Kromatografi

Definisi
Kromatografi adalah suatu istilah umum yang digunakan untuk bermacam-macam teknik
pemisahan yang didasarkan atas partisi sampel diantara suatu fasa gerak yang bisa berupa gas
ataupun cair dan fasa diam yang juga bisa berupa cairan ataupun suatu padatan. Kromatografi
memisahkan komponen-komponen dari suatu campuran berdasarkan perbedaan sifat fisik dan
kimia

komponen

Konsep

Polaritas

dalam

campuran.

dalam

Kromatografi

Di dalam kromatografi, berlaku suatu prinsip umum : LIKE DISSOLVE LIKE, artinya polar
menyukai yang polar dan tak polar menyukai yang tak polar. Dalam hal fasa diam, fasa diam
yang polar akan mengikat lebih kuat komponen yang relatif polar, sedangkan fasa diam yang
tak polar akan mengikat lebih kuat komponen-komponen yang juga tak polar. Hal yang sama
berlaku bagi fasa gerak; fasa gerak yang polar akan melarutkan lebih baik komponen yang
juga polar, sebaliknya fasa gerak yang tak polar akan melarutkan relatif lebih baik komponen
yang

juga

tak

polar.

Hubungan polaritas antara fasa diam, fasa gerak dan molekul inilah yang memegang peranan
penting
Pengertian

pada
Polar

kromatografi.
dan

Tak

Polar

Molekul terbentuk dari beberapa atom. Atom terdiri atas suatu inti bermuatan positif yang
sangat kecil dan rapat, yang terletak jauh di dalam atom, dan dikelilingi oleh semacam awan
elektron. Elektron sendiri bermuatan negatif. Atom dapat bergabung dengan atom lain,
membentuk suatu molekul melalui suatu ikatan yang disebut ikatan kimia. Pada
penggabungan atom, tidak terjadi perubahan pada susunan inti atom. Perubahan terjadi hanya
pada susunan awan elektron. Sebaliknya molekul yang terbentuk dari jenis atom yang
berbeda umumnya bersifat polar. Oleh karena itu dengan mudah dapat dipahami bahwa
hidrogen (H2) dan klorida (Cl2) bersifat tak polar, sedangkan hidrogenklorida (HCl) bersifat
polar.

Dengan demikian antara dua unsur sejenis hanya mungkin terbentuk ikatan kovalen, karena
daya tarik elektron dari kedua unsur pembentuk ikatan adalah sama sehinggga elektron ikatan
tersebar rata diantara kedua atom. Keadaan sebaliknya terjadi bila daya tarik antara kedua
unsur tak seimbang. Dalam hal ini elektron dapat berpindah dari unsur yang satu ke unsur
yang lain, sehingga ikatan yang terjadi adalah ikatan ion. Keadaan yang umumnya ditemukan
terletak

diantara

kedua

kemungkinan

yang

ekstrim

tersebut.

Pembentukan ikatan umumnya terjadi antara dua unsur yang tak sama tetapi perbedaan daya
tarik terhadap elektron dari kedua untur tersebut tidak terlalu besar. Dalam keadaan ini ikatan
yang terjadi masih ikatan kovalen tetapi titik berat muatan negatif agak bergeser kearah atom
yang mempunyai daya tarik terhadap elektron relatif besar. Dalam hal ini atom menjadi
bersifat relatif lebih negatif (titik berat muatan negatif bergeser kearah atom tersebut) dan
sebagai akibatnya, sepanjang ikatan terdapat dua kutub muatan yang berlawanan tanda dan
terpisah satu sama lain dengan jarak tertentu. Ikatan semacam ini disebut ikatan polar.
Berbeda dengan ikatan polar, pada ikatan kovalen murni, titik berat muatan positif dan
negatif

saling

impit.

Dengan demikian suatu molekul dikatakan tak polar apabila titik berat muatan (+) dan (-)
berada bersama-sama pada pusat molekut tersebut. Sebaliknya suatu molekul dikatakan polar,
jika molekul tersebut merupakan dwi kutub (dipole), dimana titik berat muatan positif (+) dan
negatif (-) tidak saling berimpit. Molekul polar terbentuk apabila elektronegativitas dari
atom-atom

yang

menyusun

molekul

cukup

berbeda

satu

sama

lain.

