Contenido

INTRODUCCIN ................................................................................................................................. 1
OBJETIVO ............................................................................................................................................ 2
BIODIVERSIDAD E IMPORTANCIA ECOLOGICA DE LOS MANGLARES ............................................... 3
Mxico un pas megadiverso ........................................................................................................... 3
Mxico y sus manglares .................................................................................................................. 3
Mangle rojo (Rhizophora mangle) .............................................................................................. 4
Mangle blanco (Laguncularia racemosa).................................................................................... 4
Mangle botoncillo (Conocarpus erectus) ................................................................................... 5
Mangle negro (Avicennia germinans)......................................................................................... 5
Importancia ecolgica de los manglares ......................................................................................... 5
Presiones y amenazas a los manglares ........................................................................................... 8
HIDROCARBUROS ............................................................................................................................... 9
Reaccin con el medio ambiente .................................................................................................... 9
Efectos fticos ............................................................................................................................... 10
Efectos txicos............................................................................................................................... 11
Causas a la salud............................................................................................................................ 12
BIORREMEDIACIN .......................................................................................................................... 13
Tipos de biorremediacin ............................................................................................................. 14
Remediacin microbiana............................................................................................................... 15
Fitorremediacion ........................................................................................................................... 17
Tipos de fitorremediacin ........................................................................................................ 20
Uso de organismos modificados genticamente en biorremediacin ......................................... 21
Nuevos desarrollos biotecnolgicos en plantas y bacterias ......................................................... 23
ANALISIS DE CASO ............................................................................................................................ 25
Generalidades del lugar ................................................................................................................ 25
Planteamiento del problema ........................................................................................................ 26
BACTERIAS PSEUDOMONAS EN LA BIORREMEDIACIN DE SUELOS CONTAMINADOS CON
HIDROCARBUROS ............................................................................................................................. 28

Factores abiticos ........................................................................................................................|28

Factores biticos ........................................................................................................................... 29
Rutas metablicas de bacterias Pseudomonas en medios carbonatos ......................................... 31
Ruta metablica de oxidacin terminal de n-alcanos por Pseudomonas ............................. 33
Ruta metablica de oxidacin subterminal de n-alcanos ....................................................... 34
Ruta metablica de degradacin de n-alcanos alquil hidroperoxidasa ................................. 34
Ruta metablica de degradacin de ciclohexano ................................................................... 34
Ruta metablica de degradacin de tolueno por P. putida TOL, P. putida, P. mendocina KR1
y P. pickettii PKO ..................................................................................................................... 35
Crecimiento Microbiano en la Biorremediacin de Suelo Contaminado con Hidrocarburos....... 36
Determinacin de bacterias hidrocarbonoclastas por dilucin en placas .................................... 38
Medio mineral basal. ............................................................................................................... 39
Solucin mineral ....................................................................................................................... 39
Mtodo y equipos .................................................................................................................... 40
Soluciones y reactivos .............................................................................................................. 40
Procedimiento .......................................................................................................................... 41
Preparacin de la muestra ....................................................................................................... 41
Clculos ..................................................................................................................................... 43
Fases del crecimiento microbiano durante la Biorremediacin de Suelo Contaminado con
Hidrocarburos ............................................................................................................................... 43
Control de los factores cinticos durante la Biorremediacin ...................................................... 45
CONCLUSIN .................................................................................................................................... 46
BIBLIOGRAFIA ................................................................................................................................... 47
ANEXOS............................................................................................................................................. 49
Anexo I. Determinacin de la concentracin de hidrocarburos totales del petrleo (HTP) en el
suelo. ............................................................................................................................................. 49
Anexo II. Determinacin de pH por el mtodo de potencimetro. (Bates, 1983). ....................... 55
Anexo III. Determinacin de porcentaje de humedad en suelos. ................................................. 57
Anexo IV. Cuantificacin de Carbono orgnico total. ................................................................... 59
Anexo V. Determinacin de Nitrgeno total con el mtodo Micro- Kjeldahl. (Modificado por
Bremner, 1965). ............................................................................................................................ 62

INTRODUCCIN

El medio ambiente es el conjunto de todas las cosas vivas que nos rodean. De ste
obtenemos agua, comida, combustibles y materias primas que sirven para fabricar
las cosas que utilizamos diariamente. Desde sus orgenes, la accin humana ha
introducido cambios en los procesos ecolgicos, y lo que empez como un conjunto
de pequeas alteraciones puntuales adquiri en los ltimos tiempos una dimensin
altamente preocupante.

El petrleo es la fuente principal de energa de la sociedad actual, este compuesto

y sus productos de refinacin no son sustancias especficas y nicas, puesto que
son mezclas de varios hidrocarburos y otros compuestos cuyas propiedades fsicas
y qumicas son muy variadas, las cuales determinan su comportamiento e impacto
en los elementos ambientales, cuando ocurre una descarga al ambiente. Al suceder
esto es necesario hacer una investigacin y caracterizacin de la contaminacin
para evaluar los daos e implementar una correccin ambiental efectiva (Echarri,
1998).

Segn las estadsticas de la Procuradura Federal de Proteccin al Ambiente

(PROFEPA, 1999), entre los aos de 1997 y 2001, de 2,592 emergencias
ambientales con materiales peligrosos a nivel nacional, Petrleos Mexicanos
provoc 57 % de ellas, la mayora de las emergencias se presentan en ductos,
provocando derrames con sustancias como petrleo crudo, combustleo, diesel,
gasolina, turbosina, gas natural y amoniaco. Los derrames en ductos en el rea de
PEMEX Refinacin se deben en orden de importancia a: toma clandestina, daos o
averas provocadas por terceros, corrosin y fallas del material. En el 60 % de estos
eventos existe afectacin al suelo, en 30 % al agua y en 10 % al aire (CEMDA,
2006). De los 50 mil kilmetros de ductos que existen en el pas, por lo menos 20
mil necesitan de urgente atencin, datos que son confirmados por el Instituto
1

Mexicano del Petrleo (IMP), pues cerca de la mitad de los ductos tienen ms de
30 aos de operacin.

El problema de los suelos contaminados con hidrocarburos radicaba en que no

exista conciencia de las tcnicas y costos de la biorremediacin pero gracias al
desarrollo tecnolgico ahora se cuenta con diversos estudios que han definido estas
metodologas y sus diferentes aplicaciones. En Mxico, se han iniciado algunos
trabajos de caracterizacin de sitios afectados por hidrocarburos, 3 especficamente
en zonas petroleras como Tabasco y Veracruz ((Gutirrez y Zavala, 2002), donde
el suelo es el factor que ms se estudia. Estas prcticas remediativas consisten en
el uso de organismos como plantas, hongos, bacterias naturales o modificadas
genticamente para neutralizar sustancias toxicas, transformndolas en sustancias
menos dainas o bien inocuas para el ambiente y la salud humana.

Este trabajo presenta hablaremos sobre los tipos manglares existentes en el

municipio de Paraso Tabasco, Los tipos de hidrocarburos existentes y las tcnica
de biorremediacin ms eficientes en manglares contaminados con hidrocarburos
y las bacterias Pseudomonas en la biorremediacin de suelos contaminados con
hidrocarburos.

OBJETIVO

Conocer mediante una investigacin las diferentes tcnicas de biorremediacion, as

como las rutas metablicas de las Bacterias Pseudomonas empleadas en sitios
contaminados por hidrocarburos, tomando como caso de estudio la zona costera de
manglares y cocotales de Paraso Tabasco, para proporcionar el conocimiento
necesario en la medicin de la cintica de crecimiento.

BIODIVERSIDAD E IMPORTANCIA ECOLOGICA DE LOS MANGLARES

Mxico un pas megadiverso

Mxico es un pas privilegiado por su biodiversidad y se le ubica en el cuarto lugar
entre los pases megadiversos; junto con Brasil, Colombia e Indonesia ocupa los
primeros lugares en todas las listas de diversidad biolgica que se han elaborado
en el mundo. El concepto de megadiversidad slo se aplica a un nmero muy
pequeo de pases: aquellos que contienen un porcentaje extraordinario de la
biodiversidad del planeta. De todos los pases en el mundo, slo 111 se encuentran
situados, parcial o totalmente, en los trpicos; aproximadamente una docena de
estos pases cuentan con una gran parte entre 60 y 70% de la diversidad biolgica
del planeta y de ellos, Mxico es uno de los ms importantes (Mittermeier y Goettsch
de Mittermeier, 1992). Las caractersticas de Mxico como pas megadiverso
derivan de la ubicacin geogrfica y de la distribucin orogrfica del territorio
nacional, que se extiende dentro de dos de las regiones biogeogrficas reconocidas
en el mundo, la nertica y la neotropical, las cuales se entrelazan en el sur de
Mxico, abrindose una importante zona para la biodiversidad del planeta.

Mxico y sus manglares

Los humedales constituyen uno de los ecosistemas existentes dentro del territorio
nacional y entre ellos los manglares, que son humedales costeros, ocupan un lugar
privilegiado por la riqueza natural que encierran y los servicios ambientales que
prestan; su importante papel ecolgico ha sido reconocido internacionalmente. Los
manglares son formaciones vegetales en las que predominan distintas especies
conocidas como mangle, un rbol o arbusto con ramas descendentes que llegan al
suelo y arraigan en l, y tienen la particularidad de ser plantas resistentes a la
salinidad del agua.

Los manglares se desarrollan en las planicies costeras de los trpicos hmedos

cerca de las desembocaduras de ros y arroyos o alrededor de esteros y lagunas
costeras. Estos ecosistemas sirven de transicin entre los ecosistemas terrestres y
los ecosistemas marinos. A los manglares se les reconoce como uno de los
ecosistemas ms ricos del planeta por su productividad; tienen una gran importancia
econmica y ambiental por el uso que las comunidades rurales les han dado y por
los servicios ambientales que brindan. En Mxico predominan cuatro especies de
mangle: Rhizophora mangle (mangle rojo), Laguncularia racemosa (mangle blanco),
Avicennia germinans (mangle negro, madre de sal) y Conocarpus erectus (mangle
botoncillo). Es comn encontrarlas asociadas, en un proceso sucesorio
dependiendo del nivel de las mareas que las inundan o los baan, pero
estableciendo dominancia de una especie o de una asociacin predominante de dos
o tres especies dependiendo del lugar en donde se hayan asentado.

Mangle rojo (Rhizophora mangle)

El mangle rojo es la especie que generalmente se encuentra en la parte exterior de
las lagunas y en los bordes de los canales. Es un rbol o arbusto de entre 2 a 25
metros de altura, que en algunos casos alcanza los 35 metros. Se caracteriza por
sus races en forma de zancos, races areas, hojas simples y opuestas. Sus flores
son pequeas de color blanco amarillento, y su fruto comienza su desarrollo an
prendido del rbol.

Mangle blanco (Laguncularia racemosa)

El mangle blanco es un rbol de hasta 20metros de alto con corteza fisurada. Sus
hojas son de 4 a 10 cm de largo, con tallos rojizos y dos glndulas colocadas en
ambos lados del tallo. Sus flores son pequeas y numerosas, de color gris
blanquecino. El fruto es pequeo y un poco aplastado. Su sistema de races es poco
profundo, algunas veces sobresalen del suelo y se ubican cerca del tronco.

Mangle botoncillo (Conocarpus erectus)

El mangle botoncillo es un rbol o arbusto con altura entre 5 a 7 metros, de corteza
fisurada. Tiene inflorescencias que se convierten en fruta agregada, redonda y de
color castao. Los frutos tienen forma de glbulo y contienen una gran cantidad de
semillas.

