HIDRLISIS ENZIMTICA DEL ALMIDN

Ingeniera de Alimentos

Laboratorio de Biotecnologa

Paula Andrea Loaiza Giraldo

Diana Lorena Quintero Henao

UNIVERSIDAD DE CALDAS
MANIZALES, CALDAS
ABRIL 2015

ACTIVIDAD ENZIMTICA.
HIDRLISIS ENZIMTICA DEL ALMIDN

RESULTADOS
Tabla 1. Datos obtenidos para la curva de calibracin por el mtodo del DNS

ABSORBANCIA
0,056
0,101
0,165
0,293
0,355
0,412

PPM GLUCOSA
100
200
300
700
800
900

Figura 1. Curva de calibracin ppm glucosa vs absorbancia

ABS

ABS vs ppm glucosa

0,45
0,4
0,35
0,3
0,25
0,2
0,15
0,1
0,05
0

y = 0,0004x + 0,0198
R = 0,99

ABS v.s ppm glucosa

500
ppm glucosa

Ecuacin de la recta
Y = mx + b
Y = 0,0004x + 0,0198

1000

RESULTADOS OBTENIDOS PARA LA -AMILASA

Tabla 2. -amilasa lectura espectrofotmetro

Tiempo de reaccin
(min)
0
10
20
30
40
50
60

Absorbancia
0,105
0,352
1,133
1,872
2,329
2,104
1,358

CONCENTRACION GLUCOSA REAL PPM

Aplicando la ecuacin de la recta y = 0,0004x + 0,0198, se calcul la concentracin de
glucosa en ppm as:
Hallamos Y de la ecuacin de la recta obtenida en la grfica 1.
y = 0,0004x + 0,0198

Concentracin para T= 0 min (blanco enzimtico)

Concentracin para T= 10 min

Concentracin para T= 20 min

Concentracin para T= 30 min

Concentracin para T= 40 min

Concentracin para T= 50 min

Concentracin para T= 60 min

CONCENTRACIN AZCARES REDUCTORES REAL

(

)
(

CONCENTRACION GLUCOSA REAL (gr/L) (AR reales)

AR reales=

CONCENTRACION GLUCOSA (mmol/L)

mmol/L=
mmol/L
AZUCARES REDUCTORES TOTALES.
AR totales = 8,305g/L 2,13g/L = 6,175g/L

AZUCARES REDUCTORES TERICOS

La glucosa terica no se puede determinar por qu las variedades de almidn varan, se
utiliza equivalente de dextrosa.
EQUIVALENTE DEXTROZA

PORCENTAJE DE HIDROLISIS.

= 75%
ACTIVIDAD ENZIMTICA
Actividad Enzimtica =
ml enzima = 0,45 ml
U=
) (

U (10 min) = (

)= 3,4306 mmol/L*min

Este procedimiento se realiza para cada uno de los tiempos y as obtener un valor de U
promedio para calcular la actividad enzimtica.
U promedio =

Actividad Enzimtica =

Tabla 3. Datos para la alfa amilasa

tiempo
(min)

ABS

Concentraci
n ppm

AR
Totales g/L

U
mmol/Lmin

0,11

Concentraci
n
gr/L
2,13

(B.E)
0
10
20
30
40
50
60

2130

0,352
1,133
1,872
2,329
2,104
1,358

8,305
27,83
46,305
57,73
52,105
33,455

8305
27830
46305
57730
52105
33455

6,175
25,700
44,175
55,600
49,975
31,325

3,4306
7,1389
8,1806
7,7222
5,5528
2,9005

% ED
g/L

8,33
34,26
58,9
74,13
66,63
41,76

Figura 2. Concentracin de glucosa vs tiempo

Glucosa vs Tiempo
70

y = -0,0314x2 + 2,6408x - 5,8194

R = 0,8851

60

Glucosa
g/L

50
40

Concentracin

30
20

Polinmica
(Concentracin )

10
0
-10 0

20

40
60
Tiempo (min)

80

y = - 0,0314x2 + 2,6408x 5,8194

Derivando la ecuacin 1, y evaluando en t=0 se obtiene la velocidad de reaccin
enzimtica (Vrxn) de alfa amilasa.
Y= - 0,0628x + 2,6408
En t = 0
Vrxn-amilasa = 2,6408

