Cinética Enzimitica 1.- Introduccion Enzimas son proteinas de alto peso molecular (15.000 < PM < millones de Dalton) que actiian como catalizadores. Las enzimas son especificas, versétiles y un muy efectivo catalizador biolégico, resultando en mucho mayores velocidades de reaccién comparadas a reacciones catalizadas quimicamente bajo condiciones ambientales. {Como trabaja la enzima? La enzima baja Ia energia de activacién de la reaceién catalizada por medio de la unién con el sustrato y formando un complejo enzima- sustrato. La enzima no afecta el cambio de energia libre (AG) o la constante de equilibrio. La Fig. 1 ilustra la accién de la enzima desde el punto de vista de la energia de activac’ Variacion energia libre de activacién | SIN ENZIMA CON ENZIMA Progreso de la react Figura 1: Efecto de la accion enzimatica sobre la velocidad de reaccién. Los aspectos moleculares de la interaccién enzima-sustrato no son atin bien entendidos, a pesar que estudios usando rayos X y espectroscopia Raman han revelado la presencia del complejo enzima-sustrato [ES]. En muchos casos, las fuerzas de van der Waals puente de hidrogeno son responsables del complejo [ES]. El sustrato es una molécula pequeiia y se adhiere a una cierta regién de la molécula enzimatica, un sitio especifico de la enzima conocida como sitio activo, el cual es mucho mas grande, El modelo mas, simple que define esta interaccién es el Iamado “llave-candado”, en que la enzima representa cl candado mientras que el sustrato representa a lave, como se aprecia en la Fig. 2.Enzima Sustrato Complejo ES =i Enzima Producto * Figura 2: Modelo de llave cerradura. 2.- Cinética enzimatica. EL primer modelo de cinética enzimética fue propuesto por C.R. Henri en 1902 y posteriormente por L. Michaelis y M.L. Menten en 1913. La cinética de una reaccién simple tiene caracteristicas cualitativas similares a la cinética quimica de Langmuir- Hinshelwood, como se aprecia en la Figura 3. v Figura 3: Efecto de la concentracién de sustrato en la velocidad de reaccién catalizada por una enzima, El modelo de Michaelis-Menten se basa en datos experimentales de reactores discontinuos con la concentracién inicial de enzima (Eo) y la concentracién de sustrato(S:) conocidos. Una solucién enzimatica tiene un numero fijo de sitios activos donde el sustrato puede ligarse. A altas concentraciones de sustrato, todos los sitios aetivos puede ser ocupados 0, dicho de otro modo, la enzima esté saturada. La cinética de saturacién puede ser obtenida por un esquema simple de reaccién, ya que involucra un paso reversible (complejo enzima-sustrato) y un paso de disociaciin del complejo [ES]: E+Si GG ESS >E+P En la ecuacién hay 2 suposiciones implicitas: ‘+ Elcomplejo [ES] se establece rapidamente. ‘* La velocidad de reaccién reversa del segundo paso (>) es despreciable. Esta tltima suposicién sélo es viable cuando la acumulacién de producto es despreciable al comienzo de la reaccién. Las 2 principales formas usadas para desarrollar una expresidn de velocidad enzimatica son: (a) Equilibrio Répido: (b) Cuasi-estado estacionario. (a) Equilibrio rapido (Hlipotesis de Michaelis-Menten): Para desarrollar la expresién de velocidad enzimatica se plantean 2 suposiciones: I~ La concentracién del complejo activado [ES] es diferente de 0; 2.