema: Cierta enzima cataliza a una velocidad inicial (vo) de
5,7 x 10-5 UI, exprese esta velocidad en katales y
microkatales.
Actividad molecular
ACTIVIDAD MOLECULAR = NUMERO DE RECAMBIO = CONSTANTE CATALITICA (Kcat)

Es el número de moléculas de S transformado por una sola molécula


de enzima en un tiempo dado (min o s).

Enzimas Sustrato kcat (s-1)


Catalasa H2O2 40,000,000
Anihidrasa carbónica HCO3- 400,000
Acetilcolinesterasa Acetilcolina 140,000
b-Lactamasa Benzilpenicilina 2,000
Fumarasa Fumarato 800
Proteína RecA (ATPasa) ATP 0.4
Factores que afectan la AE
Numerosos factores influyen en la velocidad de las
enzimas, entre ellas:
1. Temperatura
2. pH
3. Concentración de enzima
4. Tiempo de incubación
5. Inhibidores
6. Electrolitos y fuerza iónica
7. Sustancias químicas
8. Concentración de sustrato
Velocidad de reacción
1. Efecto de la temperatura

Vmáx

de la enzima
Desnaturalización
Tº óptima

0 10 20 30 40 50 60 70
Temperatura (ºC)
A medida que aumenta la Tº
la AE también sube, pero
solo hasta cierto grado, más
allá de ese límite, la enzima
se desnaturaliza.

Cada enzima tiene su propia Tº óptima, al cual tiene máxima AE.


Para la mayoría de enzimas de mamíferos la Tº óptima está entre
35 y 40ºC.
Velocidad de reacción
2. Efecto del pH

Vmáx

pH óptimo

4 5 6 7 8 9 10 11

pH
Cada enzima tiene
un pH óptimo, al
cual tiene máxima
actividad. Por
debajo y encima de
este pH la actividad
declina.

Los pH extremos generalmente inactivan a las enzimas.


Algunas enzimas tienen un pH óptimo amplio. P. ej. Sacarasa: 3 -
7,5 de pH

¿Cómo afecta el pH?


Modifica la ionización de ciertos grupos del sitio activo, del S o de
ambos.
3. Efecto de la [E]

Bajo condiciones
Velocidad de reacción

saturantes de S,
150

la velocidad de
reacción, es
directamente
100

proporcional a la
[E].
50

0 10 20 30 40

Concentración de enzima (mM)


Luego, la recta declina
debido a:
- Depleción del S
- Inhibición por el P

Problema: Si una enzima cataliza a una vo = 2,7 x 10-3 UI


¿Cuál será su velocidad si la [E] se triplica?
Velocidad de reacción
4. Efecto del tiempo de incubación

0 10 20 30 40

Tiempo (min)
En los momentos iniciales, la
AE es directamente
proporcional al tiempo de
incubación, pero solo hasta
cierto límite.

VO α tiempo

Luego, la AE declina debido a:


- Agotamiento del S
- Desnaturalización de la E
- Inhibición por el propio P
5. Inhibidores enzimáticos
Los inhibidores son sustancias orgánicas o inorgánicas que unidos
a la enzima disminuyen su AE.

6. Electrolitos y fuerza iónica


Los iones (p.e. cationes) muchas veces son requeridos en el sitio
activo de la E.
La fuerza iónica de la solución en donde está la E influye en la AE
(salting in y sallting out)
7. Sustancias químicas
La presencia de diversos químicos afectan la AE, sobre todo:
-Agentes quelantes y
-Agentes reductantes
8. Efecto de la [S]
En 1912, en la Universidad de
Berlín, los investigadores que
realizaron el primer estudio
(cinético y matemático) del
efecto de la [S] sobre la
velocidad de las reacciones
enzimáticas, fueron:
Leonor Michaelis y Maud
Menten

Ellos observaron que cuando se mantenía constante la


[E], y se aumentaba progresivamente la [S] se obtenía
una gráfica hiperbólica.
EXPERIMENTO DE MICHAELIS-MENTEN

