OKSIDACIJSKI STRES I

KARCINOGENEZA

Kolegij: SLOBODNI RADIKALI I ANTIOKSIDANSI U

ZDRAVLJU I BOLESTI
LADA RUMORA
Zavod za medicinsku biokemiju i hematologiju

Reaktivne kisikove vrste, ROS

(engl. reactive oxygen species)

slobodni radikal molekula ili atom s

jednim ili vie nesparenih elektrona u
vanjskoj orbitali

bioloki znaajne ROS:

superoksidni radikal (O2.-)

vodikov peroksid (H2O2, nije radikal)

hidroksilni radikal (HO., jako reaktivan)

citokrom c

III
O2

NADH-Qoksidoreduktaza
NADH

IV

sukcinat-Qreduktaza

citokrom-coksidaza

O2

Q-citokrom coksidoreduktaza

sukcinat fumarat

NAD+

O2.-

unutranja
membrana
mitohondrija

II

MnSOD

H2O2

1/2O2
+
2H+

H2O

katalaza / GSH peroksidaza

H2O + O2

Drugi izvori ROS u stanici

enzimska aktivnost
NADPH oksidaza, ksantinska oksidaza,
citokrom P450, lipooksigenaza,
ciklooksigenaza

samo-oksidacija malih molekula

katekolamini, flavini

redoks-ciklus ksenobiotika
parakvat, nitrofurantoin, adriamicin

Djelovanja ROS-a

oteenje razliitih makromolekula u stanici

(nukleinske kiseline, proteini, lipidi, ugljikohidrati)

poticanje ili inhibicija razliitih signalnih

putova (djelovanje na proteinske kinaze, fosfataze,
proteaze, transkripcijske faktore)

ekspresija gena

poticanje ili inhibicija proliferacije stanica

umiranje stanica

(razliiti bioloki odgovori stanice)

(nekroza, apoptoza)

Bioloki odgovor stanice ovisi o:

vrsti stanice

vrsti ROS-a

redoks-statusu stanice

duini vremena izlaganja ROS-u

koncentraciji ROS-a

sposobnosti stanice da ukloni i detoksicira

ROS (antioksidacijski sustav)

Antioksidacijski sustav
(unutarstanine, membranske i izvanstanine molekule)

enzimi i proteini

male molekule

superoksidna dismutaza
katalaza
glutationska peroksidaza

liponska kiselina
ubikinon (koenzim Q)
flavonoidi
karotenoidi
vitamin E
vitamin C
glutation
tioredoksin
glutaredoksin
mokrana kiselina (urati)
bilirubin

glutationska reduktaza
glutationska S-transferaza
feritin
transferin
laktoferin
ceruloplazmin
albumin
haptoglobin
hemopeksin

Kljune znaajke karcinogeneze

(Douglas Hanahan & Robert A. Weinberg)
1. sinteza faktora rasta i poticanje proliferacije stanica
2. neosjetljivost na signale koji sprjeavaju rast stanica
3. izbjegavanje umiranja stanica procesom apoptoze
4. neogranien replikacijski potencijal
5. poticanje i odravanje angiogeneze
> 24 faktora koji potiu angiogenezu (VEGF, FGF1/2) te slian
broj endogenih inhibicijskih proteina (trombospondin-1, -interferon)

6. invazija tkiva i metastaziranje

VEGF = vascular endothelial growth factor
FGF = fibroblast growth factor

HOMEOSTAZA

proliferacija stanica

umiranje stanica

RAZVOJ TUMORA

Oksidacijski stres i karcinogeneza

potaknuti metalima

ELJEZO
Fe ROS oteenja DNA
istraivanja ukazuju na povezanost izmeu konc.
Fe i rizika za razvoj razliitih bolesti (tumori);
manji rizik u djece i ena u premenopauzi
konzumiranje mesa kolorektalni karcinom
genska hemokromatoza hepatocelularni karcinom
profesionalna izloenost azbestu (maseni udio Fe
oko 30%) azbestoza mezoteliom pleure,
karcinom plua, karcinom kolona

BAKAR
Cu1+ (Fe2+) + H2O2 Cu2+ (Fe3+) + OH. + OH- (Fentonova reakcija)
Cu2+ (Fe3+) + O2.- Cu1+ (Fe2+) + O2
: H2O2 + O2.- O2 + OH. + OH- (Haber-Weissova reakcija)
RSH + Cu2+ RS. + Cu1+ + H+
pro-oksidans lipidna peroksidacija
konc. Cu proliferacija tumorskih stanica
tetratiomolibdat (TM) vee Cu unesen hranom prije
apsorpcije u tijelu;
sprijeen rast postojeih tumora i nastanak novih tumora

