KROMATOGRAFI

Tujuan :
Memisahkan molekul Hb dari molekul vitamin B12 dengan menggunakan butiran
mikroskopis dekstran sebagai penyaring
Uraian :
Dalam percobaan ini digunakan butiran mikroskopis dekstran (suatu bentuk
polimer glukosa) dengan diameter dan ukuran pori-pori tertentu sebagai fasa
stationer. Vitamin B12 (berwarna merah muda) mempunyai ukuran molekul yang
lebih kecil dari pori-pori (BM 1350 dalton), sehingga akan terperangkap masuk
dalam pori-pori butiran, keluar lagi, terperangkap dalam butiran lain, demikian
seterusnya sehingga akan lebih lambat keluar dari kolom. Sebaliknya molekul
hemoglobin (berwarna coklat) dengan BM 65000 dalton tidak dapat masuk ke poripori dan akan lewat disela-sela butiran sehingga akan keluar lebih dahulu dari kolom
pemisah.

Bahan :

Larutan yang mengandung hemoglobin dan vitamin B12

Kolom berisi gel penyaring molekul (Sephadex-G100)
Dapar NaCl 0,9% sebagai pelarut zat yang akan dipisahkan dan sebagai eluen
Kertas grafik

Cara Kerja :

Siapkan 19 tabung penampung, tandai tabung 1-17 secara berurutan dengan

angka. Tabung 18 ditandai dengan sisa dan tabung 19 dengan dapar. Pipetkan
4ml dapar ke dalam tabung bertanda dapar.

Buka penutup atas dan penutup ujung bawah kolom pemisah. Tampung dapar
dalam tabung bertanda sisa, sampai seluruh dapar keluar. Tutup kembali ujung

bawah kolom pemisah.

Dengan hati-hati tempatkan kolom tersebut pada tabung 1.
Dengan pipet, teteskan 2 tetes campuran Hb dan vitamin B12 tepat di atas

permukaan gel dengan sangat hati-hati supaya tidak mengganggu gel.

Bukalah penutup ujung bawah kolom dan biarkan 1-2 tetes larutan dapar

keluar, hingga campuran Hb dan vitamin B12 masuk ke dalam gel.

Dengan hati-hati tambahkan dapar setetes demi setetes, dengan cara
mengalirkannya perlahan-lahan melalui dinding kolom dekat permukaan gel.

Mulailah menampung dalam tabung 1 sebanyak 3 tetes.

Pindahkan kolom ke tabung 2 dan lanjutkan menampung fraksi 3 tetes dalam
tiap tabung penampung. Penampung gel tidak boleh kering, jadi sambil

menampung fraksi, dapar ditambahkan dengan cara hati-hati.

Setelah pemisahan selesai (gel sudah jernih), tutup kembali ujung bawah

kolom pemisah.
Catat warna dan intensitas tiap tabung (tabung 1-17)
Ukur serapan fraksi-fraksi pada panjang gelombang 540 nm yaitu dengan cara
menambahkan aquades 2,5 ml tiap fraksi. Gambarkan kurva serapan fraksi
dengan nomor tabung sebagai sumbu X dan nilai serapan sebagai sumbu Y.

Hasil pengamatan :
Tabung
Warna
Intensitas

1
Bening
-

3
Pekat

++++

4
Agak pekat

5
Lebih

6
Lebih

+++

Cerah
++

Cerah
+

(+++)

Tabung
Warna
Intensitas
(+++)

7
Orange

8
Makin

9
Makin

10
Makin bening

11
Makin bening

++

bening
++

bening
++

++

++

Tabung
Warna
Intensitas

12
Makin bening
++

13
Samar
+

14
Samar
+

15
Samar
+

(+++)

Tabung
Warna
Intensitas (+++)

17
Samar
+

Tabung
Warna
Intensitas (+++)
Tabung
Warna
Intensitas (+++)

18
Samar
+
20
Bening
-

19
Samar
+
21
Bening
-

Tabung
Warna
Intensitas (+++)

22
Bening
+

GRAFIK :

16
Samar

Intensitas
Intensitas

KESIMPULAN : Setelah melakukan percobaan tersebut, dapat disimpulkan bahwa

larutan hemoglobin dari vitamin B12 dapat dipisahkan dengan menggunakan tehnik
penyaring molekuler (Molecular Sieve Chromatography).

Lampiran