Figura 3. Concentracin de azucares reductores reales vs tiempo

AR real vs tiempo
AR reales vs tiempo
gL

60

y = 0,7553x + 7,7634
R = 0,5825

50
40

azucar reductor real

30
20

Lineal (azucar reductor

real)

10
0
0

20

40

60

80

Tiempo (min)

Figura 4. %equivalente dextrosa vs tiempo de reaccin

%ED vs Tiempo
80
70

% ED g/L

60
50
40
30

%ED

20
10
0
0

10

20

30

40

Tiempo (min)

50

60

70

Resultados Glucoamilasa
Tabla 5. Glucoamilasa lectura espectrofotmetro
Tiempo (min)

ABS

0,11

15

2,799

30

3,402

45

3,276

60

3,456

CONCENTRACION GLUCOSA REAL PPM

Concentracin para T= 15 min

Concentracin para T= 30 min

Concentracin para T= 45 min

Concentracin para T= 60 min

CONCENTRACIN AZCARES REDUCTORES REALES

(

)
(

)
(

CONCENTRACION GLUCOSA REAL (gr/L) (AR reales)

AR reales=

CONCENTRACION GLUCOSA (mmol/L)

Mmol/L=
mmol/L

AZUCARES REDUCTORES TOTALES.

AR totales = 69,48g/L 2,13 g/L = 67,35 g/L

AZUCARES REDUCTORES TERICOS

La glucosa terica no se puede determinar por qu las variedades de almidn varan, se
utiliza equivalente de dextrosa.

EQUIVALENTE DEXTROZA

PORCENTAJE DE HIDROLISIS.

= 75%

ACTIVIDAD ENZIMTICA
Actividad Enzimtica =
ml enzima = 0,45 ml
U=

Tabla 6. Datos para la Glucoamilasa

Tiemp
o
(min)
0
15
30
45
60

ABS

Concentracin Concentracin
glucosa
glucosa
g/L
ppm
2,13
2130
69,48
69480
84,555
84555
81,405
81405
85,905
85905

0,11
2,799
3,402
3,276
3,456

AR
totales
ppm
38155
53230
50080
54580

AR
Totales
g/L
67,350
82,425
79,275
83,775

U
Mmol/min

%ED
g/L

2,8263
3,2858
2,6497
2,5269

89,9
109,9
105,7
111,7

Figura 5. Concentracin de glucosa vs tiempo

Glucosa
g/L

glucosa vs Tiempo
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0

y = -0,0457x2 + 3,9379x + 8,2393

R = 0,9289

glucosa
Polinmica (glucosa)

20

40

60

80

Tiempo (min)

Y = -0,0457x2 + 3,9379x + 8,2393

Derivando la ecuacin 2, y evaluando en t=0 se obtiene la velocidad de reaccin
enzimtica (Vrxn) de glucoamilasa.
Y = -0,0457x + 3,9379
En t=0
Vrxn glucoamilasa = 3, 9379

Figura 6. Concentracin de azucares reductores reales vs tiempo

AR reales vs Tiempo
120
y = 1,1965x + 26,67
R = 0,6365

100
AR reales
g/L

80
60

AR reales

40

Lineal (AR reales)

20
0
0

20

40

60

80

Tiempo (min)

Figura 7. %equivalente dextrosa vs tiempo de reaccin

%ED vs Tiempo
% Equivalente Dextrosa

120
100
80
60
%ED

40
20
0
0

10

20

30

40

Tiempo (min)

50

60

70

ANALISIS DE RESULTADOS

La velocidad de reaccin enzimtica para la Glucoamilasa fue menor porque la hidrlisis

