6

BAB II
PELAKSANAAN PENELITIAN
II.1

Alat dan Bahan yang digunakan

II.1.1

Alat
Alat-alat yang digunakan adalah alat uji difusi, blender, cawan

porselin, gelas arloji, gelas piala, gelas ukur, homogenizer, lemari

pendingin, mikropipet, labu erlenmeyer, labu tentukur, lemari pendingin,
mortir dan stamfer, panci infus, penangas air, pH meter, pipet tetes,
rotavapor, spektrofotometer UV-VIS, termometer, timbangan analitik, dan
viskometer.
II.1.2

Bahan
Bahan-bahan yang digunakan adalah aquadestilata, asam stearat,

asam oleat, -tokoferol, biji kasumba turate (Carthamus tinctorius L.),

membran kulit ular, dapar pH 7,4 , DPPH, DMSO, etanol absolut, ekstrak
biji kasumba turate (Carthamus tinctorius L.), Isopropyl miristat, kertas
Whatman, kertas saring, metil paraben, minyak melati, novomer,phospat
buffer saline (PBS), propilen glikol, propil paraben, setil akohol, dan stearil
alcohol.
II.2
II.2.1

Prosedur Penelitian
Pengambilan Biji Kasumba Turate
Sampel biji kasumba turate (Carthamus tinctorius L.) diambil dari

Desa Waempubbu, Kecamatan Amali, Kabupaten Bone, Sulawesi

Selatan.
II.2.2

Penyiapan Biji Kasumba Turate

Biji kasumba turate yang diperoleh sudah dalam bentuk kering.Biji

ditumbuk atau diblender hingga diperoleh serbuk kasar.

II.2.3

Ekstraksi Biji Kasumba Turate

Sebanyak 50 g biji kasumba turate dimasukkan ke dalam panci

infus, ditambahkan air sebanyak 500 ml. Biji kemudian dipanaskan selama
15 menit terhitung sejak suhu mencapai 90 C sambil sekali-sekali diaduk.
Infus diserkai sewaktu masih panas menggunakan kain flanel.Untuk
mencukupi kekurangan volume, ditambahkan air panas melalui ampasnya
hingga diperoleh volume 500 ml. Ekstrak kemudian diliofilisasi untuk
memperoleh ekstrak kering.
II.2.4

Formulasi Krim
Dibuat formula krim dengan tipe krim M/A yang mengandung

ekstrak biji kasumba turate (Carthamus tinctorius L) sebagai zat aktif

dengan menggunakan variasi 3 enhancer, yakni isopropyl miristat,
dimethyl solfoxide (DMSO), dan asam oleat.

Tabel 1. Rancangan Formula Krim Antioksidan

No.

Nama Bahan

1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.

Formula (g)
A1
3
5
1,5
1
15
0,2
0,02
2
0,05
0,0005
72,23

Ekstrak biji kasumba turate

Asam stearat
Setil akohol
Stearil alcohol
Propilen glikol
Metil paraben
Propil paraben
Novomer
- tokoferol
Minyak wijen
Isopropyl Miristat
11. DMSO
Asam Oleat
12. Aquadest
Keterangan :
A1
: standar
A2
: penetrasi isopropyl miristat
A3
: penetrasi DMSO
A4
: penetrasi asam oleat
II.2.5

A2
3
5
1,5
1
15
0,2
0,02
2
0,05
0,0005
3
69,23

A3
3
5
1,5
1
15
0,2
0,02
2
0,05
0,0005
2
70,23

A4
3
5
1,5
1
15
0,2
0,02
2
0,05
0,0005
2
70,23

Pembuatan Krim
Bahan-bahan ditimbang sesuai rancangan formula pada tabel 1.

