Cultivos Microbiologicos Referencia

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Cultivos microbiolgicos de
referencia
Autor: Rafael Amadeo Mateo Capilla
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Presentacin del curso

Curso destinado sobre todo a profesionales del campo de la microbiologa y
aquellos que por formacin puedan interesarle lo relacionado con los cultivos de
referencia.
Se recoge de modo simple en este curso los requisitos y procedimientos a tener
en cuenta, de acuerdo a las normas establecidas para los laboratorios
microbiolgicos y cultivos de referencia.
1. Cultivos de referencia
(Ref. Norma ISO 17025)
Los cultivos de referencia
Es el conjunto constituido por cepas de referencia, cepas de reserva y cepas de trabajo.
Un laboratorio de microbiologa cuenta con cultivos de referencia, a fin de acreditar o conservar la
acreditacin de un ensayo. As, el nmero, la eleccin del gnero y su especie son dependientes
de los ensayos que se elaboran y de las necesidades que asumen estos.
La necesidad de los cultivos de referencia:
La necesidad de los cultivos de referencia parte de demostrar una "trazabilidad". Para que ello se
lleve a cabo, se disea y se sigue un protocolo documental a fin de que se mantenga un buen uso
y manejo de dichos cultivos.
Los procedimientos que han de observarse de forma estricta son:
La evaluacin de la calidad de los medios de cultivo.
La prctica de controles de calidad interno durante la ejecucin de los ensayos.
La realizacin de controles de calidad de reactivos.
Pruebas confirmatorias, tales como la "prueba de CAMP"
La validacin de
mtodos.
Requisitos de los cultivos de referencia
Para que se cumpla un cultivo de referencia debe darse una serie de requisitos. Estos son:
Clulas microbianas capaces de crecer; dndose una viabilidad.
Cepas de referencia. Las colecciones aprovisionarn las cepas con instrucciones para su
recuperacin.
Debe tratarse de un cultivo puro. Ha de observarse la pureza de la misma.
La estabilidad gentica. Es requisito fundamenta el que se de la estabilidad y el

mantenimiento de caractersticas genotpicas y fenotpicas.
En todos los casos la manipulaci ny modo de conservacinde las cepas debe tener
especial prevencin sobre:
El deterioro de las cepas.
La contaminacin cruzada.
Mutaciones, deterioro o alteracin de las caractersticas tpicas de las cepas.
Asimismo, su crecimiento caracterstico debe ser documentado en lo que respecta a cada medio
sobre el que se manipula como cepa control.
El material de referencia
Se denomina material de referencia al material o sustancia que ostenta valores de una o ms
propiedades suficientemente homogneas y bien conocidas que permite su uso en la calibracin
de aparatos, la evaluacin de un mtodo de medicin o la atribucin de valores a estos materiales.
Las cepas de referencia
A fin de demostrar la trazabilidad, las cepas de referencia deben obtenerse directamente de una
coleccin con la resea nacional o internacional de cultivo de referencia reconocido.