KROM

1. GSH i Cr(VI) redukcija Cr(VI) u Cr(V)

2. osim GSH, Cr(VI) mogu reducirati i askorbat, NAD(P)H, cistein,
liponska kiselina, fruktoza, riboza i dr.
3. Cr(V) reagira s H2O2 OH oteenja DNA, aktivacija gena
4. i 5. GS moe otetiti stanine strukture, ali moe i reagirati s drugim
tiolnim molekulama u oksigeniranim tkivima O26. O2- reducira Cr(VI) Cr(V)
7. Cr(V) reagira s H2O2 OH oteenja DNA, aktivacija gena
8. redukcija Cr(V) u Cr(IV) staninim reduktantima (askorbat, GSH i dr.)
9. Cr(IV) reagira s H2O2 OH oteenja DNA, aktivacija gena

KROM
Cr(VI) u stanici oteuje DNA (Cr-DNA
adukti, stvaranje unakrsnih veza izmeu DNA
i proteina te izmeu 2 DNA molekule,
oksidacijska oteenja)
Cr-DNA adukti mutagenost i
genotoksinost Cr(VI)
Cr(VI) karcinom plua, karcinom dojke,
tumori respiracijskog sustava

KADMIJ
neizravno stvara slobodne radikale:
moe zamijeniti Fe i Cu u proteinima
jako toksian, snaan karcinogen
kategorija broj 1 humanih karcinogena
karcinom plua, prostate, guterae, bubrega
- inhibicija apoptoze (kaspaza-3)
preivljava vei broj genski oteenih stanica

Oksidacijska oteenja biomolekula

OKSIDACIJSKO OTEENJE DNA

ROS lom jednog ili oba lanca DNA,
modifikacija purinskih i pirimidinskih baza
(poremeaj specifinog sparivanja baza, krivo
oitavanje baza), modifikacija deoksiriboze,

stvaranje unakrsnih veza izmeu DNA

molekula te DNA i proteina, stvaranje DNAMDA (malondialdehid) adukta
oteenje DNA ili transkripcije,
putova prijenosa signala, replikacijske
pogreke, nestabilnost genoma
karcinogeneza
- vanost sustava popravka baza!

-8-okso-7,8-dihidrogvanin (8-oksoG, 8-oksoGva)

produkt oksidacije DNA (8-oksogvanin; 8-hidroksigvanin)
-mutagen i karcinogen
-dobar biomarker oksidacijskog stresa (HPLC, MS, ELISA)
-potencijalni biomarker karcinogeneze
- 8-oksoG u mokrai i u leukocitima puenje, teak
fiziki rad, rad u smjenama
- 8-oksoG umjerena fizika aktivnost (sport)
Chem Res Toxicol. 2010 Apr 19;23(4):705-7.
Recommendations for standardized description of and nomenclature concerning
oxidatively damaged nucleobases in DNA.
Cooke MS, Loft S, Olinski R, Evans MD, Bialkowski K, Wagner JR, Dedon PC, Mller P, Greenberg MM, Cadet J.

OKSIDACIJSKO OTEENJE PROTEINA

tiolni spojevi imaju antioksidacijski kapacitet zbog atoma

sumpora (S), koji se lako moe prilagoditi gubitku jednog
elektrona

oksidacijska modifikacija Cys samo ukoliko okoli odreuje

pKa deprotoniranje sulfhidrilnog tj. tiolnog oblika (-SH)
u tiolatni oblik tj. tiolatni anion (-S-);
pKa ciljnog Cys mora biti <7,0

pKa vrijednost tipinog cisteina u proteinima je >8,0 tj.
iznosi oko 8,5

redoks-osjetljivi proteini:
promjena enzimske aktivnosti (Cys u katalitikoj domeni) ili
vezanja transkripcijskog faktora na DNA (Cys u DNA-vezujuoj
domeni)
stvaranjem disulfidnih veza proteini ili postaju funkcionalni ili
gube funkciju:
stvaranje intramolekulskih disulfidnih veza promjena strukture i
konformacije tog proteina
stvaranje intermolekulskih disulfidnih veza HOMO- ili HETEROdimeri i/ili multimeri

-oksidacija proteinskih sulfhidrilnih tj. tiolnih skupina:

- S-hidroksilacija tj. oksidacija: R-SH + ROS derivati sulfenske kiseline (R-SOH)
= djelomino oksidirani produkti redukcija u R-SH
- R-SOH + GSH S-glutatiolirani proteini (R-SSG) redukcija u R-SH
-S-glutatiolacija: R-SH + GSSG R-SSG + GSH
-S-nitrozilacija: R-SH + NO. R-SNO
- daljnja oksidacija derivata sulfenske kiseline ireverzibilni oksidacijski oblici:
- derivati sulfinske kiseline (R-SO2H)
- derivati sulfonske kiseline (R-SO3H)

Oksidacijski stres, GSH i karcinogeneza

glutation - glavni neproteinski tiolni

antioksidans u stanici

1-10 mM koncentracije glutationa u gotovo

svim vrstama stanica;
u jezgri i u mitohondrijima oko 20 mM (etiri
puta vie nego u citoplazmi)

glutation (GSH) reducirani oblik;

glutation disulfid (GSSG) oksidirani oblik

Vaan za reaktivaciju
enzima / proteina
ije su SH skupine oksidirane!