de amilosa y amilopectina con glucoamilasa provenientes del primer tratamiento poseen
mltiples y dispersas ramificaciones.
Para obtener los resultados esperados es necesario controlar factores crticos como
temperatura y tiempo para que se lleve a cabo la hidrlisis en condiciones ptimas.
El almidn est formado por dos polmeros de glucosa de diferente estructura, la
amilosa (unidades de D-glucosa formada por enlace 1,4) y amilopectina (unidades de Dglucosa de cadenas ramificadas, en la cadena principal del tipo -1,4 y con enlaces en los
puntos de ramificacin del tipo -1,6), en este proceso se demostr la especificidad de la
-amilasa, ya que esta hidroliza todos los enlaces lineales de la amilosa y la amilopectina,
la glucoamilasa hidroliza los enlace -1,6 de la partes ramificadas a una menor velocidad
que los enlaces -1,4; reduciendo de esta manera la molcula del polisacrido de Dglucosa. En la figura 3 se observa la velocidad de formacin de azucares reductores
reales de la -amilasa y en la figura 6 se observa la velocidad de formacin de azucares
reductores de la glucoamilasa, es evidente que se form una mayor cantidad de azucares
reductores en la accin de la glucoamilasa, esto se debe a que la -amilasa hidrolizo
parcialmente el almidn, y la glucoamilasa trabaja consecutivamente de la amilasa
por lo que los enlaces de las molculas ms pequeas que reaccionan con la
glucoamilasa, por su tamao son ms fciles de reducir a su mnima expresin que sera
la D- glucosa, por lo tanto la cantidad de azucares reductores y la velocidad son mayores
en la glucoamilasa que en la amilasa.
Se hall las velocidades de las dos reacciones enzimticas analizadas por el mtodo de
velocidades inciales para la alfa amilasa se obtuvo una velocidad de 2.6408 mmol/L*min,
para la gluco- amilasa la velocidad fue de 3.9379 mmol/L*min; siendo esta mayor que la
de la otra enzima analizada. La velocidad de reaccin aumenta cuando la concentracin
de la enzima es mayor y se reduce cuando la concentracin enzimtica es a una
temperatura menor a la ptima. Las reacciones catalizadas por enzimas se aceleran
cuando la temperatura es ptima, lo que se debe, en parte, al incremento de movimiento
de las molculas que provoca colisiones ms frecuentes del sustrato con la enzima.

CONCLUSIONES

Se aplicaron los conceptos bsicos de la tecnologa enzimtica que permitieron

procesar almidn usando enzimas comerciales.

Se evidencio porque la -amilasa es considerada como una enzima licuante ya

que tiene capacidad de hidrolizar el almidn rompiendo sus enlaces glucosdicos
internos, en el momento en que se adiciono la enzima a la mezcla de fcula con
agua empez a notarse la clarificacin de la muestra hasta el punto en que quedo
casi transparente.

Si se deseara hidrolizar el almidn en azcares solubles, la alfa amilasa tendra

una mayor efectividad debido a que esta es encargada de cortar los enlaces
glucosdicos de tal manera que se formen estos azcares, es decir, la a- amilasa
es apta para la obtencin de azcares reductores y esto se pudo observar durante
la prctica donde con esta se obtuvo una mayor concentracin de glucosa.

Pudimos observar que el uso de la alfa amilasa es indispensable debido a que es

una endoenzima que ataca las molculas de amilasa y la glucoamilasa por ser una
exoenzima que ataca las ramificaciones de la molecula.

CUESTIONARIO
1- Explique en qu consisten los siguiente procesos:

Gelatinizacin:
Los grnulos de almidn son prcticamente insolubles en agua fra, pero a medida
que se incrementa la temperatura cuando estos se encuentran en una solucin
acuosa, se retiene agua y el grnulo empieza a hincharse aumentando de
volumen. Cuando se alcanza una determinada temperatura, el grnulo alcanza su
volumen mximo, si se administra ms calor, el grnulo hinchado incapacitado
para retener el lquido se rompe parcialmente, as la amilosa y la amilopectina se
dispersan en el seno de la disolucin. La gelatinizacin transforma los grnulos de
almidn insolubles en una solucin de las molculas constituyentes en forma
individual. A medida que aumenta el volumen de los grnulos, aumenta la
viscosidad de la dispersin acuosa. Cuando los grnulos se rompen, la viscosidad
se reduce hasta un valor estable en el que se produce un gel cuyas caractersticas
fsicas y qumicas son diferentes en cada almidn. La temperatura de
gelatinizacin es aquella en la cual se alcanza el mximo de viscosidad y se
pierden la birrefringencia (ndice de refraccin de los grnulos) y el patrn de
difraccin de rayos X. Esta temperatura es realmente un intervalo, porque as los
grnulos provengan de la misma fuente botnica, tienen diferente composicin y
organizacin, lo que origina que unos sean ms resistentes que otros.