Mangle negro (Avicennia germinans)

El mangle negro se distingue por el desarrollo pronunciado de sus races que
sobresalen del suelo y llegan a alcanzar alturas de 20 cm o ms (pneumatoforos).
Estos rboles alcanzan hasta 20 metros de altura y tienen corteza exterior gris
oscura o negra. Sus hojas son verde amarillento, a menudo con vellos y cristales de
sal en la parte posterior. Las flores son pequeas y blancas, mientras que el fruto
es ovalado, achatado y velloso.

Importancia ecolgica de los manglares

Muchos manglares se desarrollan alrededor de las lagunas costeras, esteros y
desembocadura de ros y arroyos. En estas reas, a nivel mundial, se llevan a cabo
importantes actividades pesqueras artesanales que aportan alimento y desarrollo
econmico a comunidades asentadas en la costa. Asimismo, parte de la actividad
pesquera de las zonas costeras existe en virtud de que distintas especies que se
aprovechan comercialmente tuvieron al manglar como zona de crianza y
crecimiento desde las primeras fases de su ciclo de vida: entre las races de los
manglares se protegen y alimentan larvas, postlarvas y alevines de peces y
crustceos. Algunos moluscos, como el ostin de mangle, utilizan las races de los
manglares para fijarse y desarrollarse hasta alcanzar una talla apta para su
consumo. Los ecosistemas de manglar son altamente productivos y generan una
gran cantidad de nutrientes, los cuales son exportados por las mareas a las aguas
marinas de la franja litoral ms cercana a la costa, donde son aprovechados por
pastos marinos y una variedad de peces que tienen importancia comercial. De
5

acuerdo con la FAO cerca del 80% de la captura mundial de peces marinos se
realiza en la franja costera. Adems, muchas poblaciones de aves acuticas utilizan
los manglares como zonas de reposo o reproduccin. La pesquera del camarn,
una de las ms importantes de Mxico, existe gracias a la gran cantidad de lagunas
costeras que albergan importantes humedales, como reas de manglar y marismas,
en donde se refugian las postlarvas de camarn y se desarrollan durante varios
meses hasta alcanzar sus fases juveniles, momento en el cual migran al mar para
completar su ciclo de vida. Por otra parte, la existencia de los manglares permite
amortiguar los impactos que el acarreo de tierra por las corrientes de agua de ros
y arroyos tiene sobre los arrecifes de coral. Junto con las descargas de aguas
continentales se trasladan tambin diversos tipos de contaminantes generados por
la actividad humana que son recibidos en las zonas de manglar.

Los manglares sirven de filtro biolgico y retienen o procesan algunos

contaminantes: procesan nutrientes en exceso, degradan materia orgnica y
almacenan algunos residuos utilizados en la agricultura.

El exceso de estos

contaminantes generados por el hombre tambin acabar destruyendo a los

manglares. El manglar, como recurso forestal, se ha aprovechado alrededor del
mundo por las comunidades rurales asentadas alrededor de estos ecosistemas para
producir lea y carbn, como material de construccin en viviendas rurales y en la
fabricacin de cercos para la delimitacin de los terrenos o el confinamiento de
animales para el consumo domstico, en la industria de la construccin como
puntales para las cimbras, en la fabricacin de artes de pesca como los tapos, en
la elaboracin de espigas y puntales para la locomocin de pequeas
embarcaciones en zonas someras de las lagunas costeras y los esteros, etc.

Asimismo, alrededor de los manglares se desarrollan actividades cinegticas y una

creciente industria asociada al ecoturismo: el avistamiento de aves migratorias, su
paisaje y la variedad de vida silvestre que albergan, generan corrientes de turistas
6

que son atrados por la riqueza natural de estos singulares ecosistemas. Los
manglares juegan un importante papel como barrera natural de proteccin que
contiene la erosin de vientos y mareas. En aquellos sitios en donde el ecosistema
de manglar se ha mantenido sano, el impacto de ciclones ha sido menor al de
aquellos sitios en donde se destruyeron o no existen estas barreras naturales.
Organismos internacionales como la FAO, el PNUMA y el PNUD reconocen que en
aquellos sitios en donde el manglar mantena su estructura y funcin, el dao
provocado por el tsunami que irrumpi en diciembre de 2005 en costas del Ocano
ndico, fue significativamente menor. Los manglares tambin prestan servicios
ambientales diversos. En condiciones naturales filtran el agua y permiten el
abastecimiento de mantos freticos. Son ecosistemas que capturan gases de efecto
invernadero y actan como sumideros de bixido de carbono. Contribuyen al
mantenimiento de la lnea de costa y al sostenimiento de las arenas sobre las
playas. Se debe reconocer entonces que los manglares son ecosistemas que
aportan importantes servicios ambientales a la diversidad biolgica del planeta. Las
actividades productivas que desarrolla el hombre tienen que ser compatibles con la
proteccin y conservacin de los manglares, y deben establecerse estrategias que
permitan que estos ecosistemas mantengan su estructura y funcin, para brindar
los servicios ambientales que prestan y que son insustituibles.

Presiones y amenazas a los manglares

Las actividades humanas, que difieren de pas a pas, constituyen la principal
amenaza para los manglares. Entre ellas estn las relacionadas con el desarrollo
urbano, industrial y turstico, as como el desarrollo agrcola, ganadero y acucola,
que compiten por el suelo en donde se asientan los manglares. As mismo, los
manglares han recibido presiones por efecto de la contaminacin: desechos slidos
urbanos, contaminantes industriales, pesticidas y fertilizantes agrcolas, derrames
de petrleo, etc., as como modificaciones a las condiciones hidrolgicas. Distintos
estudios a nivel internacional sealan que recuperar un manglar que ha sido
severamente daado puede tomar muchos aos cuando ello es posible; en muchas
ocasiones la prdida es total e irreversible. La prdida de los manglares influye
significativamente en todas las especies que los utilizan para su desarrollo biolgico.
En particular, se estima que los manglares son determinantes para el desarrollo de
distintas especies de peces que se capturan comercialmente. De acuerdo con una
estimacin de la FAO, en 1980 los manglares abarcaban una superficie cercana a
los 19.8 millones de hectreas de las zonas costeras del mundo, con Indonesia,
Brasil, Nigeria y Australia como los pases con mayor superficie de manglar. Algunas
estimaciones sealan que a principios del ao 2000 la superficie global de manglar
se haba reducido a poco menos de 15 millones de hectreas. Si esta estimacin es
correcta y la comparamos con las cifras oficiales de FAO, en los ltimos 20 aos se
habra perdido entonces cerca del 25% de la superficie. Con las presiones
existentes y si la tendencia contina, estaramos destruyendo uno de los
ecosistemas representativos de la biodiversidad del planeta.

HIDROCARBUROS
El trmino hidrocarburos totales de petrleo (TPH) se usa para describir a un grupo
extenso de varios cientos de sustancias qumicas derivadas originalmente del
petrleo crudo. En este sentido, los TPH son realmente una mezcla de sustancias
qumicas. Se les llama hidrocarburos porque casi todos los componentes estn
formados enteramente de hidrgeno y carbono. Los crudos de petrleo pueden
tener diferentes cantidades de sustancias qumicas; asimismo, los productos de
petrleo tambin varan dependiendo del crudo de petrleo del que se produjeron.
La mayora de los productos que contienen TPH se incendian. Algunos TPH son
lquidos incoloros o de color claro que se evaporan fcilmente, mientras que otros
son lquidos espesos de color oscuro o semislidos que no se evaporan. Muchos
de estos productos tienen un olor caracterstico a gasolina, kerosn o aceite. Debido
a que en la sociedad moderna se usan tantos productos derivados del petrleo (por
ejemplo, gasolina, kerosn, aceite combustible, aceite mineral y asfalto), la
posibilidad de contaminacin ambiental es alta. La contaminacin con productos de
petrleo estar constituida por una variedad de estos hidrocarburos. Son
contaminantes frecuentes como la actividad volcnica y porque se emplean en la
fabricacin de un sinnmero de productos, esto causa que estn presentes con
regularidad en el agua, suelo, vegetales y hasta en tejidos animales y humanos.

Reaccin con el medio ambiente

Los TPH son liberados al ambiente a raz de accidentes, desde industrias o como
productos secundarios a raz de su uso comercial o privado. Cuando hay escapes
o derrames de TPH directamente al agua, algunas fracciones de los TPH flotarn
en el agua y formarn una capa delgada en la superficie. Otras fracciones ms
pesadas se acumularn en el sedimento del fondo, lo que puede afectar a peces y
a otros organismos que se alimentan en el fondo. Algunos organismos en el agua
(principalmente bacterias y hongos) pueden degradar algunas de las fracciones de
los TPH. Los TPH que son liberados al suelo pueden movilizarse hacia el agua
subterrnea a travs del suelo. All, los componentes individuales pueden separarse
9

de la mezcla original dependiendo de las propiedades qumicas de cada

componente. Algunos de estos componentes se evaporarn al aire y otros se
disolvern en el agua subterrnea y se alejarn del rea donde fueron liberados.
Otros compuestos se adherirn a partculas en el suelo y pueden permanecer en el
suelo durante mucho tiempo, mientras que otros sern degradados por
microorganismos en el suelo.

Efectos fticos

La falta o disminucin de la entrada de luz en el mar a causa de manchas de

petrleo imposibilita o reduce el rea donde es posible la fotosntesis y por
tanto, el desarrollo de plantas verdes.

80% de la actividad fotosinttica y de la absorcin de energa solar se

produce en los 10 primeros metros de la superficie marina. Ello indica la
importancia de la entrada de la luz (ese 20% restante) para mantener las
comunidades fotosintticas de los fondos marinos.

La falta o disminucin de plantas fotosintticas reduce el aporte de oxgeno

y alimento al ecosistema.

La prdida de extensin en la distribucin de algas y otras plantas acuticas

limita las zonas que proporcionan cobijo a miles de especies marinas. Estos
lugares son utilizados para larvas de los peces como zonas de alimento
mientras son sub-adultos.

El fitoplancton es a su vez el alimento del zooplancton (que adems de

microorganismos est formado por larvas de peces, moluscos, crustceos,
etc.) sin fitoplancton, el zooplancton muere y con l se interrumpe el
crecimiento de un importante nmero de especies, al tiempo que se deja sin
alimento a un gran nmero de animales marinos.

10

Efectos txicos

Las aves que quedan impregnadas de petrleo pierden o ven reducida su

capacidad de aislarse del agua pudiendo morir por hipotermia. Al intentar
limpiarse el plumaje con el pico ingieren grandes cantidades de hidrocarburos
por lo que se envenenan.

Muerte de los organismos por envenenamiento, sea por absorcin, o por

contacto.

Muerte por exposicin a los componentes txicos del petrleo solubles en

agua.

Tras desaparecer el petrleo de la superficie, el agua presenta una falsa

apariencia limpia dado que queda cristalina por la muerte del fitoplancton y
fauna marina que enturbia el agua.

Los mamferos marinos pueden sufrir el taponamiento de sus vas

respiratorias o daos en el tracto respiratorio y su mucosa por efecto de los
contaminantes

qumicos.

Tambin

ingieren

grandes cantidades

de

hidrocarburos por alimentarse de animales contaminados.

Los quimiorreceptores de muchas especies marinas detectan el petrleo en

el agua y les hacen variar sus migraciones y movimientos con lo que
determinadas especies desaparecen o no se acercan al lugar.

El petrleo se deposita sobre fondos marinos matando o provocando efectos

sub- letales sobre miles de animales y plantas vitales para el ecosistema.

Las algas de los fondos y las orillas quedan cubiertas por una fina pelcula
aceitosa que dificulta la fotosntesis y la reproduccin.

Los efectos sub- letales de fertilidad, reduccin del nivel de eclosin de

huevos, alteraciones en su comportamiento y gran cantidad de efectos
derivados de la toxicidad del vertido.

Los mejillones y otros moluscos que se adhieren a rocas u objetos, pierden

su capacidad de adhesin y caen al fondo, perdiendo su capacidad de
alimentarse.