Fase minyak dibuat dengan cara melebur stearil alkohol, asam stearat,
setil alkohol, bahan penetrasi dan propil paraben secara berturut-turut
berdasarkan titik lebur bahan dalam cawan porselen di atas penangas air
hingga suhu 70C sambil diaduk hingga homogen. Fase air dibuat dengan
cara memanaskan air hingga 70C, ditambahkan metil paraben sambil
diaduk hingga melarut sempurna. Setelah itu, ditambahkan propilen glikol
kemudian diaduk hingga homogen, lalu

ditimbang emulgator sesuai

formula. Selanjutnya fase minyak dituang ke dalam fase air, diaduk

dengan homogenizer dengan kecepatan 4000 rpm masukkan emulgator

yang akan digunakan dan diaduk lagi hingga homogen. Krim didiamkan
hingga suhu 40-45C kemudian ditambahkan ekstrak biji kasumba turate,
-tokoferol dan pengaroma minyak wijen, diaduk hingga homogen.
II.2.6 Evaluasi Tipe Emulsi
II.2.6.1Metode Pengenceran
Krim yang telah dibuat dimasukkan dalam vial, kemudian
diencerkan dengan ditambahkan air. Jika emulsi dapat diencerkan maka
tipe emulsinya M/A.
II.2.6.2 Metode Dispersi Zat Warna
Krim yang telah dibuat dimasukkan ke dalam gelas piala, kemudian
ditetesi beberapa tetes larutan metilen biru di atasnya. Jika warna biru
segera terdispersi keseluruh emulsi maka tipe emulsinya M/A.
II.2.6.3 Metode Konduktivitas
Sampel krim yang telah dibuat dimasukkan sebanyak 25 ml ke
dalam gelas piala, kemudian dihubungkan dengan rangkaian arus listrik.
Tes ini didasarkan

prinsip bahwa air

menghantarkan aliran listrik

sedangkan minyak tidak. Apabila lampu menyala maka tipe emulsinya

adalah M/A. Jika sistem tidak menghantarkan aliran listrik atau lampu
tidak menyala maka emulsi tersebut bertipe A/M.
II.2.6.4 Kondisi Penyimpanan Dipercepat
Salah satu cara mempercepat evaluasi kestabilan adalah dengan
penyimpanan selama beberapa periode (waktu) pada suhu yang lebih
tinggi dari normal. Cara khusus ini berguna untuk mengevaluasi shelf life

10

emulsi dengan siklus antara 2 suhu, yaitu 5 0C dan 350C dalam 12 jam
digunakan selama 10 siklus.
II.2.7 Evaluasi Kestabilan Fisik Krim
II.2.7.1 Pemeriksaan Organoleptis
Pengamatan organoleptis yang dilakukan terhadap sediaan krim
yang telah dibuat meliputi pengamatan perubahan warna dan bau.
II.2.7.2 Pengukuran Volume Kriming
Krim sebanyak 25 ml dimasukkan ke dalam gelas ukur dan
disimpan secara bergantian pada suhu 5 oC dan 35oC (satu siklus) masingmasing selama 12 jam. Siklus ini diulangi selama sepuluh kali dan
pengamatan

volume

kriming

dilakukan

setelah

tiap

satu

siklus

penyimpanan. Hasil pengamatan volume kriming dihitung dalam %

dengan rumus :
Volume kriming =

Dimana :

Vu
X 100%
Vo

Vu = volume emulsi yang kriming

Vo = volume total krim

II.2.7.3 Pengukuran Viskositas

Pengukuran viskositas dilakukan pada sediaan krim sebelum dan
sesudah diberi stress condition. Krim yang telah dibuat disimpan secara
bergantian pada suhu 5 oC dan 35oC (satu siklus) masing-masing selama
12 jam. Siklus ini diulangi sebanyak sepuluh kali. Pengukuran viskositas

11

dilakukan setelah sepuluh siklus penyimpanan dengan menggunakan

viskometer Brookfield pada 60 rpm dengan menggunakan spindle no.7 .
II.2.7.4 Pengukuran Tetes Terdispersi
Sediaan krim yang telah jadi dimasukkan dalam vial kemudian
dilakukan pengukuran tetes terdispersi sebelum dan setelah kondisi
penyimpanan dipercepat yaitu penyimpanan pada 5oC dan 35oC secara
bergantian

masing-masing

selama

12

jam

sebanyak

10

siklus.

