espectrofotometra UV

Anlisis cualitativo por

Espectrofotometra UV de frmacos
de abuso en plasma.
Cepeda, A.; Paseiro, P. y Simal, J.

Palabras clave: Sep Pak C18, espectroscopa UV, barbitricos, cido saliclico, cafena, teofilina.
Se propone un mtodo rpido y sencillo para la determinacin cualitativa en plasma de barbitricos
(amobarbital, aprobarbital, barbital, butabarbital, butalbital, dial, fenobarbital, pentobarbital y secobarbital), cido saliclico, cafena y teofilina, basado en un proceso de purificacin de la muestra mediante la utilizacin de las minocolumnas Sep PakR C18 y el examen del residuo al UV.
A quick and simple method is proposed for the qualitative determination of sorne Barbiturates in plas-
ma (Aprobarbitone, Amylobarbitone, Barbitone, Dial, Pentobarbitone, Phenobarbitone, Qinalbarbitone, Secbutotabarbitone and Talbutal), Salicylic acid, Cafeine and Theophylline. This method is based
on the purification process of the example by the use of the cartridge Sep Pak C18 and the examination of the purified at the spectroscopy UV.

Introduccin
El incesante incremento del uso de medicamentos ha hecho que a parte de los beneficios obtenidos por su utilizacin se produzcan envenenamientos e intoxicaciones, siendo los barbitricos los frmacos ms frecuentemente implicados en sobredosis agudas tal y como lo demuestran Frati y colabs.
(1983) en un estudio en Espaa durante los aos

Departamento de Qumica Analitica, Nutricin y

Bromatologa.
Universidad de Santiago de Compostela.

38

1974-1980. Otros frmacos, como los salicilatos, han

sido causantes de intoxicaciones accidentales principalmente en nios menores de 5 aos (Levine,
1982).
La necesidad de procedimientos analticos rpidos para la identificacin de frmacos a niveles
txicos ha hecho que se apliquen numerosas tcnicas analticas en el campo de la Toxicologa Forense, entre ellas, la espectrofotometra UV, descrita ampliamente en la bibliografa. Clarke (1969); Corner
(Fiorey, 1972); Jain y Cravey (1974) la aplican para
determinar barbitricos en materiales biolgicos mediante el desplazamiento del mximo de absorcin
a diferentes valores de pH . Gupta y Lundberg (1973)
determinan teofilina en sangre en presencia y ausen-

tcnicas de LABORATORIO no 141

espectrofotometra UV

ca de. barbitricos. Routh (Sunshine, 1983) analiza

cafena en suero midiendo la absorbancia a 273 nm.
As mismo, los procesos de purificacin del plasma son muy variados, White y Graves (1974) extraen
con cloroformo y reextraen con hidrxido sdico para
separar frmacos ci9os y neutros. Otros autores utilizan columnas de purificacin basadas en principios
cromatogrficos como son las resinas XAD-2 (Eiahi, 1980); columnas Extrelut (Breiter y colabs, 1976)
y las ms recientes como son las minicolumnas de
fase reversa Sep Pak C18 (AIIan y colabs, 1980).
Para la realizacin de este trabajo hemos combinado la purificacin de la muestra con minicolumnas Sep Pak C18 y la determinacin cualitativa en
plasma de varios frmacos de abuso mediante espectrofotometra UV.

0,7

Parte experimental
Material y aparatos

Minicolumnas de fase reversa Sep Pak C18.

(Watters, art. 51910)
- Jeringa de vidrio de capacidad 5 mi con aguja hipodrmica de 8.5 cm de longitud y 0,5 mm de dimetro interno.
-Centrfuga que alcance 4000 rpm.
- Bao Mara.
-Tubos de centrfugas de fondo conico graduados
de 10 mi.
- Bomba de vaco.
-Balanza analtica que aprecie hasta 0,1 mg.
-Indicador de pH universal Merck art. 9535.
- Espectrofotmetro UV Hitachi modelo 100-60 y registrador Hitachi de doble canal modelo 561 .
-Cubetas apareadas de cuarzo de 1 cm. de
espesor.
- Material de uso comn en el laboratorio.
Reactivos

Los reactivos utilizados son de calidad analtica

y todos los frmacos empleados cumplen las normas USP XIX/BP proporcionados por Analar (cido
saliclico); Serva (teofilina); Merck (cafena); Sandoz
(butalbital); Barcia (barbital, aprobarbital, butabarbital, secobarbital, pentobarbital, dial, amobarbital,
fenobarbital).
- Soluciones patrn concentradas de cada frmaco en hidrxido sdico 0,1N.- Se preparan de
manera que cada mi contenga el nivel txico del
frmaco correspondiente para 2,5 mi de plasma

tcnicas de LABORATORIO n 141

190 220 250 280 310 340

nm
Figura 1. Espectro de absorcin al UV de un "blanco de
plasma.

39

l
r
1

espectrofotometra UV

0,,1

0,7

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0,6

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1
1

1
1

0,1

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190 220 250 2 80 310 340

nm

190 220 250 280 310 34 0

nm

Figura 2. Espectro de absorcin al UV del grupo de Jos barbitricos obtenido de muestras de plasma sobrecargadas con 125 p.g comparado con su espectro patrn para cada componente.
:

40

tcnicas de LABORATORIO n 141

espectrofotometra UV

('

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A270

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1
1

- p H = 10

- p H = 10

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0,6

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1
1

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1
1
1

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190 220 250 2 8 0 310 340

nm

l~~
1

190 220 250 280 310 340

nm

Figura 3. Espectro de absorcin al UV de una muestra de plasma sobrecargada con 37,5 p.g de cafena comparado
con su espectro patrn.

