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INSTITUTO POLITCNICO NACIONAL

ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLGICAS

Laboratorio de Bioqumica
Prctica: DETERMINACION DE AMINOACIDOS TERMINALES CON GRUPO ALFA AMINO LIBRE.
METODO DE SANGER.
Seccin: 1
Grupo: 3FV1
Alumnos: Aguirre Landeros Blanca Alicia, Pineda Blanco Alan David , Guerrero Flores Francisco Andrs.

INTRODUCCIN.
Las protenas son macromolculas formadas por cadenas
lineales
de
aminocidos.
Las protenas desempean un papel fundamental en los
seres vivos y son las biomolcula ms verstiles y ms
diversas. Realizan una enorme cantidad de funciones
diferentes, entre las que destacan la enzimtica, hormonal,
transportadora (hemoglobina), defensiva (anticuerpos),
estructural (colgeno), etc.
Un polipptido, en otras palabras, es una secuencia de
aminocidos que estn vinculados a travs de enlaces
peptdicos.
Frederick Sanger, fue uno de los cientficos ms reconocidos
de su poca; este mtodo le dio gran reconocimiento
mundial, recibiendo el premio nobel de qumica en 1958.
Con el mtodo de Sanger se determina el grupo -amino
libre de las cadenas polipeptdicas, este reacciona, con el 1fluoro-2,4-dinitrobenceno [DNFB] en un medio ligeramente
alcalino, formando los DNP derivados. Una hidrlisis
posterior con HCl 6N aplicando temperatura y presin
provee los aminocidos libres y dinitrofenil derivados, estos
derivados pueden extraerse del hidrolizado con ter e
identificarse con una cromatografa en papel.

OBJETIVO.

Utilizar el mtodo de Sanger para identificar los


aminocidos que contienen el grupo alfa-amino
terminal de las cadenas de la molcula de
hemoglobina.

RESULTADOS.
Rf = distancia recorrida por el soluto / distancia recorrida
por el solvente
Muestras

Rf

DNP- Glu

Distancia
recorrida por el
soluto.
20.8

DNP- Ala

16.5

16.5 / 27.5 = 0.6

DNP-Val

18.7

18.7 / 27.5 = 0.68

DNFB

11.8

11.8 / 27.5 = 0.42

Problema

10.6

10.6 / 27.5 = 0.38

Problema

18.3

18.3 / 27.5 = 0.66

20.8 / 27.5 = 0.75

Distancia recorrida por el solvente = 27.5

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ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLGICAS

Laboratorio de Bioqumica
Prctica: DETERMINACION DE AMINOACIDOS TERMINALES CON GRUPO ALFA AMINO LIBRE.
METODO DE SANGER.
Seccin: 1
Grupo: 3FV1
Alumnos: Aguirre Landeros Blanca Alicia, Pineda Blanco Alan David , Guerrero Flores Francisco Andrs.

ANALISIS DE RESULTADOS
Cuando se le adiciona bicarbonato de sodio al 4% a la
hemoglobina, realizamos un medio alcalino el cual favorece
la reaccin, posteriormente al agregar el reactivo de
Sanger 1-fluoro-2,4-dinitrobenceno (DNFB) agitamos el tubo
para favorecer la reaccin y as obtener DNP derivados de
la hemoglobina.
Se acidifico el medio con HCl 3N para detener la reaccin
del (DNFB) con la hemoglobina en medio alcalino que
realizamos anteriormente, se extrajo con ter para separar
en dos fases, la orgnica que es nuestra sustancia problema
que contiene aminocidos dinitrofelinados, y la etrea la
cual hace que se eliminen los residuos del (DNFB) que no
reaccionaron en la etapa anterior de nuestra reaccin,
posteriormente se agreg HCl 6N para realizar una hidrolisis
acida, que al aplicar temperatura y presin en el autoclave
esta provee que los aminocidos libres y dinitrofenil
derivados puedan extraerse del hidrolizado.
Para identificar y separar el grupo amino terminal de la
hemoglobina, se utilizo el extracto obtenido en la hidrolisis y
con ter se extrajo nuestra sustancia problema calentamos
los extractos etreos en una parrilla con el fin de evaporar el
ter que hay en nuestra sustancia para que nuestro
problema estuviera concentrado y sin residuo alguno de las
sustancias anteriores que utilizamos, disolvimos en alcohol
absoluto para la aplicacin en cromatografa nuestro DNPproblema, que es el grupo amino terminal de la
hemoglobina.

Para la aplicacin de nuestro problema en la cromatografa,


se realiz con papel Whatman; aplicamos las muestras de
DNP-Glu, DNP-Ala , DNP-VAL, DNFB y nuestra sustancia
problema para identificar y hacer una comparacin de cul
de estas sustancias que colocamos es nuestro aminocido
con grupo -amino terminal.
En donde se colocaron estos estndares [DNP-derivados]. Al
revelar el cromatograma se encontraron dos manchas en la
corrida del problema, uno correspondiente al DNP-Valina y el
otro corresponde al DNFB sin reaccionar. Hubo unas ligeras
diferencias entre la corrida del problema y de los DNPderivados. Estas diferencias se pueden deber a la
temperatura ambiente la cual hace que acelere o sea ms
lento cuando el cromatograma corre en el disolvente.
Adems el problema presento DNFB, lo cual se debe a los
restos de DNFB que se quedaron en la muestra debido a que
no se extrajo en su totalidad antes de la hidrlisis que se
hizo con el fin de eliminar todo este exceso.

CONCLUSIONES.

Se determin con el mtodo de Sanger y la


cromatografa el alfa-amino terminal de la
hemoglobina que es valina con un Rf = 0.66

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Prctica: DETERMINACION DE AMINOACIDOS TERMINALES CON GRUPO ALFA AMINO LIBRE.
METODO DE SANGER.
Seccin: 1
Grupo: 3FV1
Alumnos: Aguirre Landeros Blanca Alicia, Pineda Blanco Alan David , Guerrero Flores Francisco Andrs.

BIBLIOGRAFA
Donald Voet, Judith G. Voet. 2006 Fundamentos de
bioqumica 2da edicion Editorial Panamericana Pags.
109-110.

Lehninger, A,L. Principios de Bioquimica. Editorial


Omega,Espaa

Enrique Battaner Arias, 2012 Biomoleculas 1ra.


Edicin. Ediciones Universidad de Salamanca.Espaa.
Pags. 290- 292.