coleccin con la resea nacional o internacional de cultivo de referencia reconocido.
Segn la "ISO 11133-1:2000", son:
microorganismos definidos, por lo menos a nivel de gnero y especie
catalogados
muy caracterizados
de origen conocido
Dichas cepas son distribuidas y presentadas comercialmente liofilizadas; asimismo, los orga
nismos de acreditacin son los encargados de considerar vlida la fuente de procedencia de la
cepa a fin de que se cumpla con el requisito de prevenir mutaciones, deterioro o alteracin de las
caractersticas tpicas de las cepas.
El nmero de repiques a partir de la cepa de referencia a de ser limitado, aceptndose hasta
cinco repiques como mximo a partir de dicha cepa de referencia.
Asimismo, toda cepa adquirida por una va que no sea la propia coleccin, no podr mencionarse
utilizando el nmero que tienen en esa coleccin, sino nicamente como derivada de la cepa de
coleccin.
Adquisicin de las cepas de referencia
La adquisicin de las cepas de referencia pueden provenir de:
Obtencin directa a partir de una coleccin nacional e internacional reconocida.
Proveedores comerciales certificados por ISO que 9001. Comercializan repiques de cepas
de referencia adquiridas en una coleccin reconocida. Generalmente el 3er o 4 repique.
En dicha adquisicin se debe mantener sus recipientes originales; siendo de obligado
requerimiento en la recepcin o compra de insumo, el certificado de origen, donde conste el
nmero de repique y el origen entre otros.
Proveedores de cepas de referencia
1. Opcin:
ATCC (American Type Culture Collection).
SVM (Foundation for the Advancement of Public and Environmental Protection)
CECT (Coleccin espaola de cultivos tipos).
CNCM. (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes) Institut Pasteur
Etc.
2. Opcin:
Los proveedores acreditados por ISO 9001 que llevan a cabo repiques a partir cepas adquiridas en
la coleccin reconocida.
Oxoid Companie.
2. Cepas de coleccin de referencia

Material de referencia certificado.
Material o sustancia acompaado de un certificado, que posee valores de una o
ms propiedades, certificados por un procedimiento que establece su
trazabibilidad a una realizacin exacta de la unidad en la cual se expresan los
valores de dichas propiedades, para el cual cada valor certificado est
acompaado por su incertidumbre, con un nivel de confianza establecido.
Cepas de referencia certificadas:
La cepas de referencia certificadas es un material de referencia certificado
biolgico.
La coleccin certifica que se suministra una determinada cepa, que es un cultivo
puro, y que se han observado las convenientes pruebas morfolgicas,
bioqumicas y moleculares acomodadas.
Asimismo, al tratarse de un material biolgico puede darse dificultades de
certificacin.
Reconstitucin de las cepas de referencia
Las Cepas de referencia adquiridas por el laboratorio de microbiologa son

registradas en planilla como marca el procedimiento.
Las Cepas de referencia son almacenadas entre 0-5 C hasta su uso.
En la reconstitucin y siembra de la Cepas de referencia, se utiliza el

medio de cultivo, las condiciones de incubacin y el procedimiento indicado en
las disposiciones para cada tipo de microorganismo del organismo proveedor de
las cepas.
Las Cepas de referencia sern sometidas a un control de calidad de

pureza y viabilidad, as se le dar registro.
Registro de cepas de referencia
Identificacin de la cepa.
Gnero y especie del microorganismo
TIPO y N de coleccin.
N de lote.
Fecha de recepcin.
Control de calidad de la cepa de referencia Conforme (SI/NO).
Fecha de caducidad de la cepa.
Personal responsable.
Control de calidad de pureza y viabilidad:


Este control se realiza a diferentes niveles del proceso; asimismo, se desempea
cada vez que se realiza un replique. El objetivo de dicho control es el de
asegurarse que las cepas conservan su viabilidad y sus caracteres bioqumicos.
Frecuencia de realizacin de este control:
Es el laboratorio el que establece en cada caso la frecuencia de

realizacin del control de calidad de pureza y viabilidad para las cepas de reserva
almacenadas.
En caso de no ostentar las caractersticas establecidas se ejecuta la

"acciones correctivas" que se establecen en el procedimiento.
Registro de Control de calidad de pureza y viabilidad de las cepas:
Fecha del control.
Identificacin de la cepa. Gnero y especie del microorganismo. TIPO y

N de coleccin.
Tipo de cepa (Cepa de referencia, reserva o trabajo).
Pruebas a realizar (depende del microorganismo):

1.
Coloracin de Gram
2.
Caractersticas de las colonias en medios selectivos
3.
Pruebas bioqumicas y serolgicas.
3. Cepas de reserva y de trabajo