DJELOVANJE GLUTATIONA
oksidirani oblik
proteinskog lanca

reducirani oblik
proteinskog lanca

ROS - reaktivni
kisikovi spojevi

reducirani glutation

oksidirani glutation

10

mitohondrijska respiracija,
ionozirajue zraenje,
sulfo-lijekovi, herbicidi ...

superoksidni radikal

O2

ULOGA NADH i GLUTATIONA

U ZATITI OD VISOKO REAKTIVNIH
KISIKOVIH SPOJEVA

vodikov peroksid (H2O2)

ILI organski
H2O2
peroksidi (R-OOH)

glutationska peroksidaza (Se)

2GSH

hidroksilni radikal

OH

2H2O

GSSG

glutationska reduktaza

NADP+

oksidacijsko oteenje
lipida, proteina, DNA

NADPH + H+

6-fosfoglukono-lakton
glukoza 6-fosfat dehidrogenaza

glukoza 6-fosfat

Glutationska peroksidaza, GPx (Se)

GEN

LOKUS

ENZIM

GPX1

Chr. 3 p21.3

GPx1

GPX2

Chr. 14 q24.1

GPx2 (gastrointestinal)

GPX3

Chr. 5 q23

GPx3 (plasma)

GPX4

Chr. 19 p13.3

GPx4 (phospholipid hydroperoxidase)

GPX5

Chr. 6 p21.32

GPx5 (epididymal androgen-related protein)

GPX6

Chr. 6 p21

GPx6 (olfactory)

GPX7

Chr. 1 p32

GPx7

GPX8

Chr. 5 q11.2

GPx8 (putative)

Katalizira reakciju: RSeH + H2O2 RSeOH + H2O

RSeOH + GSH GS-SeR + H2O
GS-SeR + GSH GS-SG + RSeH
odnosno: 2GSH + H2O2 GSSG + 2H2O
Zatim glutationska reduktaza (GR) reducira GSSG, ime zavrava ciklus:
GSSG + NADPH + H+ 2 GSH + NADP+

11

GLUTATIONSKA REDUKTAZA, GR (dimer)

FAD i NADPH se veu

u ispruenom obliku

2 e- iz: NADPH

FAD

Cys63S
I
Cys58S

G
S
I
G
S

NADP+ + 2 GSH

GR

1. O2- H2O2
2. glutation peroksidaza (GSH je
donor elektrona) uklanja H2O2
3. glutation reduktaza (NADPH je
donor elektrona) reducira GSSG u GSH
4. neki prijelazni metali (Fe2+, Cu+ i dr.)
potiu prijelaz H2O2 u OH
5. OH moe ukloniti elektron iz
polinezasienih MK (LH)
nastaje lipidni radikal (L)
6. L stupa u interakciju s O2 i nastaje
lipidni peroksilni radikal (LOO)
7. red. oblik vit. E (T-OH) reducira
LOO u membrani lipidni hidroperoksid
(LOOH) i radikal vitamina E (T-O)
8. regeneracija vitamina E vitaminom C
askorbilni radikal (Asc-) = dehidroaskorbat
9. regeneracija vitamina E pomou GSH
10. redukcija GSSG i Asc- s dihidroliponskom kiselinom (DHLA) -liponska kiselina (ALA)
11. regeneracija DHLA pomou NADPH
12. LOOH aldehidi (npr. 4-hidroksinonenal, 4-HNE)
13. 4-HNE (snaan oksidans) glutatiilni adukt (nije tetan) glutation S-transferaza (GST)
14. glutation peroksidaza (GSH je donor elektrona) reducira LOOH u odgovarajui alkohol i O2