Licuefaccin:
La licuefaccin o dextrinizacin: es el proceso mediante el cual a partir de un
almidn gelatinizado se obtiene una rpida disminucin de la viscosidad en virtud
de una hidrlisis parcial. En esta etapa se producen polisacridos de longitud
intermedia (maltodextrinas con 5 a 10 unidades de glucosa) y pequeas cantidades
de polisacridos de alto peso molecular, como tambin algunos de bajo peso
molecular (glucosa, maltosa entre otros).

Sacarificacin:
a partir de las maltodextrinas de la etapa anterior se completa la hidrlisis total del
almidn a glucosa. En la digestibilidad de almidones como materia prima, muchos
factores como el tamao de particular, relacin de amilosa:amilopectina, extensin
de la asociacin molecular entre los componentes del almidn, grado de
cristalinidad, longitud de la cadena de amilosa y presencia de complejos lpidosamilosa, juegan un papel importante en la degradacin hidroltica

2- Identifique plenamente cundo se dieron estos tres procesos durante el

transcurso de la prctica y analice si se dieron simultneamente o por
separado.
El proceso de gelatinizacin se evidencio desde el momento en el que almidn fue
calentado en agua en exceso, cada vez que se aumentaba la temperatura se iba
tornando blanco y muy viscoso; esto se debe a la fase de transicin donde hay
una difusin de agua dentro del granulo y posterior regin amorfa, luego
hidratacin y por ultimo una hinchazn en donde el granulo es incapaz de retener
lquido y se rompe dispersando amilosa y amilopectina.

El proceso de licuefaccin despus de tener el almidn gelatinizado y despus de

adicionar la enzima -amilasa se empez a notar como disminuia la viscosidad,ya
que la enzima actua cortando las cadenas de los polmeros amilosa y amilopectina
en cadenas de tamao regular, dando como resultado dextrinas, maltosa,
maltotriosa y maltopentosa.
El proceso de licuefaccin ocurre
proceso de gelatinizacin fue a
licuefaccin ocurre cuando se
desnaturaliza a 80C por lo tanto
disminuyera a 55C.

por separado de la gelatinizacin, ya que el

una temperatura de 80C y el proceso de
adiciona la enzima -amilasa y esta se
haba que esperar hasta que la temperatura

La sacarificacin es consecutiva de la licuefaccin pero aqu se agrega la enzima

glucoamilasa, con el paso del tiempo se vea ms liquida la solucin, ya que esta
enzima tiene la capacidad de hidrolizar los enlaces 1,4 de extremos no reductores de polisacridos para la formacin de glucosa.
3- Interprete los datos de la evaluacin sensorial:
No se realiz evaluacin sensorial
4- Proponga, y de ser posible implemente, un mtodo para medir la
concentracin de slidos totales en una muestra de almidn hidrolizado.
Los slidos totales de un almidn se pueden medir por refractmetro, donde Un
Brix es igual a un gramo de azcar en 100 gramos de solucin, este
procedimiento es rpido, de bajo costo y de buena exactitud o retirando toda la
humedad posible de la muestra y finalmente calculando su peso. Tambin hay
aparatos ms especficos como el sacarmetro, los mtodos colorimtricos, o la
cromatografa lquida de alta eficiencia (HPLC).
5- Explique con sus propias palabras el sentido fsico del equivalente de dextrosa
(ED) y su importancia prctica.
Este mtodo se utiliza para la determinacin del contenido de azcares de todos
los hidrolizadosde almidn preparados mediante conversin cida, enzimtica o la
combinacin de ambas.
Los azcares del tipo aldosa tienen accin reductora frente a ciertos grupos
metlicos, por loque pueden determinarse mediante una modificacin del mtodo
de Eynon y Lane, donde lasmolculas de dextrosa y maltosa presentes en
lamuestra reducen el sulfato de cobre en un sistemade tartrato en medio alcalino
bajo condicionescontroladas, dando un precipitado rojo de xidocuproso. El
resultado se expresa como dextrosa y se calcula como por ciento de materia seca.