Las cepas de reserva
Se considera cepas de reserva, aquellas cepas idnticas logradas mediante un
nico subcultivo de una cepa de referencia, o lo que es lo mismo, una serie de
alcuotas de cultivos idnticos elaboradas en el laboratorio por subcultivo de la
cepa de referencia.
Las cepas de reserva son preparadas y conservadas en el laboratorio, dentro del
cual se destina un luga r para su almacenaje, sealando claramente de que se
trata de cepas potencialmente peligrosas y cuya manipulacin queda
exclusivamente restringida al personal autorizado.
Mtodos para la preservacin y mantenimiento de las cepas de reserva
Los mtodos para la preservacin y mantenimiento de cepas de reserva
obtenidas a partir de cepas de referencia son la LIOFILIZACIN y la
CONGELACIN A BAJAS TEMPERATURAS.
Se da el uso de agentes Crioprotectores
La Liofilizacin
Esta se define como el proceso de desecacin desde el estado congelado.
Los Agentes Crioprotectores:
Leche descremada de calidad microbiolgica, con proceso de esterilizacin

por vapor fluente, al 10% o 20% P/V. Asimismo, puede aadirse aditivos tales
como el inositol.
Dicho producto puede conservarse en refrigeracin o a temperatura

ambiente por aos.
Congelacin a baja temperaturas
Agentes Crioprotectores:
1.
Leche descremada de calidad microbiolgica (esterilizacin por vapor
fluente) al 10% o 20% P/V.
2.
Aditivos, del tipo del Inositol.
3.
Glicerol al 10%.
4.
Caldo BHI con glicerol 20%.
a.
b.
Proceso de congelacin:
Equipamiento o insumos para lograr la congelacin
Congelador o cmara o uso de Nitrgeno lquido.
Proceso de congelacin
Temperaturas de congelacin:
La temperatura de congelacin ideal es de -70 o -80 C, e incluso menor

temperatura. En el caso de temperaturas superiores, como los -20 C, se
considera como no ideal aunque podra ser la nica forma posible; no obstante
es preferible -40 C.
Envases:
Los envases utilizados son el criovial o tubo estril.
Conservacin del producto:
Su conservacin puede darse a temperatura congelacin por aos.
Posibles inconveniente:
Los inconvenientes que se puede encontrar en el proceso de congelacin

son entre otros:
1.
problemas y prdida de las cepas,
2.
la falta de suministro de energa,
3.
falta de insumos,
4.
avera del equipamiento.
La preservacin y mantenimiento de cepas de reserva

En la conservacin y modo de mantener los microorganismos vivos, puros y la
cepa microbiana autntica, es primordial tener en cuenta los conocimientos
fundamentales microbiolgicos, suministrar condiciones ajustadas para cada tipo
de microorganismo, as mismo, tener en cuenta que con cada subcultivo, existe
un riesgo de mutacin de la cepa y para ello debe evitarse el crecimiento.
Factores determinantes de la viabilidad de la cepa
Los factores que determinan la viabilidad de las cepas, la cuales estn sometidas
al proceso de congelacin para su reserva, son:
el tipo de cepa, as por ejemplo que la resistencia de las bacterias Gram

positivas es mayor que en el caso de las Gram negativas, y
las ptimas condiciones del cultivo antes de someterse a bajas temperaturas.
Condiciones previas a la exposicin de bajas temperaturas

Las condiciones previas que ha de tenerse en cuenta a la exposicin de bajas
temperaturas de las cepas son:
La edad del cultivo
la capacidad del microorganismo de sobrevivir puede verse afectada por

la edad del cultivo.
Los cultivos muy jvenes o muy viejos muestran menor resistencia al
shock trmico.
-
La edad idnea corresponde con el fin de la etapa logartmica, siendo el

principio de la fase estacionaria la de mayor probabilidad de recuperacin, siendo
el de los microorganismos en general de 24 horas de incubacin a 37 C.
Las condiciones de desarrollo
Estas son consideradas primordiales. As observamos, por ejemplo, como las