- La etapa mas lenta determina la velocidad. Asi, la velocidad de formacién de producto esti dada por: #4, 458| ve. dt Donde la velocidad v es 1a velocidad de formacién de producto 0 consumo de sustrato en mol L s?, La velocidad de variacién del complejo [ES] esta dada por: d[ES| gp AEDES] -4425]-4 [25] Dado que la enzima no es consumida, la ecuacién de conservacién de la enzima entrega: [2]=[4],-[23] Con la suposicién de equilibrio ripido entre la enzima y un sustrato para formar el complejo [ES], se puede usar el coeficiente de equilibrio para expresar [ES] en funcién de [S]. La constante de equilibrio es: Ki= AILS) k [zs] Reemplazando la ecuacién en la ecuacién y despejando el complejo [ES], se tiene: [2] 45] (x. +5] Donde X,, es la constante de disociacién del complejo [ES]. Reemplazando la ecuacién en la ecuacién [zs] = @_, (LAS) a 1K, +(5]) Haciendo V,, = 42], , entonces: {s] "|K.+[5]} La constante I’m se relaciona con la cantidad de enzima, Si aumenta [E], entonces la constante Im cambia. K,, es conocida como la constante de Michalis-Menten. Se sabe que: v© Ky=o0 mua * Si X,, es bajo, se tiene una enzima con alta afinidad por el sustrato, b) Equilibrio cuasi-estado estacionario: En muchos casos, la suposicién de un equilibrio rapido no es valido. Si [S}o >> [Eo (por ejemplo, 100 veces), en un sistema cerrado la hipdtesis de quasi-estado estacionario se mantiene después de un breve estado ‘ransiente, como se muestra en la Figura 4. El desarrollo del modelo se basa en 2 hipétesis: 1.- La concentracién del complejo activado [ES] es diferente de cero; 2.- La aproximacién al estado estacionario. ‘Al igual que en el desarrollo anterior ap y = 2 4 ES) vey HA Lego | ES| ESL e)s|— A8|-K(55] Ahora, se aplica el estado estacionario: dls) AL ak 8)45)k AES| LES] Despejando la concentracién del complejo [ES] Reemplazando la ecuacién en la ecuacién , se obtiene: + X[4],-[25]) £5] js] =e Despejando [ES] de la ecuacién : Sustituyendo la eouacién en Ia ecuacién a __k AE) #5) Haciendo que: Finalmente, se tiene que: Bajo muchas circunstancias, es imposible determinar si es K, o K,, quien esta disponible. Dado que X,, resulta de una derivacién mas general, se usari K,, por el resto del desarrollo del capitulo. El significado de K,, es el siguiente:Siz a ES} AB 0-1 42)45]-(t, 28/405] Luego (Sho [23] k+k [El Reemplazando la ecuacién en la ecuacién [s) El anilisis de la ecuacién. muestra que: * Si[S]=X,,, entonces la mitad de la enzima esti en forma libre ({E]) y la otra mitad esti como complejo activo ({ES)) «© si[S]>>X,,, la mayor parte de [E] esta combinada como [ES]. + silS]<< n+ 1a mayor parte de [E] esta en forma libre, La Figura 5 muestra gréficamente la ecuacién , de acuerdo al anélisis presentado por Levenspiel Comportamiente de orden 0 v euando [5] >> Ky Comportemiento 12 orden cuando (S] << Km, ‘nici Pendiente |, _ (Ely ! Xr S=Km 5 Figura 5: Comportamiento de la cinética de Michaelis-Menten (M-M) y sus versiones especiales, dependiendo del valor de [S] 3.- Determinacion experimental de los parametros cinéticos de la ecuacién de M- M. La determinacién de los valores de K,, y V%, resulta compleja. Los datos se obtienen de experimentos de velocidad inicial, donde un reactor discontinuo se carga con una contidad conocida de sustrato [S]> y enzima [EJp. El producto [P] 0 el sustrato [8] se grafica en funcién del tiempo, donde se evalua la velocidad inicial, es decir as loo dt dtSe realizan varios experimentos a diferentes [S]p para obtener diferentes ¥, que luego se represente como en Ia Figura 3. El problema es la determinacién de K,,. Como se realiza? A través de una linealizacién. Existen 4 formas, las mas usadas son: Linealizacién de Lineweaber-Burk; Linealizacién de Eadie-Hofstee: Linealizacién de Hanes-Woolf’y el Método Integral. 3.1.