6- Utilizando las diferentes definiciones que se reportan en la literatura sobre el

equivalente de dextrosa (ED), analice si se puede calcular este parmetro para
las dos reacciones estudiadas. En caso de que no sea posible, explique qu se
debe hacer para hallar el ED
No es posible hallar ED por el mtodo de fehling porque no se realiz en el laboratorio;
pero se podra hallar de la siguiente manera:
(

En donde los azucares reductores fueron hallados por el mtodo de DNS, donde en la
curva de calibracin y con la ecuacin de la recta se hall las ppm de glucosa y por un
factor de conversin se llevaron a g/L siendo estos valores las concentraciones de
los azucares reductores y a partir de estos se hallaron los reales mediante la siguiente
ecuacin:
Azucares Reductores Reales=(ARmuestra-ARblanco) g/L
7- Compare los resultados obtenidos de velocidad de las reacciones enzimticas
utilizando los mtodos grfico y analtico.
La velocidad de reaccin se refiere al cambio en la concentracin de reactivos o
productos por unidad de tiempo. La velocidad de reaccin de la glucoamilasa
(Vrxnglucoamilasa=1.4467mmol/L*min) fue mayor que la velocidad de reaccin de la alfa
amilasa (Vrxn-amilasa=1.0273 mmol/L*min) esto quiere decir que la hidrolisis del
almidn es ms rpida en el momento de accin de la enzima sacarificante
(glucoamilasa) comparado con la enzima licuefante (alfa amilasa).
8- Argumente que experimentos se deben realizar para obtener la cintica
enzimtica completa de la hidrlisis del almidn de arroz.

Una alternativa de aplicacin industrial que signifique un avance tecnolgico es la

obtencin de derivados de contenido variable de sacridos a partir de almidn. De

acuerdo con esto, se plante primero producir malto dextrinas de bajo DE (equivalente
de dextrosa) mediante hidrlisis enzimtica.
Diseo experimental. Se usa un diseo factorial 2 de dos factores a dos niveles con
punto central para determinar el efecto de los factores y de sus interacciones en las
respuestas, o sea, las condiciones necesarias para extraer
y para hidrolizar el almidn.
Extraccin del almidn. Todas las muestras que se usan se toman del mismo lote de
produccin; se usa almidn de Harina de arroz y se mezcla con agua para solubilizar
la protena. Se agit a 100 rpm en vasos de 1L; una centrfuga manual separ dos
fases y el almidn obtenido se deposit en bandejas. El almidn aislado se lava con
agua hasta pH ligeramente neutro (solucin inicial bsica); se filtr y se seca (70C,
3h). La protena residual se analiz por el mtodo de Kjeldahl.
Hidrlisis enzimtica. Se hidroliza el almidn obtenido en planta con tres enzimas
(BAN 480L, Termamyl 120L y AMG 300L; Novo Enzymes, DK), en el laboratorio y la
planta. Usando el mismo diseo experimental, se hidroliza una mezcla de almidn y
agua con enzimas hasta obtener el DE propuesto. Se evit la adhesin de la mezcla a
los tubos por su gelatinizacin. Las enzimas se inactivaron con HCl 0.1N a pH 3 por 5
min a 110C. Se determinaron los azcares reductores por el mtodo de Fehling como
ndice de DE hasta hallar las condiciones ptimas para cada enzima.
Cintica qumica. La enzima BAN (seleccionada para la hidrlisis, se monitorea a 70,
80, 90C con tiempos de reaccin de 0 a 2 h. Se muestrea el hidrolizado cada 15 min
a cada temperatura, usando el valor de DE.
Almidn + Enzima BAN

Malto dextrina

Caracterizacin del producto. Las malto dextrinas obtenidas en la planta piloto se

analizaron por HPLC segn un procedimiento establecido para determinar su grado de
depolimerizacin (DP). Tambin, se toman microfotografas con un microscopio de
barrido electrnico (SEM) (JEOL 840 GLS) a diferentes aumentos (nx), recubriendo
las muestras con una capa de oro-paladio de 25 nm y examinndolas.
9- Con base en la bibliografa, proponga un procedimiento para realizar la
hidrlisis cida del almidn y poder comparar as las ventajas de la hidrlisis
enzimtica. El grupo de laboratorio puede concertar con el profesor y
previamente a la realizacin de la prctica, la realizacin de la hidrlisis de
almidn mediante cidos.