levaduras que crecen aireadas y agitadas gozan de una mayor resistencia a la
temperatura que aquellas que desarrolladas en un medio slido.
Igualmente, se deben respetar y observar las instrucciones dadas por los
fabricantes de los sistemas de preservacin de cepas disponibles comercialmente.
Como ejemplo, observamos la supervivencia de los microorganismos
almacenados a -20 C en Mast Cryobank (Ref.: Mast Cryobank TM, ETICOR)
*
Microorganismo..............................................................................
Supervivencia
Enterobacter
aerogenes................................................................................. 48 meses
Pseudomona
aeruginosa............................................................................... 18 meses
Salmonella
typhimurium................................................................................. 48meses
Staphylococcus
aureus...................................................................................48meses
Listeria
monocytogenes....................................................................................48
meses
Listeria
ivanovii................................................................................................48
meses
Rhodococcus
equi..........................................................................................48 meses
Bacillus cere
us................................................................................................24meses
Clostridium
perfringes.....................................................................................48 meses
Procedimientos a seguir en las cepas de reserva
1.
Previo a la inoculacin, se rotulan los tubos o crioviales donde se
almacenan las cepas reserva. En cada criovial queda la siguiente informacin:
Identificacin de la cepa
Tipo y N de coleccin
N de repique
Fecha de realizacin del C. res. (cepa de reserva)
Fecha de vencimiento del criovial
N de tubo o criovial
2.
El desarrollo microbiano logrado, se inocula aspticamente en el medio
lquido sobrenadante que contienen los crioviales.
3.
Congelar o liofilizar la cepas de reserva.
4.
Manipulacin de la cepa de reserva a fin de obtener cepas de trabajo. En
el caso de las cepas congeladas de crioviales, se debe realizar este paso para
prevenir el descongelamiento y la contaminacin del criovial a travs del traslado
en su propia caja termostatizada y que repique en campana de flujo laminar.
Asimismo, ha de observarse que
En el caso de descongelamiento de las cepas de reserva, no se deben

volver a congelarse.
El criovial vencido es eliminado del cepario y se registra.
Cuando se fracciona alcuotas en leche u otros agentes crioprotectores,

se utilizan, se descongelan y no se volver a congelar ni a usar.
Las cepas liofilizadas una vez reconstituidas no se deben utilizar.
Registro de cepas de reserva
Identificacin de la cepa. Gnero y especie del microorganismo.
TIPO y N de coleccin.
N de Lote Cepa referencia.
N de criovial o vial.
Fecha de reconstitucin de la Cepa referencia.
N de repique.
Frasco en uso.
Fecha de baja criovial.
Ubicacin de almacenamiento.
Observaciones
Las cepas de trabajo

Las cepas de trabajo son los Subcultivos de microorganismos obtenidos a partir
de las cepas de reserva a fin de ser empleados en los ensayos que hagan falta.
Obtencin de cepas de trabajo:
Los cultivos de trabajo se consiguen a partir de la Cepas de reserva sobre

un medio slido o lquido no selectivo adecuado manejando un ansa estril e
incubando en condiciones adecuadas.
Las cepas de trabajo no convienen ser subcultivadas.
10
11
4. Utilizacin general de cepas de referencia y

simopsis de los cultivos de referencia
(SEGUN LA ENAC)
SINOPSIS DE LOS CULTIVOS DE REFERENCIA
El laboratorio de microbiologa contar con cultivos de referencia.
Los cultivos de referencia se manipulan en el laboratorio para:
1.
Evaluar la calidad de los medios de cultivo,
2.
asegurar la calidad de los resultados de ensayo
3.
validar mtodos microbiolgicos.
Se proceder:
a.
al manejo de cultivos de referencia,
b.
al aseguramiento de la trazabilidad y del origen de la cepa,
c.
al conocimiento de las caractersticas de las cepas usadas en los ensayos a
fin de mantener su viabilidad y sus caracteres bioqumicos.
12
13
5. Criterios de validacin y de mantenimiento