11

Causas a la salud
El petrleo crudo es una compleja mezcla de qumicos, compuesta principalmente
de hidrocarburos parafenicos, cicloparafenicos, naftenicos, y aromticos, y
partculas de otros elementos, incluyendo varios metales. Los hidrocarburos del
petrleo de mayor inters toxicolgico son los compuestos voltiles orgnicos
(principalmente benceno, tolueno y xileno) y los hidrocarburos aromticos
polinucleares (HAP).

Las personas que se encuentran en ambientes contaminados con bajas

concentraciones de hidrocarburos pueden desarrollar irritacin de ojos, mucosa
nasal, vas respiratorias altas, garganta y piel. Los pacientes asmticos agravan su
condicin al tener contacto con este tipo de compuestos. En personas que no tienen
asma, pueden observarse dificultad para respirar (disnea), tos, espasmo en el
pecho o respiraciones entrecortadas.

De particular preocupacin es la exposicin al benceno, tolueno y xileno. Altas

concentraciones de benceno causan sntomas neurotxicos y una prolongada
exposicin a niveles txicos puede causar lesin de la medula sea con
pancitopenia persistente. El benceno es tambin una bien conocida causa de
leucemia y probablemente de otros tumores hematolgicos.

Sntomas
Los sntomas que se presentan por exposicin a hidrocarburos en altas
concentraciones pueden ser vrtigo, nauseas, vomito, irritacin estomacal,
somnolencia, taquicardia, cefalea, angustia, confusin, depresin y en algunos
casos hasta la prdida del conocimiento, convulsiones o muere. Algunos estudios
recientes han postulado que la exposicin a concentraciones altas de hidrocarburos
pueden incluso propiciar el impulso suicida en algunas personas.

12

BIORREMEDIACIN
El crecimiento de la poblacin y el avance de las actividades industriales a partir del
siglo XIX trajeron aparejados serios problemas de contaminacin ambiental. Desde
entonces, los pases generan ms desperdicios, muchos de ellos no biodegradables
o que se degradan muy lentamente en la naturaleza, lo que provoca su acumulacin
en el ambiente sin tener un destino seguro o un tratamiento adecuado. De este
modo, en lugares donde no existe control sobre la emisin y el tratamiento de los
desechos, es factible encontrar una amplia gama de contaminantes. Habitualmente,
los casos de contaminacin que reciben mayor atencin en la prensa son los
derrames de petrleo. Pero, en el mundo constantemente estn sucediendo
acontecimientos de impacto negativo sobre el medio ambiente, incluso en el entorno
directo, generados por un gran abanico de agentes contaminantes que son
liberados al ambiente. Un ejemplo lo constituyen algunas industrias qumicas que
producen compuestos cuya estructura qumica difiere de los compuestos naturales,
y que son utilizados como refrigerantes, disolventes, plaguicidas, plsticos y
detergentes. El problema principal de estos compuestos es que son resistentes a la
biodegradacin, por lo cual se acumulan y persisten en el ambiente y lo perjudica
tanto como a los seres vivos, entre ellos el ser humano.
En las ltimas dcadas, entre las tcnicas empleadas para contrarrestar los efectos
de los contaminantes, se comenz a utilizar una prctica llamada biorremediacin.
El trmino biorremediacin fue acuado a principios de la dcada de los 80, y
proviene del concepto de remediacin, que hace referencia a la aplicacin de
estrategias fsico-qumicas para evitar el dao y la contaminacin en suelos. Los
cientficos se dieron cuenta que era posible aplicar estrategias de remediacin que
fuesen biolgicas, basadas esencialmente en la observacin de la capacidad de los
microorganismos de degradar en forma natural ciertos compuestos contaminantes.
Entonces, la biorremediacin surge como una rama de la biotecnologa que busca
resolver los problemas de contaminacin mediante el uso de seres vivos

13

(microorganismos y plantas) capaces de degradar compuestos que provocan

desequilibrio en el medio ambiente, ya sea suelo, sedimento, fango o mar.
Tipos de biorremediacin
En los procesos de biorremediacin generalmente se emplean mezclas de ciertos
microorganismos o plantas capaces de degradar o acumular sustancias
contaminantes tales como metales pesados y compuestos orgnicos derivados de
petrleo o sintticos. Bsicamente, los procesos de biorremediacin pueden ser de
tres tipos:

Figura 1. Diferentes modos de biorremediacin.

Degradacin enzimtica

14

Este tipo de degradacin consiste en el empleo de enzimas en el sitio contaminado

con el fin de degradar las sustancias nocivas. Estas enzimas se obtienen en
cantidades industriales por bacterias que las producen naturalmente, o por bacterias
modificadas

genticamente

que

son

comercializadas

por

las

empresas

biotecnolgicas. Por ejemplo, existe un amplio nmero de industrias de

procesamiento de alimentos que producen residuos que necesariamente deben ser
posteriormente tratados.
En estos casos, se aplican grupos de enzimas que hidrolizar (rompen) polmeros
complejos para luego terminar de degradarlos con el uso de microorganismos (ver
en la prxima seccin). Un ejemplo lo constituyen las enzimas lipasas (que
degradan lpidos) que se usan junto a cultivos bacterianos para eliminar los
depsitos de grasa procedentes de las paredes de las tuberas que transportan los
efluentes.
Otras enzimas que rompen polmeros utilizados de forma similar son las celulosas,
proteinasas

amilasas,

que

degradan

celulosa,

protenas

almidn,

respectivamente. Adems de hidrolizar estos polmeros, existen enzimas capaces

de degradar compuestos altamente txicos. Estas enzimas son utilizadas en
tratamientos en donde los microorganismos no pueden desarrollarse debido a la alta
toxicidad de los contaminantes. Por ejemplo, se emplea la enzima peroxidasa para
iniciar la degradacin de fenoles y aminas aromticas presentes en aguas
residuales de muchas industrias.

Remediacin microbiana

En este tipo de remediacin se usan microorganismos directamente en el foco de la

contaminacin. Los microorganismos utilizados en biorremediacin pueden ser los
ya existentes (autctonos) en el sitio contaminado o pueden provenir de otros
ecosistemas, en cuyo caso deben ser agregados o inoculados.
15

La descontaminacin se produce debido a la capacidad natural que tienen ciertos

organismos de transformar molculas orgnicas en sustancias ms pequeas, que
resultan menos txicas. El hombre ha aprendido a aprovechar estos procesos
metablicos de los microorganismos. De esta forma, los microorganismos que
pueden degradar compuestos txicos para el ambiente y convertirlos en
compuestos inocuos o menos txicos, se aprovechan en el proceso de
biorremediacin. De esta forma, reducen la polucin de los sistemas acuticos y
terrestres. La gran diversidad de microorganismos existente ofrece muchos
recursos para limpiar el medio ambiente y, en la actualidad, esta rea est siendo
objeto de intensa investigacin. Existen, por ejemplo, bacterias y hongos que
pueden degradar con relativa facilidad petrleo y sus derivados, benceno, tolueno,
acetona, pesticidas, herbicidas, teres, alcoholes simples, entre otros. Los metales
pesados como uranio, cadmio y mercurio no son biodegradables, pero las bacterias
pueden concentrarlos de tal manera de aislarlos para que sean eliminados ms
fcilmente. Las actividades microbianas en el proceso de biorremediacin se
pueden resumir en la siguiente figura:

16

Figura 2

: Metabolismo microbiano

Los microorganismos ingieren contaminantes como fuente de carbono y algunos

nutrientes como fsforo y nitrgeno. La digestin de este compuesto en sustancias
ms simples como parte del metabolismo del microorganismo, puede resultar en la
degradacin del compuesto en forma parcial (transformacin) o total a dixido de
carbono (CO2) y agua (H2O).

Fitorremediacion
La fitorremediacin es el uso de plantas para limpiar ambientes contaminados.
Aunque se encuentra en desarrollo, constituye una estrategia muy interesante,
debido a la capacidad que tienen algunas especies vegetales de absorber, acumular
y/o tolerar altas concentraciones de contaminantes como metales pesados,
compuestos orgnicos y radioactivos. La fitorremediacin ofrece algunas ventajas y
desventajas frente a los otros tipos de biorremediacin:

Ventajas:
17

Las plantas pueden ser utilizadas como bombas extractoras de bajo costo
para depurar suelos y aguas contaminadas.

Algunos procesos degradantivos ocurren en forma ms rpida con plantas

que con microorganismos.

Es un mtodo apropiado para descontaminar superficies grandes o para

finalizar la descontaminacin de reas restringidas en plazos largos.

Limitaciones:

El proceso se limita a la profundidad de penetracin de las races o aguas

poco profundas.

Los tiempos del proceso pueden ser muy prolongados.

La biodisponibilidad de los compuestos o metales es un factor limitante de la

captacin.

Las plantas pueden incorporar las sustancias contaminantes mediante

distintos procesos que se representan en la siguiente ilustracin y se explican
en la tabla que contina:

18

Figura 3. Tipos de fitorremediacin, en donde se indica la zona de la planta en donde ocurre

el proceso.

19

Tipos de fitorremediacin
Tipo

Proceso Involucrado

Contaminacin Tratada

Las plantas se usan para concentrar Cadmio, cobalto, cromo, nquel,

Fitoextraccin

metales en las partes cosechables

mercurio, plomo, plomo selenio,

(hojas y races)

zinc

Las races de las plantas se usan para Cadmio, cobalto, cromo, nquel,
absorber,

precipitar

concentrar mercurio, plomo, plomo selenio,

metales pesados a partir de efluentes zinc

Rizofiltracin

istopos

radioactivos,

lquidos contaminados y degradar compuestos fenlicos

compuestos orgnicos
Las plantas tolerantes a metales se Lagunas

de

deshecho

de

usan para reducir la movilidad de los yacimientos mineros. Propuesto

Fitoestabilizacin

mismos y evitar el pasaje a napas para

subterrneas o al aire.

fenlicos

para

promover

el

compuestos

clorados.

Se usan los exudados radiculares Hidrocarburos

Fitoestimulacin

desarrollo

microorganismos degradativos

de petrleo

derivados

del

poliaromticos,

benceno, tolueno, atrazina, etc.

(bacterias y hongos)
Las

plantas

metales
Fitovolatilizacin

captan

pesados

modifican Mercurio,

compuestos clorados

selenio

solventes

(tetraclorometano

orgnicos y los liberan a la atmsfera triclorometano)

con la transpiracin.
Las plantas acuticas y terrestres Municiones
captan,

almacenan

compuestos
Fitodegradacin

orgnicos

(TNT,

DNT,

RDX,

degradan nitrobenceno, nitrotolueno),

para

dar atrazina, solventes clorados, DDT,

subproductos menos txicos o no pesticidas fosfatados, fenoles y

txicos.

nitrilos, etc.

Cuadro 1. Tipos de fitorremediacin

20

Se conocen alrededor de 400 especies de plantas con capacidad para

hiperacumular selectivamente alguna sustancia. En la mayora de los casos, no se
trata de especies raras, sino de cultivos conocidos. As, el girasol (Heliantus anuus)
es capaz de absorber en grandes cantidades el uranio depositado en el suelo. Los
lamos (gnero Populus) absorben selectivamente nquel, cadmio y zinc. Tambin
la pequea planta Arabidopsis thaliana de gran utilidad para los bilogos es capaz
de hiperacumular cobre y zinc. Otras plantas comunes que se han ensayado con
xitos como posibles especies fitorremediadoras en el futuro inmediato son el
girasol, la alfalfa, la mostaza, el tomate, la calabaza, el esparto, el sauce y el bamb.
Incluso existen especies vegetales capaces de eliminar la alta salinidad del suelo,
gracias a su capacidad para acumular el cloruro de sodio.