0 1 2 3 4 5 6 7 8
S
+
80 E

60
P
AE (UI)

40

20

0
0 2 4 6 8
Sustrato (μmol)
Inicialmente, la v aumenta proporcionalmente a la [S]
(cinética de primer orden), luego va disminuyendo
(cinètica de orden intermedio) hasta que la velocidad
se hace constante, así haya fuerte [S] (cinética de
orden cero).
Gráfica y ecuación matemática de la
hipérbola rectangular
Gráfica y ecuación enzimática de la
hipérbola rectangular Constante de
Michaelis-Menten

Curva de Michaelis-Menten

Ecuación de
Michaelis-Menten
Velocidad máxima (Vmáx)
Es la máxima velocidad de una reacción enzimática.
En este momento, todas las enzimas están
“trabajando” (no hay enzima disponible).
Constante de Michaelis-Menten (Km)
Funcionalmente, es la [S] al cual se alcanza el 50% de la Vmáx.
Es una medida de la afinidad de la enzima por un determinado S.
Todas las reacciones enzimáticas tienen su Km característico.

Cuanto > es la afinidad < es el valor de Km (y viceversa)

Si el Km es alto: menor velocidad


Si el Km es bajo: mayor velocidad
Sustrato Km (M)
Problema: ¿Cuál es el S preferido Galactosa 1 x 10-1
para la hexokinasa, cuyos
sustratos y Km se Fructosa 1,6 x 10-3
muestran en la siguiente Glucosa 8 x 10-6
tabla?
Manosa 5 x 10-6
NOTA: Los valores Km de muchas enzimas son próximos
a los de la concentración fisiológica de sus sustratos, de
forma que pequeñas variaciones en la [S] pueden suponer
grandes cambios en la velocidad de toda una ruta metabólica.
En todo estudio enzimático, los dos parámetros cinéticos
que deben ser determinados son: Vmáx y el Km.

Pero en la práctica, estos


dos parámetros no
pueden ser
determinados, en forma
exacta, utilizando la
gráfica de Michaelis-
Menten, debido a:

La curva hiperbólica realmente nunca llega a contactar con


la asíntota de la curva (que es el valor de la Vmáx).
Y, si no se conoce el verdadero valor de la Vmáx, tampoco
se podrá determinar el verdadero valor de Km.
Entonces, ¿Cómo poder determinar exactamente estos dos
parámetros enzimáticos (Km y Vmax)?

Frente al problema, muchos investigadores plantearon métodos


matemáticos (conocidos como ploteos) para resolver este
problema, entre ellos:
 El Ploteo de Lineweaver-Burk
 El ploteo de Eddie-Hofstee
 El ploteo de Hanes-Woolf
 El ploteo de Eisenthal y Cornish
 Programas computarizados

Métodos disponibles en:

http://www.sbu.ac.uk/biology/enztech/determination.html
Ploteo de Lineweaver-Burk (1934)
También conocido como el ploteo del doble recíproco.
El método consiste en aplicar el recíproco (inverso) a la ecuación
de Michaelis-Menten (1/vo versus 1/[S]), obteniéndose una recta.
Ploteo del doble recíproco
Doble recíproco Ploteo directo

Vmax
1
vo vo
1/2
-1
Km 1
Vmax
1/S Km S
Ejemplo de cinética enzimática y ploteo de Lineweaver-Burk

Sustrato Producto Velocidad Doble recíproco


No [S] Absorbance v (mmole/min) 1/S 1/v
1 0.25 0.21 → 0.42 4 2.08
Datos

2 0.50 0.36 → 0.72 2 1.56


3 1.0 0.40 → 0.80 1 1.35
4 2.0 0.46 → 0.92 0.5 1.16
(1) El producto fue medido por espectrofotometría a 600 nm para 0.05 por mol
(2) El tiempo de reacción fue de 10 min

1.0 2.0
Doble recíproco
Ploteo Directo

v 1/v 1.0
0.5 1.0
-3.8

0 0
0 1 2 -4 -2 0 2 4
[S]
Inhibición enzimática
Los inhibidores son sustancias (orgánicas o inorgánicas)
que al ser añadidos al medio donde está actuando una E
determinan su menor AE.
Modo de acción de los inhibidores
Los inhibidores se unen a la enzima lo que ocasiona la
pérdida parcial o total de la AE formando los complejos
EI o ESI
Aplicaciones
El estudio de los inhibidores es importante por que proporciona
información sobre:
 El mecanismo de catálisis enzimática
 La especificidad de la enzima
 La naturaleza de los grupos funcionales del sitio activo
Aplicaciones del estudio de inhibidores:

Muchos compuestos actúan inhibiendo ciertas


reacciones enzimáticas; y, por lo tanto, de toda una vía
metabólica. Entonces, tiene aplicación en:
 Medicina.- Antiinflamatorios, analgésicos,
antibióticos, interferones, anticancerígenos, etc
 Agricultura.- Herbicidas, insecticidas, plaguicidas, etc.
 Guerras biológicas.- Gases nerviosos, venenos, etc.
 Industria alimentaria
Biotecnología, ect.
Tipos de Inhibición

1. Inhibición Irreversible.- Al retirar del medio el


inhibidor, la enzima no recupera su AE. Entonces, el
inhibidor ha destruido algún grupo funcional necesario
para la actividad catalítica de la E. A menudo la unión
la EI es covalente. Ejemplos:
- Los organofosforados inhiben a la acetilcolinesterasa.
- Agentes alquilantes como el yodoacetato (se unen a –
SH)
- La penicilina inhibe enzimas que sintetizan la pared
bacteriana
- Los metales pesados (Pb, As, Hg) .
Tipos de Inhibición
2. Inhibición Reversible.- Si el inhibidor es retirado del
medio (por diálisis u otros medios) en donde está
actuando, la enzima recupera su AE. Entonces, se dice
que la E se ha reactivado. La unión EI es laxa. Existen 3
subtipos:
-Competitiva
-No Competitiva
-Acompetitiva
Inhibición reversible (Mecanismo)

I Competitiva I No competitiva I Acompetitiva


Sustrato E
S S S
Esquemas

I
E E I
S I
I
Compiten por S I
Inhibidor el sitio activo Diferente sitio

E + S→
←ES → E + P E + S→ ←ES → E + P E + S→
←ES → E + P
Ecuacíones y Descripciones

+ + + +
I I I I
↓↑ ↓↑ ↓ ↑ ↓↑
EI EI + S →EIS EIS

[I] sólo se une a [E] libre, [I] se une a [E] libre o al [I] sólo se une al complejo
y compite con el [S]; complejo [ES] ; aumentando [ES], aumentando la [S] se
incrementando la [S] se
la [S] no se revierte la inhib. favorece la inhibición.
revierte la Inhibición.
Inhibición enzimática (Ploteos)

I Competitiva I No competitiva I Acompetitiva


Vmax Vmax Vmax
vo vo
Ploteo directo

Vmax’ Vmax’
I I I

Km Km’ [S], mM Km = Km’ [S], mM Km’ Km [S], mM


Vmax no cambia Vmax disminuye
Ploteo de Lineweaver-Burk

Km aumenta Km no cambia Vmax y Km disminuyen

1/vo I 1/vo I 1/vo


I

Intersect Dos líneas


en el eje Y paralelas
1/ Vmax Intersect 1/ Vmax 1/ Vmax
en el eje X

1/Km 1/[S] 1/Km 1/[S] 1/Km 1/[S]


Ejemplo de un inhibidor competitivo
Domagk (1939)

Acido para-aminobenzoico (PABA)

La bacteria requiere PABA para


H2N- -COOH la biosíntesis de ácido fólico

Acido Acido
Precursor fólico tetrahidrofólico

Las sulfas tienen similar


H2N- -SONH2 estructura con el PABA e
Inhiben el crecimiento de
la bacteria..
Sulfanilamida
Ejemplo de algunos inhibidores
aplicados en medicina
Droga Uso terapéutico Enzima afectada Tipo de inhibidor
Lovastatina Hipercolesterolemia HMGCoA reductasa Competitiva
5-fluouracil Cáncer Timidilato sintetasa Irreversible
Metrotexate Cáncer Dihidrofolato reductasa Competitiva
Alopurinol Gota Xantino oxidasa Irreversible
Cumadin Anticoagulante Glutamil carboxilasa Competitiva
Aspirina Antiinflamatorio Ciclooxigenasa Irreversible
Captopril Hipertensión art. Enz.convert.angiotensina Competitiva
Regulación enzimática
El funcionamiento celular u orgánico requiere que todas las
reacciones estén controlados, de modo que las vías
metabólicas estén activas en ciertos momentos e inactivas
en otros.