Pengamatan ukuran tetes terdispersi dilakukan dengan menggunakan

mikroskop mikrometer. Caranya dengan menggoreskan cream pada objek
gelas kemudian ditutup dengan dek gelas dan setelah diperoleh
perbesaran dan perbandingan skala mikrometer okuler dan mikrometer
objektif yang sesuai maka diamati rentang ukuran partikel tetes
terdispersi.
II.2.7.5 Inversi Fase
Sediaan krim yang telah jadi diberi perlakuan kondisi penyimpanan
dipercepat yaitu pada penyimpanan 5 oC dan 35oC. Masing-masing selama
12 jam sebanyak 10 siklus kemudian diuji kembali tipe emulsinya dengan
metode pengenceran dan metode dispersi zat warna metilen biru.
II.2.7.6 Pengukuran pH
Pengukuran pH dilakukan dengan menggunakan

pH meter

meliputi : pH basis, pH basis yang telah dicampurkan dengan ekstrak, dan

pH krim setelah dilakukan stress condition.

II.2.8 Uji Difusi dengan Menggunakan Metode Difusi Franz

II.2.8.1 Pembuatan Dapar Fosfat pH 7,4

12

Sebanyak 50 ml larutan Kalium monofosfat 0,2 M dimasukkan

kedalam labu ukur 200 ml, kemudian ditambahkan kira-kira 39,1 ml
larutan NaOH 0,2 M dan dilakukan pengujian pH menggunakan pH meter
hingga pH= 7,4. Selanjutnya ditambahkan air sampai tanda batas,
kemudian labu ukur dikocokdan disimpan dalam wadah tertutup rapat,
dibungkus dengan alumunium foil.
II.2.8.2 Pembuatan Kurva Baku Asam Galat dengan Reagen FolinCiocalteau
Sebanyak 300 l larutan asam galat konsentrasi 10, 15, 20, 25, 30,
35 dan 40 g/ml masing-masing dimasukkan dalam tabung, kemudian
ditambah 1,5 ml reagen Folin Ciocalteau (1:10) dan digojog. Setelah
didiamkan selama 3 menit, masing-masing larutan ditambah 1,2 ml larutan
Na2CO3 7,5% digojog homogen, dan didiamkan pada range operating time
pada suhu kamar. Semua larutan diukur absorbansinya pada panjang
gelombang absorbansi maksimum, kemudian dibuat kurva kalibrasi
hubungan antara konsentrasi asam galat (g/ml) dengan absorbansi.
II.2.8.3 Pembuatan Kurva Kalibrasi Krim Ekstrak Biji Kasumba Turate
Ekstrak biji kasumba turate ditimbang seksama sebanyak 100
mg, dilarutkan dengan dapar fosfat pH 7,4 dalam labu ukur ad 100 ml.
didapatkan larutan dengan konsentrasi 1000 ppm. Dari larutan tersebut
dipepet 10 ml, larutkan dengan dapar fosfat pH 7,4 dalam labu ukur ad
100 ml. didapatkan larutan induk 100 ppm, dipipet dan diencerkan dengan
dapar fosfat pH 7,4 hingga didapat konsentrasi 5, 7, 10, 12, dan 15 ppm.

