Laboratorio de Integracin Bsico.

Mdulo de Biologa Celular

Prctica No. 12
ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE: ENSAYO DEL RADICAL DPPH
Objetivo:
El alumno utilizar la tcnica del radical DPPH como una herramienta para la
evaluacin de la actividad antioxidante en diversas bebidas naturales y
comerciales.
Introduccin
Durante el metabolismo oxidativo normal de las clulas se producen
constantemente una variedad de radicales libres como: radical superxido (O2), el
perxido de hidrgeno (H2O2), el radical xido ntrico (NO) y el oxgeno singulete
(1O2), capaces de producir dao celular y en algunos casos muerte celular.
Nuestro organismo cuenta con diversos mecanismos que permiten la eliminacin
de estos radicales libres incluyendo mecanismos catalticos como: La enzima
superxido dismutasa la cual remueve el (O 2), convirtindolo en H2O2 que
posteriormente es transformado por la catalasa y glutation peroxidasa en H 2O.
Adicionalmente nuestro organismo es capz de eliminar radicales libres mediante
la reaccin con molculas de manera no cataltica como: Vitamina A, C y
Tocoferoles. Muchas frutas y verduras contienen compuestos con actividad
antioxidante capaces de reducir los radicales libres generados durante el estrs
oxidativo. Muchos estudios han mostrado que la capacidad antioxidante de frutas
y verduras est relacionada a su contenido de polifenoles, carotenoides, vitaminas
y minerales.
Existen diferentes mtodos in vitro que son utilizados para evaluar la
actividad antioxidante, con la ventaja de que son rpidos, sencillos y no requieren
de equipo especializado. Entre estos se pueden citar: FRAP, Radical DPPH,
ABTS, entre otros. El mtodo del DPPH, se basa en la reduccin del radical 2,2difenil,1-picrilhidrazil (DPPH) por accin de alguna sustancia antioxidante como
vitamina C, vitamina E, vitamina A, entre otros. La reduccin del DPPH se mide a
517 nm por la disminucin del color violeta del radical, cuando este se pone en
contacto con la sustancia antioxidante. Los resultados se expresan como
porcentaje de actividad antioxidante de la sustancia tomando como base (100%) la
densidad ptica del reactivo de DPPH solo.
Reactivos
Solucin de DPPH 300 M
DPPH3 mg

Etanol absoluto.. 25 mL
Disolver el DPPH y aforar a 25 mL de etanol. Guardar en frasco color ambar,, El
reactivo se prepara en el momento de su uso
Estndar de vitamina C 70 M
Vitamina C 0.123 mg
Etanol absoluto 10 mL
Mtodo
1. Etiquetar un tubo como Estandar (E)
2. Etiquetar un tubo para solucin control de vitamina C( C)
3. Etiquetar un tubo para solucin problema (jugo frutal de su eleccin)
4. Adicionar 500 L de reactivo DPPH a cada tubo
5. Adicionar 500 L de etanol al Estandard
6. Adicionar 500 L de solucin de vitamina C al tubo control
7. Adicionar 500 L de solucin problema previamente diluda en etanol
absoluto 1:10
8. Mezclar, dejar reposar por 30 minutos en la oscuridad y a temperatura
ambiente
9. Leer la D.O. a 517 nm contra blanco (etanol)
10. En caso necesario preparar un blanco de muestra para cada dilucin de
jugo a analizar

Calculos:
% de inhibicin = D.O. muestra problema X 100
D.O. Estndar

Actividad antioxidante = 100

- % inhibicin

NOTA: En caso de que requiera utilizar el blanco de muestra se deber

restar a la D.O de la muestra problema
Resultados:
% de inhibicin = 0.568

X 100 = 47.05%

1.207

Actividad antioxidante = 100

- 47.05% = 52.95

Conclusiones:
En esta prctica aprend a utilizar la tcnica del radical DPPH como una
herramienta para la evaluacin de la actividad antioxidante en diversas bebidas
naturales y comerciales. En nuestro caso utilizamos un jugo de tomate y
evaluamos su actividad antioxidante, dndonos un valor de 52.95% que nos
parece que es una buena actividad antioxidante, lo que nos dice que el tomate es
un vegetal, que tiene una alta actividad antioxidante, el procedimiento de la
prctica se llevo de manera adecuada y los objetivos propuestos se cumplieron.