del laboratorio microbiolgico
(SEGUN LA ENAC)
Directrices para la calibracin y lo controles de calibracin
La frecuencia con la que se realizan la calibracin y los controles de calibracin
estriba del uso, tipo y resultados precedentes de cada uno de los equipos. As se
sugiere el siguiente cuadro:
14
6. Criterios para la validacin y verificacin de

los equipos
(SEGUN LA ENAC)
Como en el esquema anterior, la frecuencia con la que se realizan los criterios
para la validacin y verificacin de los equipos vienen dados por el uso, tipo y
resultados precedentes de cada uno de los equipos. As se sugiere el siguiente
cuadro:
15
16
7. Criterios para el mantenimiento de los

equipos
(SEGUN LA ENAC)
La frecuencia con la que se realiza el mantenimiento de los equipos estribar de
la necesidad, el tipo y las caractersticas precedentes de cada aparato.
17
8. Glosario de trminos segn la Entidad

Nacional de Acreditacin
A continuacin se recogen tal cual los terminos definidos por la Entidad Nacional
de Acreditacin, a fin de respetar la exactitud en lo que se refiere a terminologa
y definiciones, as como su referencia ISO.
Calibracin
Conjunto de operaciones que permiten establecer, en condiciones especficas, la
relacin existente entre los valores indicados por un instrumento de medida o un
sistema de medida, o los valores representados por una medida material o un
material de referencia, y los valores correspondientes obtenidos mediante un
patrn de referencia.
NOTAS
1 El resultado de una calibracin permite asignar valores de mesurandos a las
marcas de escalas arbitrarias o estimar los errores de indicacin de los
instrumentos de medida.
2 Una calibracin permite tambin determinar otras propiedades metrolgicas,
como el efecto de las magnitudes de influencia.
3 El resultado de una calibracin puede registrarse en un documento, en
ocasiones denominado certificado de calibracin o informe de calibracin.
[VIM: 1993 ISO Vocabulario internacional de trminos bsicos y generales en
metrologa]
Material de referencia certificado
Material de referencia, acompaado de un certificado, en el cual uno o ms
valores de sus propiedades han sido certificados mediante un procedimiento que
establece su trazabilidad a una realizacin exacta de la unidad en la que se
expresan los valores de dichas propiedades. Cada valor certificado se acompaa
de una incertidumbre y el nivel de confianza correspondiente.
[Gua ISO 30:1992]
Lmite de deteccin
Aplicado a anlisis microbiolgicos cualitativos - Nmero mnimo de
microorganismos que pueden ser detectados, pero en cantidades que no pueden
estimarse con precisin.
Desviacin negativa
Ocurre cuando el mtodo alternativo da un resultado negativo sin confirmacin y
el mtodo de referencia da un resultado positivo. Esta desviacin se convierte en
un resultado negativo falso cuando puede demostrarse que el resultado
verdadero es positivo.
Desviacin positiva
Ocurre cuando el mtodo alternativo da un resultado positivo sin confirmacin y
18

el mtodo de referencia da un resultado negativo. Esta desviacin se convierte
en un resultado positivo falso cuando puede demostrarse que el resultado
verdadero es negativo.
Cultivos de referencia
Trmino colectivo que se refiere a cepas de referencia, cepas de reserva y
cultivos de trabajo.
Cepas de referencia
Microorganismos definidos por lo menos al nivel de gnero y especie,
catalogados y descritos segn sus caractersticas y preferiblemente de origen
conocido. [ISO 11133-1:2000] Normalmente obtenidos de una coleccin nacional
o internacional reconocida.
Material de referencia
Material o substancia uno o ms de cuyas propiedades tienen valores
suficientemente homogneos y claramente establecidos como para poder ser
utilizados en la calibracin de un aparato, la evaluacin de un mtodo de medida
o la asignacin de valores a materiales. [Gua ISO 30:1992]
Mtodo de referencia
Mtodo investigado a fondo, que describe con claridad y exactitud las condiciones
y los procedimientos necesarios para medir los valores de una o ms
propiedades y que ha demostrado tener una exactitud y una precisin apropiadas
para el uso que pretende hacerse del mismo, de manera que puede utilizarse
para evaluar la exactitud de otros mtodos empleados para
realizar la misma medicin y, en particular, para caracterizar un material de
referencia. En general se trata de un mtodo normalizado nacional o
internacional.
Cepas de reserva
Cepas idnticas obtenidas mediante un nico subcultivo de una cepa de
referencia. [ISO 11133-1:2000]
Exactitud relativa
Grado de concordancia entre los resultados del mtodo evaluado y los obtenidos
utilizando un mtodo de referencia reconocido.
Repetibilidad
Grado de concordancia entre los resultados de sucesivas mediciones del mismo
mesurando realizadas en las mismas condiciones de medicin. [VIM: 1993 ISO
Vocabulario internacional de trminos bsicos y generales de metrologa]
Reproducibilidad
Grado de concordancia entre los resultados de mediciones del mismo mesurando
realizadas en diferentes condiciones de medicin. [VIM: 1993 ISO Vocabulario
internacional de trminos bsicos y generales de metrologa]
Sensibilidad
19