13

Ukur serapannya pada panjang gelombang () maksimum dengan

spektrofotometer UV-Vis. Panjang gelombang () maksimum ekstrak
bungan kasumba turate dalam dapar fosfat pH 7,4 ditentukan dengan
melakukan scanning pada panjang gelombang antara 200-400 nm.
Kemudian dibuat kurva kalibrasi dan persamaan regresinya.
II.2.8.4 Penyiapan Membran Kulit Ular
Kulit ular bagian dorsal dicuci dengan aquades dan direndam
dengan aquades selama 24 jam. Membran diangkat dan dikeringkan pada
suhu kamar dengan cara diletakkan di atas kertas saring untuk
mempercepat pengeringan. Membran dipotong dengan diameter 2,5 cm
dan direndam dalam larutan dapar fosfat selama 1 jam sebelum
digunakan.
II.2.8.5 Uji daya penetrasi menggunakan sel difusi Franz
Uji permeasi dilakukan dengan menggunakan alat Franz Diffusion
Cell yang terdiri dari sel permeasi, pompa peristaltik, pengaduk, beaker
glass, penangas air, penampung reseptor, temometer dan selang silikon
dengan diameter 4 mm. Formula sediaan uji ditimbang sebanyak 1 g dan
diratakan di atas membran. Suhu sistem dijaga 37 0,5 C dengan cairan
reseptor yang berisi 100 mL dapar fosfat pH 7,4. Pompa peristaltik
menghisap cairan reseptor dari beaker glass kemudian dipompa ke dalam
sel permeasi perkutan sehingga terjadi aliran secara hidrodinamis.
Kemudian cairan dialirkan lagi ke reseptor. Proses dilakukan selama 6
jam. Setiap selang waktu 30 menit, 1 jam, 1 jam 30 menit dan seterusnya

14

dilakukan pengambilan sampel dari cairan reseptor sebanyak 5 mL dan

setiap pengambilan selalu diganti dengan dapar fosfat pH 7,4 sebanyak 5
mL. Konsentrasi senyawa yang memiliki aktivitas antioksidan yang
terdifusi diukur dengan spektrofotometer UV visibel.
II.2.9 Uji Aktivitas Antioksidan dengan Metode Penangkap Radikal
Bebas DPPH
II.2.9.1 Pembuatan Larutan DPPH 0,4 mM
Larutan DPPH 0,4 mM dibuat dengan cara menimbang 0,0079 g
DPPH dan dilarutkan dengan etanol absolut hingga 50 ml dalam labu
tentukur.
II.2.9.2 Penentuan Panjang Gelombang Maksimum (maks) DPPH
Larutan blanko dibuat dengan cara memipet 900 l larutan DPPH
kemudian dicukupkan volumenya hingga 5 ml dengan etanol absolut.
Dibuat

replikasi

blanko

kemudian

diukur

panjang

gelombang

maksimumnya.
II.2.9.3 Pengukuran Aktivitas Blanko
Larutan DPPH 0,4 mM dipipet sebanyak 900 l kemudian
dicukupkan volumenya hingga 5 ml dengan etanol absolut, didiamkan
selama 30 menit, dan diukur serapannya pada panjang gelombang 516
nm.

II.2.9.4 Pengujian Aktivitas Antioksidan

Krim ekstrak biji kasumba turate ditimbang masing-masing

15

sebanyak 10 g dan dilarutkan dengan etanol absolut hingga 100 ml

sehingga diperoleh konsentrasi 100.000 g/ml sebagai larutan stok. Dari
larutan stok krim ekstrak biji kasumba turate dibuat seri konsentrasi
10.000; 15.000; 20.000 g/ml dengan memipet sampel berturut-turut 500;
750; 1000; 1250 l, Kemudian larutan DPPH ditambahkan sebanyak 900
l

dan

dicukupkan

volumenya

hingga

ml

dengan

etanol

absolut.Campuran tersebut dikocok dan didiamkan selama 30 menit pada

suhu kamar dan pada ruangan yang terlindung dari cahaya.Serapannya
diukur pada panjang gelombang 516 nm. Selanjutnya dihitung persentase
penangkapan radikal bebas dan nilai IC 50 (50% Inhibitory Concentration).
II.3

Pengumpulan dan Analisis Data

Data dari hasil penelitian dikumpulkan dan dilakukan analisis data.

II.4

Pembahasan Hasil
Pembahasan dilakukan berdasarkan hasil penelitian

II.5

Pengambilan Kesimpulan
Kesimpulan diambil berdasarkan hasil pembahasan