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41

espectrofotometra UV

0,7

0,7

1
1
1
1

1
1
1

1
1

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0,6

0,6

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1
1

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1
1

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1
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1

1
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1
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1
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1
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1
1

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1
l
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1
1

'l

1
1
1

o, 1

l
190 220 250 280 310 340
nm

190 220 250 280 310 340

nm

Figura 4. Espectro de absorcin al UV de una muestra de plasma sobrecargada con 50 pg de teofilina comparado
con su espectro patrn.

(Stead y Moffat, 1983).

barbitricos .................................. 125 .g/ml
cafena . .... . .... .... ...... ...... . ..... ...... .. .. 37,5 .g/mi
saliclico, cido .... ...... ..... ............. 500 .g/mi
50 .g/mi
teofilina ... .. ..................... ...... ..... ...
- Soluciones patrn de trabajo de cada frmaco.Se preparan por dilucin 1 a 10 de las anteriores

42

y ajustadas a pH 10.
-Metano!
-Etanol
-Hidrxido sdico 0,1N y 0,01N.
- Plasma humano fresco congelado de donante
nico proporcionado por el Hospital General de:
Galicia. El plasma se descongela en bao de

tcnicas de LABORATORIO n 141

1
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1
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0.7

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patrn

0,4

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l
1
1

0,3

0,2

0,2

o' 1

o, 1

190 220 250 280 310 340

190 220 250 280 310 340

nm

nm

Figura 5. Espectro de absorcin al UV de una muestra de plasma sobrecargada con 500 pg de cido saliclico comparado con su espectro patrn.

agua a 30 C.
Preparacin de las muestras de plasma tipo.Para cada frmaco se aade 1 mi de solucin patrn concentrada a 2,5 mi de plasma y se diluye
hasta 5 mi con agua destilada.

Procedimiento

Con la muestra de plasma.

-Acondicionamiento de las minicolumnas de fase reserva Sep Pak C18:
Se pasa a travs de la minicolumna 5 mi de metano! seguidos de 5 mi de agua destilada y 5 mi de

tcnicas de LABORATORIO - n 141

agua acidulada a pH 3 con cido clorhdrico.

-Purificacin con las minicolumnas Sep Pak
C18.
La solucin de plasma se acidifica con 4-5 gotas de cido clorhdrico 1N hasta pH aproximadamente de 3, se centrifuga a 4000 rpm durante 5 min ,
se recoge el sobrenadante con la jeringa, se lava el
tubo con 5 mi de agua acidulada a pH 3. La muestra y las aguas de lavado se pasan a travs de la
minicolumna Sep Pak C18 a razn de 2 ml/min. Al
objeto de eliminar el agua contenida en el volumen
muerto de la minicolumna se realiza una pequea
succin a vaco. Posteriormente se eluye con 2 mi

43

espectrofotometra UV

de etanol y la solucin alcohlica se evapora a sequedad en un Bao Mara. El residuo obtenido se

disuelve en 0,1 mi de hidrxido sdico 0,01N y se diluye a 10 mi ajustando el valor de pH a 10.
-Obtencin de los espectros.
Con la solucin anterior se consiguen los espectros a pH 10 y a pH 1 (acidificando con cido clorhdrico 1N) entre 340 y 190 nm.
Con los patrones.
Se obtienen directamente los espectros a pH 10
y pH 1 con las soluciones patrn de trabajo.
Por ltimo se comparan los espectros obtenidos
para la muestra con los patrones respectivos.

mas que la utilizacin de las minicolumnas Sep Pak

C18 dan lugar a una purificacin satisfactoria de las
muestras de plasma, lo que permite detectar de una
manera rpida y sencilla los componentes estudiados.
Agradecimientos

Nuestro reconocimiento al Hospital General de

Galicia por habernos facilitado de forma gratuita el
plasma para realizar las muestras; as mismo, agradecemos a la firma comercial Sandoz por suministrarnos tambin de forma gratuita el frmaco butalbital.

Resultados
Las Figuras -1 a 5- representan los espectros
de absorcin al UV obtenidos a pH=10 (lnea continua) y pH=1 (lnea punteada).
En la Figura -1- se recogen los correspondientes a un blanco de plasma ... En las Figuras restantes se recogen los espectros obtenidos de las soluciones patrn diluidas de cada uno de los frmacos
estudiados as como los espectros de absorcin a
que han dado lugar las muestras de plasma tipo.

Discusin
El ccblanco de plasma" da lugar a una interferencia plasmtica con un mximo de absorcin a 273
nm que no depende del pH del medio.
En los barbitricos, se observa que en los patrones desaparecen el mximo de absorcin al cambiar la solucin de pH 10 a pH 1, este mismo efecto
se produce en las muestras de plasma tipo.
La cafena y teofilina presentan mximos de absorcin en la zona en la que absorbe la interferencia plasmtica. Se puede detectar la presencia de
estas sustancias (a sus niveles txicos) por el incremento cuantitativo que se produce en los valores de
absorbancia con relacin al ccblanco de plasma...
Adems en el caso de la teofilina se produce un desplazamiento del mximo de absorcin de 274 nm (pH
10) a 270 nm (pH 1).
El cido saliclico da un mximo de absorcin
a 300 nm a pH 10 y pH 1, lo que hace posible su
deteccin, sin embargo no se ha observado el mximo de absorcin a 235 nm a pH cido como aparece en el patrn, debido a la presencia de fondo
interferente plasmtico.
A la vista de los resultados obtenidos, conclu-

44

Bibliografa
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