Hidrlisis Acida
Agregar 20 ml de almidn al 2% en una fiola, luego agregar 1ml de HCl,
mezclar,
llevar a un bao de Maria hirviendo (100C), anotar el tiempo de inicio de la hidrlisis,
luego cada 5 minutos hacer una reaccin con lugol en una placa de porcelana. Hacer la
reaccin hasta que ya no haya el color negruzco sino que adquiera el color del lugol que
es como caf. Anotar el tiempo de la hidrlisis cida y la fiola siempre debe estar en el
bao.
La hidrlisis cida por accin del HCl a 100C produce una hidrlisis totaldel almidn y
forma glucosa, maltosa, e isomaltosa. La hidrlisis enzimtica por accin de la enzima alfa
amilasa produce unahidrlisis parcial produciendo maltosa, glucosa y dextrina lmite que
es unacadena ramificada y para poder romperla se necesita de -1-6 glucosidasa.
La gran ventaja es que las enzimas son cadenas de protenas y su proveniencia es
biolgica, por su especificidad no hay riesgo de que se formen compuestos no deseados,
con los cidos nos vemos obligados a obtener los azcares, pero a realizar procesos
posteriores de purificacin.

10- Proponga en forma concreta diferentes variaciones al procedimiento descrito

en esta prctica de tal forma que se consideren los diferentes factores que
influyen sobre la actividad enzimtica: pH, temperatura, tiempo de reaccin,
concentracin de sustrato, tipo de almidn, dosificacin de enzima, adicin o
no de cofactores, etc.
El procedimiento puede variar de acuerdo a la influencia que tienen factores como el pH,
la temperatura, la concentracin de sustrato, el tipo de almidn, la dosificacin de enzima
y la adicin de cofactores, es decir: el pH en la actividad enzimtica puede cargar los
restos de aminocidos, cambiando la conformacin de la enzima, pero hay un pH ptimo,
en el cual la actividad cataltica es la ms efectiva; la temperatura acelera la velocidad de
reaccin, pero hay que tener cuidado de no exceder la temperatura sobre 55oC, porque la
enzima al ser una protena se puede desnaturalizar, creando daos en sus sitios
catalticos; la concentracin de sustrato mientras mayor sea, mayor es la velocidad que
alcanza la enzima, despus de alcanzada esa velocidad mxima, un aumento en la
concentracin de sustrato no tiene efecto en la velocidad de la reaccin; la dosificacin
debe hacerse de acuerdo a los niveles de sustrato para que el rendimiento sea ptimo, y
los cofactores son necesarios para que la enzima acte adecuadamente en los sitios
activos.

BIBLIOGRAFA

Anlisis de la viscosidad de la glucosa cubana- autor: Armando DiazGarcia;

tcnica experimental para hallar el equivalente dextrosa (ED), pagina 5; internet:
http://revistas.mes.edu.cu/greenstone/collect/repo/import/repo/20100120/00418420
232012.pdf

Modelado del proceso de hidrlisis enzimtica de almidones gelatinizados del fruto

de la planta de banano; autor: Kevin Alonso Cruz Ruiz; internet:
http://www.bdigital.unal.edu.co/7435/1/73007073.2012.pdf

GARCIA, QUINTERO y LPEZ, 1998. Biotecnologa Alimentaria. Editorial Limusa.

WISEMAN, A. 1991. Manual de Biotecnologa de las enzimas. Editorial Acribia.

GACESA, P y AUBBLE. 1990. Tecnologa de las enzimas. Editorial Acribia.

LPEZ, A., GARCA GARIBAY, M., QUINTERO, R., CANALES, M., 2002.
Biotecnologa
Alimentaria.
Pginas
105

110.
Disponible
en
http://books.google.com.co/books?id=2ctdvBnTa18C&pg=PA577&dq=enzimas+en
+la+industria#v=onepage&q=enzimas%20en%20la%20industria&f=false