En general, hay plantas que convierten los productos que extraen del suelo a
componentes inocuos, o voltiles. Pero cuando se plantea realizar un esquema de
fitorremediacin de un cuerpo de agua o un rea de tierra contaminados, se siembra
la planta con capacidad (natural o adquirida por ingeniera gentica) de extraer el
contaminante particular, y luego del perodo de tiempo determinado, se cosecha la
biomasa y se incinera o se le da otro curso dependiendo del contaminante. De esta
forma, los contaminantes acumulados en las plantas no se transmiten a travs de
las redes alimentarias a otros organismos.

Uso de organismos modificados genticamente en biorremediacin

En los ltimos aos, los avances en ingeniera gentica han permitido el desarrollo
de organismos transgnicos. Y la biorremediacin hace uso de esta nueva
tecnologa para resolver varios problemas de contaminacin. El futuro promete an
ms.

21

Muchos grupos de investigacin estn desarrollando en el laboratorio, plantas y

microorganismos genticamente modificados para ser mejores agentes de
biorremediacin, es decir que degraden mejor o ms eficientemente a los agentes
contaminantes. Por ejemplo, se puede utilizar material gentico de bacterias
resistentes a metales para insertarlo en el genoma de una planta que, entonces,
adquirira esta nueva caracterstica.

Un grupo de investigacin utiliz un gen llamado mera, que codifica para la enzima
reductasa del ion mercrico, altamente txico, que cataliza su reduccin hasta la
forma voltil y poco txica de mercurio elemental, gaseoso en condiciones de
temperatura no muy elevadas. Estos investigadores, consiguieron la transferencia
del gen bacteriano mera a cultivos de Liriodendro tulipifera (lamo amarillo). El gen
se expres adecuadamente en ese material vegetal, de modo que las plntulas
regeneradas germinaron y crecieron vigorosamente en los medios de cultivo, que
contenan niveles de iones mercurio que son normalmente txicos, siendo capaces
de captarlo en su forma inica y de reducirlo en el interior de la planta, tras lo cual
era liberado en la forma gaseosa no txica.

Esta investigacin ha abierto el camino para que en el futuro sea posible realizar
plantaciones arbreas transgnicas que, mediante este proceso de fitovolatilizacin
u otros parecidos, sean capaces de descontaminar terrenos con altos niveles de
contaminantes. Se estn perfeccionando nuevos mtodos de biotecnologa para el
tratamiento del agua, que eliminarn los compuestos que contengan fsforo,
nitrgeno y azufre. Este bioprocesamiento se est extendiendo a varios procesos
industriales, entre ellos los de las industrias petroqumicas, qumicas y mineras, con
el uso de bacterias oxidantes.

22

La biorremediacin mediante bacterias ofrece grandes posibilidades de limpiar y

descontaminar sistemas complejos y gracias a sus ventajas econmicas y
ambientales ser una de las tecnologas ms desarrolladas durante este siglo. Se
estn utilizando cepas especializadas de microorganismos de alta actividad para
tratar agentes contaminantes en diferentes sectores, como las industrias que utilizan
catalizadores, las textiles, las curtiembres, el procesamiento de celulosa y almidn,
la galvanoplastia, la minera, el desengrasado y recubrimiento de superficies y la
impresin.

Nuevos desarrollos biotecnolgicos en plantas y bacterias

Entre los desarrollos biotecnolgicos que se estn llevando a cabo para procesos
de fitorremediacin se encuentran los siguientes:

Rizofiltracin para la extraccin de Uranio de aguas subterrneas en

Asthabula, Ohio, EEUU.

Rizofiltracin a nivel de cultivo en vitro para detoxificar compuestos fenlicos

en aguas contaminadas (por ejemplo los derivados de los herbicidas
tradicionales y contaminantes como el 2,4-D) en la Universidad Nacional de
Ro Cuarto, Crdoba por el grupo de investigacin de la Dra. Elizabeth
Agostini.

Fitovolatilizacin de mercurio (Hg) por medio de plantas transgnicas

(Arabidopsis thaliana) que fueron transformadas con dos genes provenientes
de microorganismos que pueden transformar el mercurio inico en mercurio
ms estable.

Plantas transgnicas de tabaco con genes provenientes de bacterias que le

permiten detoxificar TNT y GTN en suelos de campos minados.

Plantas transgnicas de Arabidopsis thaliana que toleran la acumulacin de

cadmio, arsnico y mercurio.

Bacterias Pseudomonas transgnicas que son capaces de degradar

compuestos txicos que contienen cloro en compuestos menos nocivos.
23

Microorganismos capaces de degradar TNT, un explosivo de gran potencia

y muy agresivo para el entorno.

Bacterias capaces de reducir las formas altamente txicas de mercurio en

otras menos txicos y voltiles.

Bacterias que transforman metales del suelo en formas menos txicas o

insolubles. Por ejemplo: la reduccin de cromo (Cr+6 a Cr+3).

La utilizacin de la bacteria Deinococcus radiodurans para eliminacin de

elementos radiactivos presentes en el suelo y aguas subterrneas. Este
microorganismo es un extremfilo que resiste condiciones extremas de
radiacin,

sequedad,

agentes

oxidantes

diversos

compuestos

mutagnicos.

Cianobacterias a las que se le han introducido genes de bacterias

Pseudomonas con capacidad de degradar diferentes hidrocarburos o
pesticidas.

24

ANALISIS DE CASO

Generalidades del lugar

Paraso es un municipio del estado mexicano de Tabasco, localizado en la regin
del ro Grijalva y en la subregin de la Chontalpa. Su extensin es de 577.55 km2,
los cuales corresponden al 1.5% del total del estado; esto coloca al municipio en el
decimosptimo lugar en extensin territorial, lo que lo hace el ms pequeo de los
municipios de Tabasco. En la imagen 1 se muestra la localizacin satelital del lugar
afectado.

Foto 1. Vista satelital de la Laguna Mecoacn, laguna Contaminada por Terminal Martima de
Dos Bocas, ubicada en el municipio de Paraso Tabasco.

La Laguna Mecoacn est ubicada en el estado mexicano de Tabasco,

aproximadamente a 85 kilmetros de la capital estatal Villahermosa, en el municipio
de Paraso, en el golfo de Mxico, la Laguna Mecoacn es un cuerpo de agua salda
con pequeas islas de exuberante vegetacin de manglar y palmeras, hbitat de
infinidad de aves acuticas como garzas, gaviotas, y pelcanos, entre otros.

25

El clima caracterstico es clido hmedo (Tamayo, 1979; Garca, 1974). La

precipitacin media anual a lo largo de la costa es del orden de 1,500 a 1,800 mm.
La temperatura media anual es de 26C, con un mximo de 28C en julio, con
temperatura extrema mxima de 42-43C, la mnima se presenta en enero con 22C
y la mnima extrema de 10C en invierno. Los meses lluviosos son de junio a
septiembre, con una precipitacin media de 240 mm, siendo septiembre el mes ms
lluvioso con precipitacin de 350 mm. Los meses de enero a abril constituyen la
temporada relativamente seca.

La evaporacin media anual es de 1,600 mm con un escurrimiento medio anual de

300 mm, siendo su mximo en octubre y el mnimo en abril (Servicio Meteorolgico
Nacional, 1970). En los meses invernales, el desplazamiento hacia el S de masa de
aire fro genera fuertes vientos denominados "nortes".

Planteamiento del problema

La situacin ambiental por la actividad petrolera en Tabasco est llegando a una
situacin insostenible que provoca que los daos en el medio ambiente y el entorno
natural de los humedales y manglares, sean ya irreversibles, segn lo han
denunciado

diversos

organismos

ambientalistas,

quienes

parecen

luchar

infructuosamente contra molinos de viento, para llamar la atencin sobre el

problema sin que sean escuchados.

En la Chontalpa, en la zona de Pantanos de Centla, y en la zona costera de

manglares y cocotales, es recurrente el hecho que las lagunas, los sistemas
lagunares y los afluentes de los ros estn contaminados por derrames de
hidrocarburos debido al descuido, accidentes y la falta de mantenimiento en los
ductos, vlvulas y equipo de perforacin de la paraestatal Petrleos Mexicanos
(Pemex) imagen 2.

26

Imagen 2. Manglares de La laguna Mecoacn en el municipio de Paraiso, Tabasco,

Contaminados por hidrocarburos de PEMEX.

La explosin ocurrida en el ao 2007, en el quemador instalado en la Terminal

Martima de Dos Bocas, frente al poblado de Torno largo,

derram

los

hidrocarburos hacia la laguna de Mecoacn y el Ro Seco, afectando varias granjas

de ostin de cra y engorda de peces, as tambin como varios kilmetros de
manglares, que hasta la fecha no se han podido recuperar.

Foto 3. Daos a manglares

Debido a estas afectaciones 12 especies de flora y fauna costeras de la zona

limtrofe de Comalcalco y Paraso han desaparecido por las afectaciones que tienen
estos sistemas naturales.
27

BACTERIAS PSEUDOMONAS EN LA BIORREMEDIACIN DE SUELOS

CONTAMINADOS CON HIDROCARBUROS

El proceso de biorremediacin de hidrocarburos, contaminantes del suelo, llevado a

cabo por Pseudomonas sp est condicionado por factores biticos y abiticos como
los nutrientes, respiracin, pH, humedad y temperatura propios del microorganismo,
los cuales al ser modificados limitan o favorecen la capacidad metablica de la
bacteria y su adaptabilidad con el cambio de posicin de los cidos grasos de la
membrana celular. La biorremediacin de suelos ha demostrado ser una tecnologa
eficaz para el tratamiento de la contaminacin por petrleo, debido a que gran parte
de los componentes del crudo y sus productos refinados son biodegradables. A
continuacin se describen las condiciones biticas y abiticas que necesitan las
Pseudomonas para llevar a cabo un adecuado proceso de biorremediacin,
teniendo en cuenta las caractersticas y propiedades de la bacteria.

Factores abiticos

pH

El pH es un factor qumico importante que influye en la recuperacin de suelos

contaminados por hidrocarburos, ya que puede afectar principalmente a las
poblaciones de Pseudomonas y la biodisponibilidad de las fuentes de carbono y
energa. Este factor se constituye como uno de los indicadores del proceso de
biorremediacin y aunque las Pseudomonas se pueden adaptar fcilmente a
condiciones extremas, estas cepas microbianas tienen un determinado rango de
tolerancia. El rango ptimo para la biodegradacin est entre 68 pH.

Humedad y temperatura

Las Pseudomonas spp son bacterias que requieren unas condiciones mnimas de
humedad para su crecimiento; el agua es importante para su desarrollo porque
28

acta como medio de transporte de nutrientes y oxgeno a la clula ya que forma

parte de su protoplasma bacteriano. Es conveniente mantener una humedad del
orden del 25- 75 % de la capacidad de campo, la cual se define como la masa de
agua que admite el suelo hasta la saturacin, que depende de cada tipo de suelo.

En climas tropicales es mejor una temperatura aproximadamente de 30 a 35 C para

la actividad de las Pseudomonas. Las Pseudomonas spp. responden a cambios
ambientales modificando su composicin de cidos grasos de la membrana celular
que le permite mantener la homeoviscosidad ante situaciones de estrs y su
posterior adaptabilidad. Adems, los cambios de temperatura las Pseudomonas
spp. presentan un incremento de la insaturacin de cidos grasos con la disminucin
de esta con el fin de mantener la fluidez de la membrana, y ante el aumento de
temperatura hay un incremento de cidos grasos saturados y una disminucin de
los cidos grasos insaturados, demostrando de esta manera que las Pseudomonas
spp. son microorganismos euritrmicos, es decir, microorganismos capaces de
adaptarse a los cambios, lo cual hace que estas bacterias sean las mejores aliadas
en la aplicacin de la biorremediacin de suelos contaminados con hidrocarburos
en diferentes condiciones ambientales de temperatura.