Actividades:
1. En base a los resultados obtenidos, compare la activadad antioxidante
con los reportados en la literatura (correspondientes al mismo tipo de
muestra analizada
El valor de la actividad antioxidante del tomate registrado es 59.00 % y el
resultado que obtuvimos en la prctica fue de 52.95%

2. Investigue la actividad antioxidante de cinco productos de jugos de

frutas y cinco de verduras. Ordenandolos de mayor a menos actividad.
Alimentos
Frutas:
Guayaba
Manzana
Papaya
Naranja
Pltano

Vegetales:
Calabacita cocida
Betabel crudo (Remolacha
cruda)
Aguacate
Berro
Chile

Capacidad antioxidante
total1(TAS)

Valores publicados2

28,5 (0,25)
27,1 (0,32)
25,1 (0,21)
20,1 ( 0,25)
8,2 (0,13)

30,25
23,7
29,05
12,72

30,07( 0,24)
24,92 ( 0,16 )

5,05
-

22,40 ( 0,23 )
21,42 ( 0,26 )
19,15 (0,18 )

14,47
14,70
-

3. Investigue el fundamento y el mtodo de FRAP y cuantificacin de

polifenoles.
El anlisis de FRAP es para medir la actividad antioxidante total y se basa
en la capacidad de los polifenoles para reducir Fe3+ a Fe2+. Este mtodo
fue modificado recientemente para su uso en microplacas de 96-pozos
(Tsao y Deng, 2004), dando una reproducibilidad mejor y un rendimiento de
procesamiento ms alto de muestras. El anlisis se basa en el poder
reductor de un antioxidante que reduce el ion frrico (Fe3+) al ion ferroso
(Fe2+); formando un complejo azul. Una absorcin alta a una longitud de
onda de 700

Los compuestos fenlicos pueden actuar, como donantes de hidrgeno o

electrones a las reacciones de terminacin, que rompen el ciclo de
generacin de nuevos radicales libres, anticipando las reacciones de
terminacin actuando como un antirradicalarios
Los fenoles reaccionan con el reactivo de Folin-Ciocalteau dando un color
azul propio de la reaccin con fenoles. El reactivo de Folin-Ciocalteau se
obtiene ya preparado de casas comerciales. Este reactivo contiene una
mezcla de wolframato sdico y molibdato sdico en cido fosfrico y

reacciona con restos fenlicos presentes en las protenas (tirosinas) y en

compuestos como cido glico y sus derivados.

4. Investigue las ventajas y desventajas entre el mtodo de FRAP y

DPPH
Ambos presentan una excelente estabilidad en ciertas condiciones,
aunque tambin muestran diferencias. El DPPH es un radical libre que
puede obtenerse directamente sin una preparacin previa, mientras que
el ABTS tiene que ser generado tras una reaccin que puede ser qumica
(dixido de manganeso, persulfato potasio, ABAP) Con el ABTS se
puede medir la actividad de compuestos de naturaleza hidroflica y
lipoflica, mientras que el DPPH solo puede disolverse en medio orgnico

El ensayo FRAP es sencillo y fcilmente automatizable. Es rpido,

generalmente la reaccin se completa entre 4 y 8 minutos. Sin embargo,
en el caso de algunos polifenoles se han descrito reacciones ms lentas,
llegando incluso a requerir 30 minutos hasta completar la reduccin del
complejo.
BIBLIOGRAFIA:

http://www.um.es/lafem/Actividades/OtrasActividades/CursoAntioxida
ntes/MaterialAuxiliar/2012-02-28
CapacidadAntioxidanteAlimentos.pdfh

UNIVERSIDAD DE SONORA

QUIMICO BIOLOGO CLINICO

MATERIA:
LAB. DE BIOLOGIA CELULAR
PRACTICA #8
ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE: ENSAYO DEL RADICAL DPPH

MAESTRA:
VALDEZ ORTEGA MARTHA JUDITH
ALUMNO:
MANUEL EVERARDO REYNA MURRIETA

HERMOSILLO, SONORA

28/NOV/2014