Todas las enzimas pueden ser reguladas por factores


como Tº, pH, [S], [E], cofactores, etc. Pero estos
factores en el organismo animal son casi constantes,
por lo que poco influyen en la regulación.

Existen otros mecanismos intracelulares que permiten la


regulación de la velocidad de las reacciones enzimáticas
La regulación enzimática se refiere a la posibilidad que
tienen las enzimas de variar la velocidad de las
reacciones que catalizan al producirse determinados
cambios en el medio.

Existen dos tipos de enzimas especializadas


denominadas enzimas regulatorias (o moduladoras) que
intervienen en la regulación del metabolismo y están
ubicadas estratégicamente en las vías metabólicas:
1. Las enzimas alostéricas  Regulación Alostérica
2. Las enzimas reguladas por unión covalente 
Regulación Covalente
Ubicación de las enzimas regulatorias

Generalmente, catalizan las


primeras reacciones,
permitiendo una regulación de
una vía desde el inicio (principio
de máxima economía)
1. Regulación alostérica
Las enzimas alostéricas presentan
2 sitios de unión funcionalmente
distintos y separados:
-Sitio activo.- Con actividad
catalítica, sierve la unión con el S.
-Sitio alostérico o regulador.- Sin
actividad catalítica, sirve para la
unión con una molécula efectora
(= efector, modulador o
regulador) por enlaces no
covalentes.
Tipos de efectores
1. Efectores negativos o inhibidores.- Disminuyen
la AE
2. Efectores positivos o activadores.- Aumentan la
AE

Si la enzima posee:
-Un solo efector (+ ó -) = monovalente
-Dos o más efectores (+ ó -) cada uno con su
sitio = polivalente
Características de las enzimas
alostéricas

1. Generalmente, son poliméricas 


Alto PM

2. No cumplen la clásica cinética


micheliana.
3. Presentan 2 estados interconformacionales
interconvertibles. Ambos están en equilibrio.
- R (relajado).- Es activo. Tiene alta afinidad por el S
- T (tenso).- Es inactivo. Baja afinidad por el S
4. Pueden ser homeotrópicas (si su propio S actúa
como efector) o heterotrópicas (si el efector es una
molécula distinta al S)

6. Son bastante inestables o lábiles


Mecanismo y ejemplo de regulación alostérica

Cinética Modelos Cooperación

R = Relajado Sitio alostérico


(activo) R Homotrópico
vo (+) S (+)
S

S
R Concertado
Sitio alostérico
[S]
R
(+) A
vo
T Heterotrópico
(+)
S S (+)
R Secuencial
X [S]
T
T = Tenso I
(inactivo) vo
T Heterotrópico
(-) X
(-) X (-)
T Concertado
[S]
2. Regulación covalente
Son enzimas que presentan 2 formas interconvertibles, con
diferente composición, lo que origina cambios
conformacionales en la molécula (estructura 3ria o 4ria).

En la mayoría de los casos, las 2 formas de la enzima


sólo se diferencia en la presencia de un grupo fosfato el
cual se une covalentemente a la proteína. Entonces, las
formas serían:
1. Forma fosfatada o
forma a
2. Forma no
fosfatada o forma
b
Las kinasas: Son enzimas
que agregan el grupo
fosfato proveniente del
ATP.
Las fosfatasas: Son las
enzimas que retiran el
grupo fosfato.
Las 2 formas difieren en su grado
de actividad, siendo una muy
activa y la otra poco activa.
Algunas veces la forma a es la
activa y en otros casos la forma
b.
Regulación covalente (por fosforilación)
Fischer, Kreb (1978)

OH P
Kinasa
(fosforilación)

Conformational
Protein Change
Fosfatasa
(defosforilación)

Glycogen phosphorylase b Glycogen phosphorylase a

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