~ Linealizacin de Lineweaver-Burk: La couacién se linealiza a través de los reciprocos, y la Figura 6 muestra el resultado: 11K i, xh v Vy Vy ESI a . ] Comportamiento orden 0, [S] alta Comportamiento orden, [S] bajas Km Vm m= Figura 6: Caracteristicas de la linealizacién de Lineweaver-Burk, En este caso, el intercepto de 1a curva con la abcisa representa el valor del reciproco de Y,, mientras que el valor de la pendiente nos permite calcular K,, Algunas consideraciones: * Este tipo de linealizacién obtiene de buena manera V’,., pero K,, no siempre. * Bajas concentraciones de [S] tienen mayor influencia sobre la pendiente ( X,, /U,)y el intercepto XY (1/T7, ) que concentraciones altas. © A bajas concentraciones de [S], el grafico tiende a infinito. * Esta linealizacién es muy util para puntos dispersos. 3.2.- Linealizacién de Eadie-Hofstee: La ecuacién se “re-arregl: manera: * de la siguiente 2 "IS] La Figura 7 muestra el resultado de la eouacién -K,Comportamiento orden 0, [S] alta N\ Comportamiento NX 1P¥orden, [S] bajas x {s) Figura 7: Caracteristicas de la linealizacién de Eadie-Hofstec Algunas consideraciones: © Esla linealizacién es muy iil a bajas [S] * Con inhibicién (revisada més adelante), esta linealizacién da una mejor distincién entre mecanismos (competitiva y_ no competitiva). 3.3.- Linealizacin de Hanes-Woolf: En este caso, se grafica [S]'v v/s [S]. Lo anterior genera la siguiente ecuacién: La Figura 8 muestra el resultado de la ecuacién(s] Figura 8: Linealizacién de Hanes-Woolf. 3.4.- Método Integral: Este tipo de linealizacién se basa en la integracién de la ecuacién . Asi as {s] By 15) a ""K,+(5] Integrando 1 resulta en una linea reeta de pendiente ~ r roxas, sl +k Lan{ Slo) vig (IS]o-L51) Bi Un grafico de >In e intereepto de abseisa-ordenada 32 Acciin de Efectores. Un efector es cualquier tipo de sustancia, diferente al sustrato, que modifique la velocidad de reaccién enzimética, Existen efectores positivos, que aumentan la velocidad de reaccién y efectores negativos (inhibidores o inactivadores) que reducen la velocidad de reaccién, Los lamados “Inhibidores” producen una disminucién de la velocidad reversible, mientras que los lamados “Inactivadotes” producen una disminucién de velocidad irreversible. {Qué compuestos pueden ser inactivadores? Metales pesados tales como plomo, eadmio © mercurio, Esta inhibicién puede ser reversible agregando agentes quelantes como EDTA o citrato, En este apunte haremos énfasis en los inhibidores, los cuales pueden ser de varios tipos:4.1.- Inhibicion. competitiva: Este tipo de inhibicién se produce cuando [S] ¢ [I] (inhibidor) atacan el mismo sitio activo. Asi, esta inhibicién afecta la afinidad de la enzima, no la velocidad maxima de la misma. A su vez, la inhibicién competitiva se divide en 2 - Inhibicién totalmente competitiva: El sustrato no puede unirse a la enzima, - InhibiciGn parcialmente competitiva: El [I] se une a la enzima en un lugar cercano al sitio activo, disminuyendo la disponibilidad de éste para el sustrato. La cinética de inhibicién totalmente competitiva se debe expresar en funcién de cosas conocidas, es decir, [E], [S] y [I]. El mecanismo de reaccién se presenta a continuacion (E]+(5]8 @% [5] 4121417] (E]+U18 Yh LT) Basindose en este mecanismo de reaccidn, en la velocidad de formacién general (couacién ) y el balance de enzimas, se obtiene que: VAS] Generalizando: donde (4 uni6n del sustrato a la enzima, sino que ataca un sitio diferente en la enzima y al hacerlo detiene la accién de [S]. Asi, la inhibicién no-competitiva disminuye la velocidad maxima de reaccién (Vm), no afectando la afinidad del sustrato. Al igual que la |hibicién competitiva, existen 2 tipos de inhibicion no-competitiva: - Totalmente no-competitiva: El complejo [EIS] es inactivo, es decir, una vez. que el inhibidor se enlaza a la enzima, no se forma producto. - Parcialmente no-compatitiva: El complejo [EIS] es activo y se puede formar producto, pero a una velocidad mucho menor. La cinética de inhibicién totalmente no-competitiva se basa en el siguiente meeanismo de reaceién: (el+{S]8 99 [£8] 3[z] +[2] (e]+17]8 9 [27] [2s] +17] 9 [57] Utilizando este mecanismo de reaccién, la velocidad de formacién general (ecuacién ) y el balance de enzimas, se obtiene que: [s] v donde4,3.