Fraccin del nmero total de cultivos o colonias positivos que son asignados
correctamente con el mtodo utilizado. [ISO 13843:2000]
Especificidad
Fraccin del nmero total de cultivos o colonias negativos que son asignados
correctamente con el mtodo utilizado. [ISO 13843:2000]
Cultivo de trabajo
Subcultivo primario obtenido de una cepa de reserva. [ISO 11133-1:2000]
Validacin
Confirmacin, mediante la aportacin de pruebas objetivas, de que se han
cumplidos los requisitos para el uso pretendido o una aplicacin especfica. [ISO
9000: 2000]
Verificacin
Confirmacin, mediante la aportacin de pruebas objetivas, de que se han
cumplido los requisitos establecidos. [ISO 9000:2000]
REFERENCIA: "Anexo I al G-ENAC-04 Rev.3 Noviembre de 2002 Glosario
de Trminos"
20

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Clulas microbianas capaces de crecer; dndose una viabilidad.

Debe tratarse de un cultivo puro. Ha de observarse la pureza de la misma.

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El deterioro de las cepas.

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2. Cepas de coleccin de referencia

Las Cepas de referencia adquiridas por el laboratorio de microbiologa son

Las Cepas de referencia son almacenadas entre 0-5 C hasta su uso.

En la reconstitucin y siembra de la Cepas de referencia, se utiliza el

Las Cepas de referencia sern sometidas a un control de calidad de

Gnero y especie del microorganismo

Control de calidad de la cepa de referencia Conforme (SI/NO).

Fecha de caducidad de la cepa.

Control de calidad de pureza y viabilidad:

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Es el laboratorio el que establece en cada caso la frecuencia de

En caso de no ostentar las caractersticas establecidas se ejecuta la

Fecha del control.

Identificacin de la cepa. Gnero y especie del microorganismo. TIPO y

Tipo de cepa (Cepa de referencia, reserva o trabajo).

Pruebas a realizar (depende del microorganismo):

Caractersticas de las colonias en medios selectivos

Pruebas bioqumicas y serolgicas.

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3. Cepas de reserva y de trabajo

Leche descremada de calidad microbiolgica, con proceso de esterilizacin

Dicho producto puede conservarse en refrigeracin o a temperatura

Aditivos, del tipo del Inositol.

Caldo BHI con glicerol 20%.

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La temperatura de congelacin ideal es de -70 o -80 C, e incluso menor

Los envases utilizados son el criovial o tubo estril.

Conservacin del producto:

Su conservacin puede darse a temperatura congelacin por aos.

Los inconvenientes que se puede encontrar en el proceso de congelacin

problemas y prdida de las cepas,

la falta de suministro de energa,

avera del equipamiento.

La preservacin y mantenimiento de cepas de reserva

el tipo de cepa, as por ejemplo que la resistencia de las bacterias Gram

las ptimas condiciones del cultivo antes de someterse a bajas temperaturas.