Factores biticos

Suelo

Los contaminantes del petrleo se alojan principalmente en el horizonte A, donde

se encuentra el mayor contenido de materia orgnica que incluye a los
microorganismos que pueden ser estimulados por la adicin de nutrientes, ya sean
fertilizantes, o de Oxgeno por medio de la agitacin. Existen otros tipos de
contaminantes como los hidrofbicos que se absorben y se depositan en los poros
del suelo, dificultando la biodegradacin.

29

Los suelos expuestos a la contaminacin prolongada con hidrocarburos derivados

del petrleo, constituye un microhbitat adecuado para la evolucin de especies
bacterianas degradadoras. El contaminante ejerce una presin sobre la poblacin
microbiana involucrada y de esta forma se seleccionan aquellos capaces de
sobrevivir y adaptarse a estas condiciones.

Nutrientes

Los nutrientes son uno de los factores ms relevantes por ser sustancias qumicas
necesarias para la actividad microbiana y metablica de la Pseudomonas spp, por
lo que estos constituyentes se deben encontrar disponibles para su asimilacin y
sntesis, y deben ser controlados para aumentar la eficiencia y el buen desarrollo de
la biorremediacin. Se dividen en dos grandes grupos: macronutrientes y
micronutrientes

Respiracin y aireacin

La biorremediacin es fundamentalmente un proceso metablico de transferencia

de electrones. La energa necesaria para el crecimiento microbiano se obtiene
durante el proceso de oxidacin de materiales reducidos, donde las enzimas
microbianas catalizan la transferencia de los electrones. Este proceso se denomina
respiracin microbiana, y se basa en que en la cadena respiratoria, o
transportadora de electrones de las clulas, producen una serie de reacciones de
xido-reduccin cuyo fin es la obtencin de energa.

Capacidad metablica del microorganismo

En el proceso de biorremediacin la degradacin efectuada por la Pseudomonas,

se debe tener en cuenta que al ser parte de una poblacin nativa, est interactuando
con otros microorganismos formando los llamados consorcios microbianos.
30

Rutas metablicas de bacterias Pseudomonas en medios carbonatos

El gnero Pseudomonas representa un grupo grande e importante de bacterias

Gram Negativas el cual incluye especies de gran versatilidad metablica as como
de propensin patolgica, de ah su importancia tanto clnica como ambiental. El
inters de estas bacterias se ha reflejado en el gran nmero de publicaciones de
investigacin y libros sobre este tema.

Existen dos lados opuestos sobre la reputacin de este gnero, uno afamado y otro
desacreditado. La buena reputacin del genero Pseudomonas se ha reforzado
debido al gran nmero de artculos publicados, en donde se enfatiza la notable
capacidad de estos microorganismos para degradar una gran cantidad de
compuestos orgnicos, Tales referencias sobre propiedades saprofitas han llegado
a tomar un lugar preponderante en los publicaciones relacionadas con aspectos
bioqumicos, ecolgicos, fisiolgicos, genticos y biotecnolgicos. La reputacin es
bien merecida, no solo porque las Pseudomonas realmente usan gran cantidad de
compuestos que pueden ser tanto sustratos como intermediarios de rutas
metablicas conocidas, sino porque la lista frecuente incluye compuestos
aromticos, derivados halogenados y una variedad de residuos orgnicos
recalcitrantes que rara vez son degradados o pobremente degradados por otros
grupos microbianos.

El aspecto que desacredita a las Pseudomonas se representa porque algunas

especies tienen importancia fitopatognica y otras son patgenos de humanos y
animales. Muchos tienen capacidad intrnseca de tolerancia de agentes txicos,
frecuentemente apoyados por genes contenido en plsmidos, conocidos como
factores de resistencia, los cuales codifican para sistemas de resistencia a
antibiticos, metales pesados y una variedad de agentes txicos tanto fsicos como
qumicos. Estas propiedades se han intensificado por el uso excesivo de antibiticos
en humanos y en medicina veterinaria.

31

Las especies de Pseudomonas contienen plsmidos que son principalmente

catablicos, con genes que codifican para enzimas involucradas en la degradacin
de una amplia variedad de compuestos que generalmente no son metabolizados
por otro grupo de bacterias. Algunos plsmidos catablicos y de resistencia pueden
ser trasferidos a otras bacterias Gram negativas por conjugacin, por tanto
representan un depsito valioso de material gentico perteneciente a grupos
fitogeneticamente distantes, por o cual es interesante resaltar que la resistencia a
factores fuertemente selectivos tales como antibiticos, diversos agentes
antibacterianos y sistemas de degradacin de compuestos txicos parecen estar
codificados por genes localizados en elementos extracomosomales. Las especies
Pseudomonas son una fuente extremadamente rica en plsmidos catablicos y de
resistencia lo cual aumenta el inters sobre estos organismos desde el punto de
vista de aplicaciones biotecnolgicas.

Varias especies del gnero Pseudomonas participan activamente en el ciclo del

carbono en la naturaleza, por lo que se les considera entre los organismos aerobios
ms verstiles en la degradacin de muchos compuestos orgnicos.

Las bacterias Pseudomonas tienen la capacidad de biodegradar hidrocarburos del

petrleo, tales como hidrocarburos aromticos policclicos incluyendo naftaleno,
hidrocarburos aromticos como el tolueno e hidrocarburos alifticos como n-alcanos
y estos se encuentran relacionados con los plasmiodos catablicos OCT, NAH y
TOL.

32

Ruta metablica de oxidacin terminal de n-alcanos por Pseudomonas

Los n-alcanos son el grupo ms abundante de compuestos encontrados en el

petrleo crudo, estos compuestos pueden ser biodegradados aerbicamente por
diferentes rutas. La degradacin de n-alcanos de cadena media por Pseudomonas
putida, la cual contiene al plsmido OCT, es iniciada por alcano hidroxilasas. La
oxidacin del grupo metilo de n-alcanos por alcano hidroxilasa produce n-alcanoles
que son posteriormente oxidado por alcohol deshidrogenasa unida a la membrana,
a n-alcanales los cuales son subsecuentes transformados a cidos grasos y a acetilCoA por aldehdo deshidrogenasa y acetil-CoA sintetasa respectivamente, se ha
reportado tambin una ruta de degradacin de n-alcanos produciendo alcoholes
secundarios en la cual los n-alcanos son oxidados por monoxigenasas a alcoholes
secundarios, despus a cetonas y finalmente a cidos grasos, como se muestra en
la siguiente figura.

33

Ruta metablica de oxidacin subterminal de n-alcanos

Ruta metablica de degradacin de n-alcanos alquil hidroperoxidasa

Ruta metablica de degradacin de ciclohexano

34

Ruta metablica de degradacin de tolueno por P. putida TOL, P. putida, P.

mendocina KR1 y P. pickettii PKO

La degradacin de compuestos aromticos, como el tolueno, puede seguir cinco

rutas diferentes en las que se incluyen bacterias de las cuales cuatro incluyen
Pseudomonas. En la ruta codificada por el plsmido TOL el tolueno es
sucesivamente degradado a alcohol becilico, benzoato y cateo. La primera etapa
de la degradacin del tolueno por Pseudomonas putida es la introduccin de dos
grupos hidroxilo en la molcula formando cis-tolueno dihidrodiol, este intermediario
es convertido a 3-metilcatecol. Pseudomonas mendocina KR1 convierte el tolueno
a p-cresol por la accin de tolueno-4-monoxigenasa, seguido por la formacin de phidroxigenasa atreves de la oxidacin del metilo de la cadena lateral. Pseudomonas
pickettii PKO1 oxida el tolueno por accin de tolueno-3-monoxigenanda a mecresol,
el cual posteriormente oxidado a 5-metilcatecol por otro monoxigenasas.

35

Crecimiento Microbiano en la Biorremediacin de Suelo Contaminado con

Hidrocarburos

La biodegradacin es el proceso de la digestin, asimilacin, y metabolizacin de

un compuesto orgnico, llevado a cabo por bacterias, hongos, protozoos y otros
organismos. Este proceso de biodegradacin incluye las siguientes reacciones:
oxido-reduccin, procesos de adsorcin e intercambio de iones, y reacciones de
quelacin de formacin de complejos que dan lugar a la fijacin de metales. Para
estos procesos se deben tener en cuenta algunos nutrientes para que se pueda
completar la ruta metablica. Para el suelo contaminado con hidrocarburos se utiliza
una biodegradacin aerobia que se describe de la siguiente forma:

+ + +

Los hidrocarburos son compuestos orgnicos formados por carbn e hidrgeno, los
cuales pueden existir en forma de cadenas lineales ramificadas o bien, formando
anillos. Teniendo en cuenta esto, tambin tienen la posibilidad de ser degradados a
una estructura molecular ms simple, dependiendo del proceso que se le aplique.
As mismo se ha encontrado que una gran variedad de bacterias, hongos, levaduras,
ciertas cianobacterias y algas verde azules son capaces de degradar hidrocarburos
entre ellos las bacterias.

La degradacin microbiana es una de las principales rutas, mediante la cual, los

hidrocarburos son removidos de ambientes contaminados. Esta depende de la
cintica del crecimiento, que est determinada por la curva de crecimiento
microbiano. Esta tiene 4 fases establecidas. Las cuales son: fase de latencia, en la
que se presenta una adaptacin al medio y se preparan las enzimas para degradar
compuestos. Luego sigue la fase exponencial o de crecimiento, donde comienza la
divisin celular y reproduccin de los microorganismos, esta fase depende de las
36

condiciones que tenga el medio para su crecimiento y del tiempo de duplicacin

celular de cada especie. Despus se presenta la fase estacionaria, all la poblacin
se mantiene constante. Ya que el tiempo de duplicacin es igual a la vida media. Y
por ltimo esta la fase de muerte, all el nmero de muertes es mucho mayor al de
divisiones la curva de crecimiento microbiano como se aprecia la siguiente figura.

Figura 4. Fases de crecimiento microbiano

Para la construccin de la curva de crecimiento se desarrollara por la cuenta de

bacterias hidrocarbonoclastas. Con las repeticiones que se determinen ser posible
conocer cul ser el desarrollo de las bacterias en la biorremediacin y el tiempo en
que se demorar la biorremediacin, durante las primeras semanas se sugiere
realizar la cuenta bacteriana cada 3 das ya que se encontrara la fase de latencia y
es necesario identificar en qu momento o tiempo iniciar la fase exponencial es por
ello la sugerencia de las primeras semanas realizar la cuenta cada 3 das, una vez
identificado la fase exponencial se procede al conteo cada semana. A continuacin

37

se presenta el mtodo para la cuenta microbiana en la biorremediacin de suelo

contaminado con hidrocarburos.
Determinacin de bacterias hidrocarbonoclastas por dilucin en placas
(Bossert I. D. y Kosson D. S. 1997).

Las bacterias hidrocarbonoclastas son aquellas capaces de crecer en presencia de

hidrocarburos como nica fuente de carbono y energa. En suelos contaminados, la
biodegradacin es un proceso donde la actividad metablica de organismos vivos,
principalmente microorganismos, degrada a los contaminantes orgnicos en
compuestos ms simples y/o menos txicos, y en el mejor de los casos los
mineraliza (transforma en CO2 y H2O). La cuenta microbiana provee evidencia de
la presencia de grupos determinados de microorganismos cuando se utiliza un
medio de cultivo especfico, y es usado como indicador del potencial de
biodegradacin de un suelo en particular.

El conteo de poblaciones microbianas por dilucin en placa es un mtodo simple y

rpido para la cuenta viable de clulas microbianas en el suelo. Sin embargo, la
cuenta obtenida es generalmente 10 a 100 veces menos que aquella determinada
por cuenta directa por microscopia. Las razones para esta discrepancia incluyen la
exclusin de la cuenta no viable directamente en el suelo y la inhabilidad para
proveer apropiados nutrimentos en el medio de crecimiento, para obtener la cuenta
total en placa.