- Inhibicién a-competitiva o anti-competitiva (Uncompetitive): En este tipo de inhbicion, los inhibidores se unen al complejo [ES] solamente, sin tener afinidad por la enzima misma. Asi, el mecanismo de reaccidn es el siguiente: (e]+{s]6 048 [28] 3[z] +[>] [es] +[7]0 (fh [zs7] Utilizando este mecanismo de reaceién, la velocidad de formacién general (ecuacién ) y el balance de enzimas, se obtiene que: ‘ne AS] nar *{5] donde v. “8 g Una forma especial de inhibi mecanismo es el siguiente: (z]+[s]8 da [2s] 5] 2] +P] [es] +{5]8 @% [28,] La ecuacién para este tipo de inhibicién es la siguiente: [5] a = mn a-competitiva es la inhibicién por sustrato. El x, +[5] +! 5.- Determinacién de parimetros cinéticos bajo la accion de efectores. En general, se utilizan las mismas herramientas y metodologias que se usan para la determinacién de parametros para la cinética de Michaelis-Menten, es decir, a partir de velocidades iniciales y linealizaciones. A continuacién se revisarin con més deta. §.1.- Inhibicion competitiva, ara este caso, se realizan una serie de corridas a diferentes valores de concentracién de inhibidor. Para cada condicién, se ensayan diferentes valores de sustrato, calculindose para cada una de ellas la velocidad maxima inicial, A partir de los datos experimentales aJ,, J hasta J, se pueden obtener diferentes valores de Ty y Kx aparentes, usando alguna linealizacién. Lo anterior se muestra en la Figura 9 10| | | ss Al 1 A) yee n Cm Km) — Pages Kage) — Frigg Kr Fang Kaen) Figura 9: Esquema de la determinacién de pardmetros cinéticos aparentes. Si se usara, por ejemplo, Ia linealizacién de Eadie, se obtendria un grifico como se muestra en la Figura 10.A. En ella se aprecia que a medida que aumenta el inhibidor, 1a pendiente de la recta se hace mayor A ve yy T Knee The cm S Figura 10: Determinacién gréfica de parimetros para la inhibicién competitiva. A) Grafica de Eddie para diferentes valores de inhibidor; B) Linealizacién del parimetro aparente Kms. Para determinar K,, se realiza una pequefta manipulacién de la ecuacién + ap tey® Si se gratica Knayy v/s J, la ecuacién representa una recta de pendiente K,,/K, y euyo corte con el eje de la abscisa es Ky. El resultado se muestra en la Figura 10.B.Generalmente, se tienen pocos recursos y poco tiempo para la determinacién de los parimetros cinéticos. Una forma mis corta, pero de menor rigurosidad, usando s6lo una concentracién de inhibidor es calcular, a partir de la ecuacidn . Primero se calculan Vy 0. A una concentracién de / diferente de cero, se calcula el Kingy ¥ de la ecuacién se despeja Ky. Ke a partir del experimento a J Ambas formas de obtener los parametros se muestran a contimuaci6n. Ejemplo1 Sc midié la velocidad inicial de una reaccion enzimética como fincion de la concentracién de sustrato a 0, 10, 100 y 180 mM de un inhibidor, obteniendo los siguientes resultados ‘Velocidad (mM ml" min") ‘S(mM) [T=0 [T= 10 | 1= 100 | 1= 180 os [29 {11 | os | 07 10_| 5.6 [22 [19 15. 5.0 [229] 10 | 65 | 62 10.0 [37.3 | 18.3 | 12.2 | 11s 25,0 | 598] 35.9 | 259 [ 245 30.0 [748 [528 | 411 [394 Obtenga los parametros cinéticos de la reaccién. Suponga que la enzima sin inhibicién tiene una cinética Michaelis-Menten, ,Qué tipo de inhibicidn tiene? Solucion. La primera etapa es aplicar la linealizacion de Eadie-Hofstee a los datos experimentales. 12