Elektronegativitas
Seperti telah diketahui, kepolaran suatu ikatan antara dua atom ditentukan oleh perbedaan
daya tarik elektron dari kedua atom tersebut. Bila daya tariknya sama, maka akan terbentuk
ikatan kovalen, sedangkan bila berbeda, akan terbuntuk ikatan polar dimana kepolarannya
akan sebanding dengan perbedaan tersebut. Untuk dapat menyatakan apakah suatu ikatan
bersifat kovalen atau polar diperlukan pengetahuan tentang daya tarik elektron dari suatu
atom. Suatu besaran yang dapat digunakan untuk mengukur daya tarik elektron adalah
afinitas elektron. Kesulitan dari penggunaan afinitas elektron adalah bahwa besaran ini
menggambarkan daya tarik elektron dari atom yang bebas, sedangkan yang diperlukan adalah
daya tariknya dalam suatu ikatan. Karena itu dikembangkan konsep elektronegativitas dari

suatu unsur, yang secara langsung menggambarkan daya tarik elektron dalam ikatan.
Elektronegativitas menunjukkan besarnya kecenderungan (tendensi) suatu ataom untuk
menarik elektron (yang digunakan bersama), dari atom tetangganya. Terdapat berbagai cara
untuk mengembangkan konsep elektronegativitas, salah satu diantaranya adalah skala
elektronegativitas
Mengenal

yang
Polaritas

dikembangkan
Fasa

oleh

Diam

dalam

Pauling.
Kromatografi

Fasa diam pada kromatografi (gas) ada yang bersifat polar, semipolar dan tak polar yang
dapat dikenali berdasarkan prinsip dasar diatas. Berdasarkan gugus fungsionil yang dimiliki
oleh setiap jenis fasa diam tersebut, dapat disusun urutan polaritas dari beberapa jenis fasa
diam yang umum digunakan pada kromatografi (gas). Disamping keenam jenis fasa diam
tersebut,

masih

terdapat

banyak

lagi

jenis

fasa

diam

lainnya.

Fasa diam (adsorben) yang paling banyak digunakan pada TLC dan HPLC adalah silika dan
alumina. Adsorben silika dan alumina dapat mengadsorpsi senyawa yang bersifat polar. Silika
gel bersifat asam dan berfungsi untuk memisahkan senyawa yang bersifat asam. Silika gel
banyak digunakan untuk kromatografi lapis tipis (KLT). Sedangkan alumina bersifat basa dan
berfungsi untuk memisahkan senyawa yang bersifat basa. Alumina banyak digunakan dalam
kromatografi

kolom.

Berbagai pemisahan pada selulosa dan poliamida juga telah banyak dipublikasikan, hanya
saja pemakaiannya tidak seluas silika dan alumina. Karena tidak semua pemisahan dapat
dilakukan pada silika maka dikembangkan fasa terikat (bonded phase) seperti RP 2, RP 8,
RP 18, diol, amina dan siano. Susunan fasa diam yang umum digunakan pada TLC dan
HPLC,

dimulai

dari

yang

paling

polar

(C18)

diberikan

di

bawah

ini

Bagaimana halnya dengan urutan polaritas fasa gerak?. Fasa gerak yang umum digunakan
pada TLC dan HPLC terdiri dari campuran berbagai pelarut organik. Polaritas pelarut dapat
disusun menurut ukuran kekuatan teradopsinya pelarut tersebut pada adsorben (yang banyak
digunakan alumina) dan susunan yang terbentuk dikenal sebagai deret eluotropik pelarut.

Suatu pelarut bersifat relatif polar, dapat mengusir pelarut yang relatif tak polar dari
ikatannya dengan alumina. Dalam deret eluotropik menurut Trappe, Wren dan Strain, pelarutpelarut disusun menurut besarnya kekuatan pelarut (solvent strength) eo, berangkat dari yang
tak

polar

menuju

ke

yang

sifatnya

polar

(makin

ke

bawah

Jenis-jenis

makin

polar).

Kromatografi

Kromatografi

lapis

tipis

(KLT)

merupakan kromatografi adsorpsi dan adsorben bertindak sebagai fasa diam atau fasa
stasioner. KLT dipergunakan untuk memisahkan ion-ion organik, kompleks senyawa organik
dengan anorganik, dan senyawa organik alami dan sintetis. Jenis adsorben yang banyak
dipergunakan dalam KLT adalah silika gel (asam silikat), alumina (aluminium oksida),
Kieselguhr

dan

Kromatografi

selulosa.

padatan

cair

(LSC)

Teknik ini tergantung pada teradsorpsinya zat padat pada adsorben yang polar seperti silika
gel atau alumina. Kromatografi lapisan tipis (TLC) adalah salah satu bentuk dari LSC. Dalam
KCKT kolom dipadati atau dipak dengan partikel-partikel micro or macro particulate or
pellicular (berkulit tipis 37 -44 ).Sebagian besar dari KCKT sekarang ini dibuat untuk
mencapai partikel-partikel microparticulate lebih kecil dari 20 . Teknik ini biasanya
digunakan untuk zat padat yang mudah larut dalam pelarut organik dan tidak terionisasi.
Teknik