El mtodo para el aislamiento y cuenta de las bacterias hidrocarbonoclastas del

suelo es por la tcnica de cuenta por dilucin en placa, utilizando un medio mineral
basal. El sustrato utilizado para este mtodo debe ser ligero (voltil), ya que el
acceso de esta fuente de carbono y energa esa travs de los vapores que se
generan de ella.

38

Medio mineral basal.

Componente
Agua destilada

Cantidad
1L

KH2PO4
Fosfato de potasio monobsico
K2HPO4
Fosfato de potasio dibsico
NH4Cl
Cloruro de amonio
MgCl2 6H2O
Cloruro de magnesio sextahidratado
NaSO4 7H2O
Sulfato de sodio heptahidra tado
CaCl2 2H2O
Cloruro de calcio dihidratado
Solucin mineral
Tabla 1. Componentes del medio mineral basal

0.4 g
1.6 g
1.5 g
0.17 g
1.5 g
0.045 g
1.0 ml

Nota: La solucin mineral se agrega despus de esterilizar.

Solucin mineral
Compontes
Agua destilada
Cloruro de calcio dihidratado
Cloruro de manganeso monohidratado
Cloruro de sodio

Cantidad
1L
MgCl2H2O
MnCl2H2O
NaCl

FeCl3 6H2O
Cloruro frrico sextahidratado
CaCl2 2H2O
Cloruro de calcio dihidratado
CuCl2
Cloruro de cobre
ZnCl2
Cloruro de zinc
AlCl3
Cloruro de aluminio
H
Acido brico
3BO3
Na2MoO4 2H2O
Molibdato de sodio dihidratado
Tabla 2. Componentes de la solucin mineral

5.1 g
0.66 g
1.0 g
1.0 g
0.1 g
0.01 g
0.08 g
0.05 g
0.01 g
0.04 g

El fundamento es el de dilucin en placa, basado en la capacidad de los

microorganismos hidrocarbonoclastas de poder utilizar a los hidrocarburos como
fuente de carbono y energa, cuando crecen en un medio con estas caractersticas
de seleccin. El petrleo ligero que se impregna en un papel filtro permite que las
bacterias hidrocarbonoclastas se alimenten de los hidrocarburos voltiles, o la
adicin de un hidrocarburo en solucin asperjando la superficie de la caja ya
inoculada.

39

Mtodo y equipos
Tubos de vidrio de 15 ml para cultivo con 9 ml de solucin salina 0.85%
estril.
Matraz Erlenmeyer con tapa con 99 ml de solucin salina 0.85% estril.
Pipetas de 1 ml y de 0.2 ml, estriles.
Vrtex.
Balanza.
Esptulas.
Campana de flujo laminar o rea estril.
Cajas de Petri.
Muestra de suelo.
Incubadora.
Papel aluminio estril.
Matraces o botellas de cultivo 1 L.
Agitador magntico.
Varilla para expandir muestra.
Papel filtro estril.
Autoclave.

Soluciones y reactivos
1) Solucin salina 0.85% estril. Adicionar 8.5 g de cloruro de sodio (NaCl) en
1 L de agua destilada.
2) Cajas de Petri con medio de cultivo adecuado para el crecimiento.
3) Etanol (CH3-CH2-OH).
4) Agua destilada.
40

5) Agar noble (libre de impurezas).

6) Medio mineral basal (Tabla 1).
7) Solucin mineral (Tabla 2). Disolver en un litro de agua destilada cada uno
de los componentes y esterilizar por filtracin.
8) Petrleo crudo ligero estril. Esterilizar el petrleo crudo tres veces a 110C
durante una hora, dejando entre cada esterilizacin un da a temperatura
ambiente.

Procedimiento
1) Preparar el medio de cultivo con los componentes del medio mineral basal,
disolvindolas en el orden sealado en un litro de agua destilada.
2) Ajustar el pH a 7.0, despus adicionar 15 g de agar puro (agar noble).
3) Esterilizar a 15 lb/15 min. Dejar enfriar, cuando el medio se encuentre a 50C
aproximadamente, aadir la solucin mineral estril previamente preparada
(1 ml por L de medio).
4) Vaciar el medio en cajas de Petri en condiciones estriles, esperar a que
gelifique.
5) En un disco de papel filtro estril impregnar de petrleo que est en el
sustrato y colocarlo en la parte interna de la tapa de la caja de Petri. El
hidrocarburo que se volatiliza servir como fuente de carbono y energa.

Preparacin de la muestra
1) En condiciones estriles (trabajar en campana de flujo laminar), adicionar 1
g del suelo a una botella de dilucin o matraz con tapa de rosca con 99 ml de
solucin salina isotnica estril (dilucin 10-2). Dispersar el suelo y
homogeneizar con agitacin vigorosa en vrtex.

2) Tomar 1 ml y transferirlo a un tubo con 9 ml de solucin salina estril (dilucin

10). De ah se hacen diluciones sucesivas hasta completar diluciones
decimales hasta 10-10 las adecuadas, asegurndose de utilizar una punta o
41

pipeta estril diferente en cada paso. Agitar de forma constante con vrtex
en cada paso.

3) Tomar 0.1 ml de la dilucin seleccionada y colocarla en el centro de la

superficie del medio de cultivo seleccionado para el crecimiento. Realizar
esto por triplicado y con tres diluciones prximas (ej. 10-3, 10-4 y 10-5) para
asegurar la cuenta.

4) Extender la alcuota en la superficie de la placa con una varilla de vidrio

previamente esterilizada (inmersa en alcohol y pasndola por la flama del
mechero permitiendo su enfriamiento). Asegurar una distribucin homognea
por toda la superficie del medio.

5) Incubar las placas de forma invertida a 30C en ausencia de luz.

6) Despus de cinco das de incubacin, proceder al conteo de colonias.

7) Para el clculo final de unidades formadoras de colonias (UFC) se debe

considerar la dilucin con que se inocul la caja, la cantidad de inculo (0.1
ml) y la humedad de la muestra.

42

Clculos

Contar slo aquellas cajas (diluciones) que contengan de 30 a 300 colonias. Con la
siguiente ecuacin calcular las UFC/g s.s.

UFC/g s.s. = (NC * 1/FD * 1/ V) / (P * FH)

Donde:
UFC/ g s. s. = unidades formadoras de colonias / g de suelo seco.
NC = nmero de colonias en una caja.
FD = factor de dilucin que corresponde a la dilucin de donde se tom la muestra
con lo que se inocula la caja (10-2 a 10-10).
V = volumen inoculado en la caja = 0.1 ml.
P = peso de la muestra hmeda = 1 g.
FH = factor de correccin de humedad (1-(%humedad/100)).

Fases del crecimiento microbiano durante la Biorremediacin de Suelo

Contaminado con Hidrocarburos

Con este mtodo se podr conocer el crecimiento microbiano durante el proceso de

biorremediacin, plasmando los resultados de cuenta de Unidades Formadoras de
Colonias de bacterias hidrocarbonoclastas degradadoras de hidrocarburos. Se
podr construir la curva de crecimiento microbiano en las 4 fases establecidas:

43

La fase de latencia ser la mayor monitoreada o con ms repeticiones; como se

mencion se determinaran las cuentas de bacterias hidrocarbonoclastas cada 3
das para cocer el tiempo en que pasara a la siguiente fase, ya que en esta fase es
cuando las bacterias Pseudomonas sp estn en proceso de adaptacin.

Luego sigue la fase exponencial o de crecimiento, donde comienza la divisin

celular y reproduccin de los microorganismos, en cuanto ms aumente la cantidad
de bacterias en el sistema menor ser el tiempo del proceso de biorremediacin, de
igual forma se controlaran los factores para el crecimiento contine en alza. Cuando
llegue el momento en que disminuye o se detiene el crecimiento es posible que se
est pasando a la siguiente fase.

La fase estacionaria, all la poblacin se mantiene constante. Es cuando mayor

control de los factores se tendr para que esta fase perdure por el mayor tiempo
posible y las bacterias hidrocarbonoclastas en especial las Pseudomonas sp.,
puedan desempear su trabajo en las condiciones requeridas. Esta fase se
desempea ya que el tiempo de duplicacin es igual a la vida media, en caso de
que esta fase no se mantenga por mucho tiempo es posible de que se haya tenido
un descuido en el control de los factores originando una baja del rendimiento de las
bacterias. Pero si la concentracin HTP disminuye es posible que inicie una baja de
las bacterias por carecer de fuente de energa y de paso a la siguiente fase.
La fase de muerte, es cuando las bacterias mueren por no haber fuente de alimento
el cual es el hidrocarburo, es decir que los que las bacterias desempearon un buen
trabajo en transformar el contaminante en compuestos ms simples.

44

Control de los factores cinticos durante la Biorremediacin

En la siguiente tabla se presentan los factores a controlar durante la

biorremediacin, en caso de no controlarlos es posible de que el saneamiento del
suelo no se desarrolle correctamente, teniendo en cuenta controlar los factores.
Parmetro
que medir

HTP

Propsito

Determinar la
naturaleza y

Criterio de
seleccin

<50 000 mg kg-1

Cantidad de
microorganism
o

Indicar la presencia
de

degradadores
de HTP

microorganismos
con capacidad de
degradar los
contaminaste

pH

Determinar la
necesidad de
ajustar el pH

Nitrgeno

Determinar la
necesidad de
adicionar un
mejorador

Humedad

Determinar la
necesidad de
ajustar el contenido
de agua

Si se encuentra
por debajo del
limite

Agregar mayor

concentracin del
contaminante
Cuenta
microbiana
de

Si se encuentra
por arriba del
limite

NA

Verificar la
relacin
103 UFC g-1

NA

pH 5.5 a 8

Adicionar estircol
de bovino

Adicionar caliza
molida o agregar
agua dura.

NA

Adicin de
mejorador
orgnico como
estircol

Permitir que el
suelo se seque

Adicionar agua
para alcanzar al
menos 70% la
capacidad de
campo

C:N 100:5

25 90% de la
capacidad de
campo

apropiada,
contenido de agua
y suministro de
oxigeno.

Tabla 3. Factores a medir en la Biorremediacin

45

CONCLUSIN

Podemos concluir que mediante el avance biotecnolgico en la biorremediacion con

el uso de plantas, algas, hongos, y microorganismos modificados son tcnicas
sumamente promisoria para el saneamiento y restauracin de lugares afectados por
derrame de hidrocarburo. Los hbitats ultramaficos o serpenticolas donde se
encuentran plantas acumuladores de metales pesados, se caracterizan por un alto
nivel de diversidad y elevado ndice de endemismo El uso de estas tcnicas y los
microorganismos rizosfricos puede ser una estrategia de saneamiento ambiental
en cualquier lugar as como el uso de microorganismos modificados

46

BIBLIOGRAFIA

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waste physical/chemical methods.

48

ANEXOS
Anexo I. Determinacin de la concentracin de hidrocarburos totales del
petrleo (HTP) en el suelo.
d) Preparacin de muestras de suelo para extraccin
Aunque el anlisis de hidrocarburos puede hacerse con muestras hmedas, se
recomienda secarlas y molerlas para obtener muestras ms homogneas. El
secado de suelo para extraccin se lleva a cabo de la siguiente forma.

Material
Esptula.
Mortero.
Papel aluminio.
Frascos de vidrio de 30 ml.