12

-glutamyl
cyclotransferase

5-oxoprolinase

GPx = glutathione peroxidase

GR = glutathione reductase
GST = glutathione S-transferase
GGT = -glutamyl transpeptidase
GCL = glutamate-cysteine ligase
GS = glutathione synthetase

sinteza glutationa:

glutamat-cistein ligaza, GCL (prije: -glutamilcistein

sintetaza, -GCS)
glutation sintetaza, GS
cistein, GSH (inhibicija GCL)

u fiziolokim uvjetima:
konc. GSH puno vea od konc. GSSG (~ 10-100 puta vea);
omjer GSH/GSSG = 10-100 tj. >100
omjer ovisi o staninom odjeljku:
od 2:1 u ER do vie od 60:1 u drugim odjeljcima

kod oksidacijskog stresa:

naglo konc. GSH, a konc. GSSG;
omjer GSH/GSSH = 1-10 (omjer se pomie u korist GSSG)

omjer GSH/GSSG je dobar pokazatelj oksidacijskog

stresa u organizmu

13

zatitna uloga GSH:

antioksidacijska zatita (DNA, proteini / enzimi)
interakcija s pro- i anti-apoptoznim signalnim molekulama
(proteinske kinaze, fosfataze, proteaze)
modulacija redoks-stanja u stanici
modulacija redoks-osjetljivih transkripcijskih faktora
detoksikacija toksina i kancerogena tumori i mutacije u
glutationskoj S-transferazi (GST)

znaajno omjer GSH/GSSG karcinom kolona,

karcinom dojke;
konc. GSSG osobito u uznapredovalim stadijima
razvoja tumora

GSH zatita tumorskih stanica i rezistencija na

razliite kemoterapeutike

Oksidacijski stres, transkripcijski

faktori i karcinogeneza

p53 - redoks-osjetljiv transkripcijski

faktor
uloga u zatiti stanica od karcinogeneze:
zaustavlja stanini ciklus (uklanjanje oteenja)
ili potie apoptozu (oteenje stanice preveliko)
tumor supresor tj. potiskiva tumora
inaktivacija p53 nekontrolirana dioba stanica
(uloga u kontrolnim tokama: G1, S, G2)

14

Mutacije (karcinogeni metali, RONS) u p53 dovode do njegove

inaktivacije u >50% tumora u ljudi!

p53 - karakteristike

Funkcionalni tetramerni oblik proteina stabiliziran je fosforilacijom,

acetilacijom i atomom cinka!

15

16

 djelovanje karcinogenih metala na p53:

Cr(VI) fosforilacija Ser15 i acetilacija Lys383 u
p53 izravna aktivacija p53;
Cr(VI) neizravno induciranje p53-posredovane
apoptoze: uzrokuje oteenja DNA, aktivira MAPK
koje djeluju na p53;
npr.: c-Jun (transkripcijski faktor kojeg fosforilira
tj. aktivira JNK tj. MAPK negativan regulator i
ekspresije p53 i sposobnosti p53 da aktivira
transkripciju ciljnih gena (izravno djelovanje: AP-1
mjesta u promotorskoj regiji p53 gena)
istiskivanje cinka (koji je neophodan za vezanje p53 na
DNA) nekim metalom inaktivacija p53 (ne
uzrokuje mutacije niti oksidaciju u p53)

regulira proces angiogeneze tako to aktivira

gene koji inhibiraju, a potiskuje gene koji
potpomau rast novih krvnih ila

agensi koji induciraju oksidacijski stres (neki metali i dr.)

translokacija aktiviranih transkripcijskih faktora u jezgru

oksidacijske modifikacije specifinih Cys mogu inhibirati

vezanje transkripcijskih faktora na DNA
nekoliko Cys-ostataka u sredinjoj domeni p53 je bitno za
vezanje p53 na specifine slijedove DNA
npr. oksidirani Cys182 inhibirana pravilna interakcija s DNAvezujuom domenom disocijacija tetramera

regulacija aktivnosti transkripcijskih faktora u 2 koraka:

oksidacija u citoplazmi i redukcija u jezgri;
jezgra vrlo visoke konc. GSH, tioredoksina (Trx),
glutaredoksina (Grx) i Ref-1; isto za mitohondrije
Ref-1 = regulator of fusion

17

-transkripcija gena se aktivira tek nakon reverzibilne

oksidacije te kasnije redukcije Cys-ostatka
-samo se reducirani oblik (Cys-SH) transkripcijskog faktora
vee na DNA kljuan je reducirajui okoli u jezgri

METALI
popravak DNA
upala

RONS

oteenje DNA
mutacije

signalni putovi
promijenjena ekspresija gena

razvoj tumora

RONS = reaktivne kisikove

i duikove vrste

18

ROS sudjeluje u svim fazama procesa karcinogeneze

inicijacija mutacija u DNA molekuli koja nije

smrtonosna, popravljaju se oteenja DNA

promocija poticanje proliferacije stanica i/ili

inhibicija apoptoze klonalna ekspanzija stanica;
kontinuirana prisutnost stimulansa koji potiu
stvaranje tumora te ovisi o njihovoj koncentraciji

progresija ireverzibilna faza;

nakupljanje dodatnih genskih oteenja;
prelazak u maligno stanje

19