ini

Kromatografi

terutama

sangat

kuat

untuk

pemisahan

isomer-isomer.
partisi

Teknik ini tergantung pada partisi zat padat diantara dua pelarut yang tidak dapat bercampur
salah satu diantaranya bertindak sebagai rasa diam dan yang lainnya sebagai fasa gerak. Pada
keadaan awal dari kromatografi cair (LSC), rasa diamnya dibuat dengan cara yang sama
seperti pendukung pada kromatografi gas (GC). Fasa diam (polar atau nonpolar) dilapisi pada

suatu pendukung inert dan dipak kedalam sebuah kolom. Kemudian rasa gerak dilewatkan
melalui kolom. Bentuk kromatografi partisi ini disebut kromatografi cair cair (LLC)
Untuk memenuhi kebutuhan akan kolom-kolom yang dapat lebih tahan lama, telah
dikembangkan pengepakan fase diam yang berikatan secara kimia dengan pendukung inert.
Bentuk kromatografi partisi ini disebut kromatografi fase terikat (BPC = Bonded Phase
Chromatography). BPC dengan cepat menjadi salah satu bentuk yang paling populer dari
KCKT. Kromatografi partisi (LLC dan BPC), disebut "fase normal (normal phase)" bila fase
diam lebih polar dari fase gerak dan "fase terbalik (reversed phase)" bila fase gerak lebih
polar

daripada

Kromatografi

fase

penukar

diam.

ion

(IEC)

Teknik ini tergantung pada penukaran (adsorpsi) ion-ion di antara fase gerak dan tempattempat berion dari pengepak. Kebanyakan mesin-mesin berasal dari kopolimer divinilbenzen
stiren dimana gugus-gugus fungsinya telah ditambah. Asam sulfonat dan amin kuarterner
merupakan jenis resin pilihan paling baik untuk digunakan Keduanya, fase terikat dan resin
telah digunakan. Teknik ini digunakan secara luas dalam life sciences dan dikenal untuk
pemisahan asam-asam amino. Teknik ini dapat dipakai untuk keduanya kation dan anion.
Kromatografi

eksklusi

Teknik ini unik karena dalam pemisahan didasarkan pada ukuran molekul dari zat padat.
Pengepak adalah suatu gel dengan permukaan berlubang-lubang sangat kecil (porous) yang
inert. Molekul-rnolekul kecil dapat masuk dalarn jaringan dan ditahan dalam fase gerak yang
menggenang (stagnat mobile phase). Molekul- molekul yang lebih besar, tidak dapat masuk
kedalam

jaringan

dan

lewat

melalui

kolom

tanpa

ditahan.

Kromatografi eksklusi rnernpunyai banyak nama, yang paling umum disebut permeasi gel
(GPC) dan filtrasi gel. Apapun namanya, mekanismenya tetap sama. Dalam bidang biologi,
Sephadex, suatu Cross-linked dextran gel, telah digunakan secara luas, hanya pengepak keras
dan semi keras (polistiren, silika, glass) yang digunakan dalam KCKT. Dextran gel lunak
tidak dapat menahan kinerja diatas 1 atau 2 atmosfer. Tenik ini dikembangkan untuk analisis
polimer-polimer dan bahan-bahan biologi, terutama digunakan untuk rnolekul-molekul kecil.
Kromatografi

pasangan

ion

(IPC)

Kromatogtafi pasangan ion sebagai penyesuaian terhadap KCKT termasuk baru, pemakaian
pertama sekali pada pertengahan tahun 1970. Diterimanya IPC sebagai metode baru KCKT

merupakan hasil kerja Schill dan kawan-kawan dan dari beberapa keuntungan yang unik.
Kadang-kadang IPC disebut juga kromatografi ekstraksi, kromatografi dengan suatu cairan
penukar ion dan paired ion chromatography (PIC). Setiap teknik-teknik ini mempunyai dasar
yang

sama.

Popularitas IPC muncul terutama sekali dari keterbatasan IEC dan dari sukanya menangani
sampel-sampel tertentu dengan metode-metode LC lainnya (seperti senyawa yang sangat
polar,

senyawa

yang

terionisasi

secara

kompleks

dan

senyawa

basa

kuat).

IPC dapat dilaksanakan dalam dua tipe yaitu fase normal dan fase balik. Fase diam dari rase
balik IPC dapat terdiri dari suatu pengepak silika yang disilanisasi (misalnya C8 atau C18
Bonded Phase) atau dari suatu pengepak yang diperoleh secara mekanik, fase organik yang
tidak dapat bercampur dengan air seperti 1 pentanol. Fase diam yang dipakai adalah Cs atau
CIS BPC Packing. Fase gerak terdiri dari suatu larutan bufer (ditambah suatu kosolven
organik seperti metanol atau asetonitril untuk pemisahan fase terikat) dan suatu penambahan
ion tanding,yang muatannya berlawanan dengan molekul sampel.