Procedimiento
1) Poner a secar la muestra (8-15 g de suelo) extendida en un papel aluminio a
30C, durante 48 horas, en un cuarto de temperatura controlada o a la
sombra.
2) Moler la muestra en un mortero hasta obtener partculas finas.
3) Colocar la muestra seca en un frasco seco y limpio.

e) Extraccin de hidrocarburos por reflujo (Soxhlet)

(D5369-93 de la ASTM, 2003 y 3540C y 3541 de la US EPA, 1996, 1994).
Este mtodo consiste en extraer los hidrocarburos contenidos en el suelo, mediante
la accin de un solvente orgnico voltil apropiado, que es reflujado a travs de la
muestra varias veces durante un tiempo determinado. El solvente es evaporado y
posteriormente condensado en un refrigerante, se le hace pasar por la muestra y se
49

le regresa al origen para ser nuevamente evaporado. La muestra slida es mezclada

con sulfato de sodio anhidro para eliminar el agua residual, se le coloca en un dedal
o cartucho de papel o fibra de vidrio y se usa un solvente orgnico apropiado para
su extraccin en un equipo Soxhlet.
Material y equipo
Equipo de reflujo Soxhlet de 250 ml.
Perlas de ebullicin.
Cartuchos de celulosa o fibra de vidrio.
Balanza analtica.
Vaso de precipitados 250 ml.
Viales.
Esptula.

Reactivos
Sulfato de sodio anhidro (Na2SO4).
Diclorometano (cloruro de metileno, CH2Cl2) grado HPLC.

Procedimiento
1) Colocar de 5 a 10 g de suelo seco y finamente molido en un cartucho de
celulosa o fibra de vidrio.
2) Adicionar sulfato de sodio anhidro en una relacin suelo:sulfato 1:1 y mezclar.
3) Colocar cada cartucho conteniendo las muestras dentro de la camisa o
columna extractora del equipo Soxhlet.
4) Adicionar 125 5 ml de diclorometano en el matraz de bola y colocar
suficientes perlas de ebullicin para evitar la proyeccin del solvente al
calentarse.
5) Ensamblar el equipo Soxhlet e iniciar calentamiento hasta alcanzar una
temperatura de 45C.
6) Mantener el reflujo en estas condiciones durante 8 horas, de tal manera que
se efecten entre 6 y 8 reflujos por hora, lo que permitir la liberacin de los
analitos.
50

7) Despus de 8 horas, el extracto orgnico contendr todos los hidrocarburos

solubles en diclorometano. Pasar el matraz bola a un rotoevaporador y
concentrar el extracto orgnico a sequedad.
8) Recuperar el concentrado en un vial de 40 ml con tapn de tefln para su
cuantificacin.

Cuantificacin de hidrocarburos por el mtodo gravimtrico de

Asfltenos. (ASTM D6560, 2000).
Este mtodo se basa en la propiedad de los asfltenos de ser insolubles en algunos
solventes (hexano, por ejemplo), mientras que las otras fracciones de los
hidrocarburos totales del petrleo no lo
son, facilitando con esto la separacin de estos compuestos. Los asfltenos, por ser
insolubles, precipitan formando un slido negro que puede pesarse al eliminar el
hexano con los hidrocarburos solubles en l.

Material y equipo
Matraz de bola de 250 ml.
Viales o tubos de vidrio de 25 ml.
Pinzas para matraces de bola viales o tubos de vidrio.
Balanza analtica.
Pipeta de 10 ml.
Jeringa de vidrio de 20 ml.
Portamembrana de acero inoxidable.
Filtros de fibra de vidrio GF/C Whatman.
Sonicador.
Rotoevaporador.

Reactivos
Hexano (CH3 (CH2)4CH3) grado HPLC.
51

Procedimiento
1) Poner a peso constante el recipiente donde se colocar el extracto orgnico
obtenido (matraz de bola para la extraccin, vial o tubo de vidrio).Colocar el
recipiente en la estufa a 120C durante 4 horas. Sacar este material y
colocarlo en un desecador para que se enfre. Pesar el
recipiente, despus colocarlo otra vez dentro de la estufa y volver a realizar
el procedimiento hasta que el peso no cambie. Anotar el peso del recipiente
(RA).
2) Una vez que el extracto orgnico obtenido est en un matraz de bola, tubo o
vial de vidrio a peso constante, se procede a la evaporacin total del solvente
(diclorometano) en un rotoevaporador hasta sequedad, y pesar.
3) La muestra extrada libre de solvente se debe resuspender con hexano: 60
ml para el mtodo de extraccin por reflujo (Soxhlet) o 5 ml para el mtodo
de extraccin, agitacin y centrifugacin. Con este solvente precipitarn los
asfltenos insolubles en hexano (fraccin pesada de los hidrocarburos).
4) Dejar reposar la muestra en hexano de 12 a 24 horas o bien colocarla en un
sonicador de 15 a 30 minutos para acelerar la precipitacin de asfltenos
(slido negro).
5) Cuando los asfltenos (insolubles en hexano) se observen en el fondo del
vial o tubo, se
procede a separar el precipitado mediante filtracin; tomando el extracto
orgnico con una jeringa y pasndolo a travs de un filtro de fibra de vidrio a
peso constante (FFV), que se
coloca en un portamembranas de acero inoxidable. Una vez que se hizo
pasar el contenido total del extracto, el filtro de fibra de vidrio se deja secar y
se pesa (FBVS) para la cuantificacin de asfltenos (AF) retenidos en l.
6) Pesar el recipiente (matraz de bola, vial o tubo) donde estaba el extracto con
hexano y asfltenos (RB).

52

Clculos
La cantidad de asfltenos se calcula mediante un balance de slidos obtenidos tanto
en el recipiente (AR) como en el filtro de fibra de vidrio (AF). Para hacer el clculo de
concentracin de asfltenos provenientes de la muestra se debe considerar la
cantidad de suelo que se pes para la extraccin, as como la humedad de la
muestra. El resultado se expresa en mg de asfltenos/kg de suelo seco y se calcula
de la siguiente manera:

AF (mg) = FBVS FFV

Donde:
AF (mg) = asfltenos contenidos en el filtro de fibra
de vidrio (mg). FBVS = peso (mg) del filtro de fibra de
vidrio a peso constante.
FFV = peso (mg) del filtro de fibra de vidrio seco por donde se pasa el extracto
orgnico con hexano y asfltenos.
AR (mg) = RB RA.
Donde:
AR (mg) = asfltenos contenidos en el
recipiente (mg). RA = peso (mg) del
recipiente vaco a peso constante.
RB = peso (mg) del recipiente donde estaba el extracto orgnico con hexano y
asfltenos.
Asfltenos (mg kg-1 de s.s.) = (AF + AR) * (FC) / (P * FH).
Donde:
Asfltenos (mg kg-1 de s.s.) = Asfltenos totales contenidos en la muestra en mg/
kg de suelo seco. AF = asfltenos retenidos en el filtro de fibra de vidrio (mg).
AR = asfltenos contenidos en el
recipiente (mg). P = cantidad de suelo
extrado (g).
53

Las altas concentracin de HTP no mayor de 50 000 mg kg-1 en el suelo pueden

resultar toxicas, mismas que pueden inhibir el renacimiento y reproduccin de las
bacterias responsables de la biodegradacin de los contaminantes en la biopila esttica.

54

Anexo II. Determinacin de pH por el mtodo de potencimetro. (Bates,

1983).

El pH es una propiedad qumica del suelo que tiene un efecto importante en el desarrollo de los seres
vivos (incluidos microorganismos y plantas). La lectura de pH se refiere a la concentracin de iones
hidrgeno activos (H+) que se da en la interface lquida del suelo, por la interaccin de los
componentes slidos y lquidos. La concentracin de iones hidrgeno es fundamental en los
procesos fsicos, qumicos y biolgicos del suelo. El grado de acidez o alcalinidad de un suelo es
determinado por medio de un electrodo de vidrio en un contenido de humedad especfico o relacin
de suelo-agua, y expresado en trminos de la escala de pH. El valor de pH es el logaritmo del
recproco de la concentracin de iones hidrgeno, que se expresa por nmeros positivos del 0 al 14.
Tres son las condiciones posibles del pH en el suelo: la acidez, la neutralidad y la alcalinidad.

Material y equipo

Muestra de suelo.

Balanza analtica.

Vasos de precipitado de 25 ml.

Pipeta de 10 ml.

Piceta con agua destilada.

Potencimetro.

Agua destilada.

Solucin amortiguadora de pH 7 y 4.

Agitadores magnticos.

Procedimiento
1) Pesar 1 g de suelo y colocarlo en un vaso de precipitado de 25 ml.
2) Agregar 10 ml de agua destilada.
3) Agitar y dejar reposar 10 minutos.
4) Ajustar el potencimetro con las soluciones amortiguadoras.

5) Pasados los 10 minutos, medir el pH con el potencimetro.

55

Criterios de evaluacin
Tabla 4. Criterios de evaluacin de un suelo con respecto a su pH
Categora

Valor de pH

Fuertemente cido

< 5.0

Moderadamente cido

5.1 - 6.5

Neutro

6.6 - 7.3

Medianamente alcalino

7.4 - 8.5

Fuertemente alcalino

8.5

(NOM-021-SEMARNAT-2000).

56

Anexo III. Determinacin de porcentaje de humedad en suelos.

El agua es esencial para todos los seres vivos porque en forma molecular participa en varias
reacciones metablicas celulares, acta como un solvente y portador de nutrimentos desde el suelo
hasta las plantas y dentro de ellas. Adems, intemperiza las rocas y los minerales, ioniza los macro
y micronutrientes que las plantas toman del suelo, y permite que la materia orgnica sea fcilmente
biodegradable. El contenido de agua en el suelo puede ser benfico, pero en algunos casos tambin
perjudicial. El exceso de agua en los suelos favorece la lixiviacin de sales y de algunos otros
compuestos; por lo tanto, el agua es un regulador importante de las actividades fsicas, qumicas y
biolgicas en el suelo.

Aunque es recomendable determinar la humedad a la capacidad de campo de los suelos, es decir,

la cantidad de humedad que un suelo retiene contra la gravedad, cuando se deja drenar libremente;
en algunas ocasiones, cuando se trata de suelos contaminados, por ejemplo con hidrocarburos del
petrleo, es difcil llevar a cabo esta medicin por la dificultad de rehidratar suelos secos con estas
caractersticas. Por lo que la medicin de humedad se realiza slo en funcin del porcentaje de agua
que retiene este tipo de suelos.

El mtodo utilizado para esta medicin es el gravimtrico, para determinar nicamente la cantidad
de agua de los suelos. La humedad del suelo se calcula por la diferencia de peso entre una misma
muestra hmeda, y despus de haberse secado en la estufa hasta obtener un peso constante.

Material y equipo

Muestras de suelo.

Balanza analtica.

Esptula.

Charolas o papel aluminio a peso constante.

Estufa.

Procedimiento
1) Pesar 1 g de muestra sobre un papel o charola de aluminio a peso constante.
2) Colocar la muestra dentro de la estufa a 80C de 12 a 24 horas.
3) Sacar la muestra de la estufa y colocarla dentro de un desecador para que se enfre.

57

4) Pesar la muestra con todo y papel.

5) Calcular los porcentajes de humedad en el suelo por la diferencia de pesos.

Humedad del suelo = (Peso inicial Peso final)/ Peso inicial * 100

58

Anexo IV. Cuantificacin de Carbono orgnico total.

El carbono orgnico es uno de los principales componentes de los seres vivos: aproximadamente
50% del peso seco de la materia orgnica (m.o.) es carbono. La m.o. del suelo es la fraccin orgnica
que incluye residuos vegetales y animales en diferentes estados de descomposicin; tejidos y clulas
de organismos que viven en el suelo; y sustancias producidas y vertidas por esos organismos.
Adems se pueden incluir compuestos orgnicos txicos, provenientes de las actividades
industriales del hombre, como la contaminacin de suelos por hidrocarburos del petrleo, que
tambin constituye parte de la materia orgnica del suelo.

Para la cuantificacin de carbono orgnico total se utiliza un analizador de carbono con una cmara
de combustin y un detector de infrarrojo. La muestra de suelo es colocada dentro de la cmara de
combustin a una temperatura de 900C, proceso que provoca la liberacin de CO 2 proveniente de
todo el carbono presente en el suelo. El CO2 es cuantificado con un detector de infrarrojo.

El lmite de deteccin de la tcnica va de 0 a 25 mg de C. Considerando que no todo el suelo es

m.o., se recomienda utilizar muestras de 0.1 a 0.3 g, pero mientras ms m.o. se tenga, se debe tomar
menor cantidad de suelo para realizar esta tcnica.

Material y equipo

Muestra de suelo seco y molido en mortero.

Cpsulas de porcelana especiales para el equipo de carbono total.

Esptulas.

Analizador de carbono con detector de infrarrojo y accesorio para muestras slidas.

Balanza analtica.

Pinzas.

Reactivos
Biftalato de potasio (C6H4(COOK)).

59

Procedimiento
Esta tcnica puede realizarse con muestras de suelo hmedo, pero se recomienda utilizar suelo seco
y molido para homogeneizar la muestra, ya que se utilizan cantidades muy pequeas (menores que
0.3 g).

1) Pesar suelo seco (0.1 a 0.3g) dentro de una cpsula de porcelana.

2) Encender el analizador de carbono y esperar a que la temperatura del horno llegue a 900C.
Una vez que el equipo est estabilizado a esta temperatura, se procede a analizar las
muestras.
3) El mtodo utilizado para hacer los anlisis en este equipo debe indicar que se est utilizando
el accesorio para muestras slidas; y en caso incluir la curva patrn, para que el resultado
de la medicin se proporcione con base en sta.
4) Colocar la muestra dentro de la cmara de slidos y proceder a la medicin.
5) El tiempo de corrida de cada muestra es aproximadamente de cinco minutos. Al final el
software presenta la cantidad de carbono (mg kg-1 suelo o en porcentaje) contenido en el
suelo.
6) El resultado debe ser ajustado por la humedad de la muestra, para indicarlo en mg de C/kg
suelo completamente seco.

Curva patrn. Se realiza con biftalato de potasio (C6H4(COOK)) en un rango de concentraciones de

0 a 25 mg (0 a 0.025 g) de carbono contenido en este compuesto. El biftalato debe secarse en la
estufa durante 12 horas a 60C antes de ser analizado. Pesar la cantidad necesaria del reactivo para
obtener la concentracin deseada (de 0 a 25 mg de carbono en la muestra), como se indica en la
Tabla 9, y hacer la medicin de carbono orgnico total en el analizador, como se indic para las
muestras.

Tabla 5. Concentracin de biftalato para la curva patrn de carbn orgnico.

Biftalato de potasio (mg)
0
12.15
24.31
36.46
48.62
60.77

mg C contenidos en biftalato
0
5
10
15
20
25

Nota: en caso de que el equipo slo proporcione el rea del pico obtenido, proceder al clculo del
carbono orgnico total como se indica en el apartado correspondiente.

60

Clculos
Calcular la cantidad de carbono orgnico total (COT) contenido en el suelo con la ecuacin lineal de
la curva estndar.
CO (mg) = (A b) / m).
Donde:
CO = carbono orgnico (mg) contenido en el
suelo. A = rea del pico obtenido.
b = ordenada al
origen.
m
pendiente.

Calcular la concentracin final de COT de la muestra de suelo mediante la siguiente ecuacin:

COT (mg / kg de suelo seco) = CO (mg) * 1 000 / P * FH

Donde:
COT = carbono orgnico total (mg / kg de suelo
seco). CO = carbono orgnico (mg).
P = cantidad de suelo (0.1 g a 0.5 g).
1 000 = factor de correccin de concentracin (1 000 g = 1 kg).
FH = factor de correccin de humedad = (1-(%humedad/100)).

A partir del contenido total de carbono orgnico se puede estimar el contenido de materia orgnica
Tabla 10; suponiendo de forma convencional que la materia orgnica contiene 58% de carbono. As,
el contenido de carbono orgnico se multiplica por el factor 1.724 para obtener el contenido de
materia orgnica.

Tabla 6. Interpretacin del contenido de materia orgnica en suelo.

Clase
Muy bajo
Bajo
Medio
Alto
Muy alto

Materia orgnica (%)

Suelos volcnicos
Suelos no volcnicos
< 4.0
< 0.5
4.1 - 6.0
0.6 - 1.5
6.1 - 10.9
1.6 - 3.5
11.0 - 16.0
3.6 - 6.0
> 16.1
> 6.0

61

Anexo V. Determinacin de Nitrgeno total con el mtodo Micro- Kjeldahl.

(Modificado por Bremner, 1965).

El nitrgeno es un elemento indispensable para la vida, forma parte de las principales biomolculas
de todos los seres vivos. El nitrgeno puede llegar al suelo gracias a los aportes de materia orgnica
y a la fijacin bacteriana a partir del aire. Dentro del suelo es aprovechado por las plantas, animales
y microorganismos que lo incorporan a sus tejidos. Cuando dichos organismos se mueren, el
nitrgeno reingresa al suelo completando el ciclo. Este ciclo es complejo e involucra una serie de
reacciones y organismos con diferentes metabolismos. Siempre comienza con compuestos
orgnicos sencillos (NH4+, NO2-, NO3-, N2, NH3) y termina con compuestos orgnicos complejos;
que a travs de la descomposicin regresan a la etapa de compuestos sencillos.

En los microorganismos la carencia de nitrgeno puede afectar el crecimiento, por lo que la poblacin
microbiana no tendr un desarrollo ptimo. En contraste, demasiado nitrgeno permite el crecimiento
microbiano rpido y acelera la descomposicin; pero puede crear problemas de olor en condiciones
anaerobias. Adems, el exceso de nitrgeno puede ser liberad como amoniaco; en tanto que el
nitrgeno aprovechable escapar en forma de gas. Para la mayora de los materiales una relacin
C/N cercana a 10:1 mantendr estos elementos en equilibrio aproximado. En los suelos normalmente
el contenido de nitrgeno vara de 0.05 a 2% en sus diferentes formas.

El mtodo Kjeldahl comprende tres fases fundamentales:

1) Digestin de la muestra. La muestra de suelo se somete a una digestin por calentamiento
con cido sulfrico y por una mezcla de sales que aceleran y facilitan tanto la oxidacin de
la
materia orgnica como la conversin de todas las formas de nitrgeno en N+3, que en medio
cido se encuentran en forma de radical amonio (NH 4+); es decir, se llevan las formas
orgnicas a formas minerales de nitrgeno.
2) Destilacin. Una vez transformado el nitrgeno en NH 4+, se expone a una base fuerte como
el
hidrxido de sodio para formar hidrxido de amonio, que por la accin del calor se
descompone en amoniaco (NH3) y agua.
3) Valoracin. El amoniaco desprendido por la reaccin se recoge en un volumen conocido de
solucin valorada de cido brico y por comparacin con un blanco se determina la cantidad
de cido que reaccion con el NH3.

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Material y equipo

Muestra de suelo seco y molido con un mortero.

Balanza analtica.

Matraces Kjeldahl.

Vasos de precipitados.

Probetas.

Digestor.

Matraz aforado de 1 L.

Matraces Erlenmeyer de 1 L.

Perlas de ebullicin.

Pipeta.

Destilador.

Bureta.

Soporte universal con pinza.

Soluciones y reactivos
1) Solucin de cido brico con indicador. Pesar 20 g de cido brico (H 3BO3) y disolver en
750 ml de agua destilada. Calentar para la completa disolucin del cido. Dejar enfriar y
agregar
20 5.0,
ml
la siguiente
decoloracin
indicadores:
0.099
de
verde
depH
bromocresol
ydebe
0.066
gser
de
rojo
de
metilo
disueltos
en una
100
ml
de alcohol
etlico
96%.
deindicado.
lade
mezcla
de
si
ms
cidomezcla
agregar
algunas
gotas
de solucin
deEl
hidrxido
sodioCompletar
0.1
N,de
hasta
que
lade
solucin
adquiera
prpura
ogalalcance
elpH
el
volumen
aes
1 L con agua destilada y mezclar.
2) Solucin de hidrxido de sodio 0.1 N: Pesar 4 g de hidrxido de sodio (NaOH), disolver en
agua destilada y aforar a 1 L.
3) Mezcla de catalizadores: pesar 62.5 g de sulfato de potasio (KSO 4) y 6.25 g de sulfato de
cobre pentahidratado (CuSO4.5H2O). Homogeneizar la mezcla.
4) Solucin de hidrxido de sodio 10 N: Pesar 200 g de hidrxido de sodio (NaOH), disolver en
agua destilada y aforar a 500 ml. El agua para preparar la solucin debe ser hervida
previamente para eliminar el CO2, dejndola enfriar antes de agregarla.
5) Solucin de cido sulfrico 0.01 N: Diluir 0.28 ml de cido sulfrico concentrado (H 2SO4)
hasta completar un volumen de 1 L con agua destilada. La concentracin del cido debe ser
estandarizada con la solucin valorada de carbonato de sodio.
6) Solucin valorada de carbonato de sodio: Pesar 0.25 g de carbonato de sodio (NaCO 3),
previamente secado en la estufa durante 2 horas a 105C, disolver en agua destilada y aforar
a 50 ml.
7) Solucin de anaranjado de metilo: Pesar 0.1 g de anaranjado de metilo, disolver en agua
destilada y aforar a 100 ml.

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Valoracin de la normalidad del cido sulfrico 0.01 N:

Tomar 3 alcuotas de 10 ml de la solucin de NaCO3.

Agregar 5 o 6 gotas de anaranjado de metilo como indicador.

Titular con la solucin de cido sulfrico 0.01 N.

Calcular la normalidad real sustituyendo en la siguiente frmula:

Normalidad del H2SO4 = (0.050 g/ 53) X (1/ Promedio de ml gastados en las tres alcuotas)

8) cido sulfrico concentrado (H2SO4).

9) Granallas de zinc.

Procedimiento
A. Digestin.
1) Pesar una muestra de suelo de 0.25 a 1 g, que depender de la materia orgnica contenida
en el suelo, entre ms materia orgnica tenga un suelo menos sern los gramos de muestra.
2) Colocar la muestra de suelo en un matraz Kjeldahl seco.
3) Adicionar 2 g de mezcla de catalizadores.
4) Agregar 5 ml de cido sulfrico concentrado.
5) Poner a calentar en el digestor a una temperatura media, hasta que la muestra se torne
clara. La temperatura debe ser regulada de modo que los vapores de cido sulfrico se
condensen en el tercio inferior del cuello del matraz Kjeldahl.
6) Hervir la muestra por una hora a partir de ese momento.
7) Una vez terminada la digestin, apagar el digestor y tapar con un frasco los matraces para
dejar enfriar.

B. Destilacin.
1) Aadir al matraz Kjeldahl fro 25 ml de agua destilada y mezclar vigorosamente hasta una
disolucin completa.
2) Transferir el lquido a un matraz Erlenmeyer de 500 ml. Colocar de 5 a 6 perlas de ebullicin.
3) Adicionar 3 granallas de zinc. Aadir 15 ml de la solucin de hidrxido de sodio 10 N,
sosteniendo el matraz inclinado de modo que se deposite en el fondo.
C. Colocar en la salida del aparato de destilacin un vaso de precipitados de 50 ml, que
contenga 10 ml de la solucin de cido brico ms indicador.
D. Conectar el flujo de agua e iniciar la destilacin. Destilar hasta que el volumen alcance la
marca de 20 ml en el vaso de precipitados de 50 ml. Una vez alcanzado dicho volumen,
retirar el matraz y apagar el aparato.

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E. Titular el nitrgeno amoniacal con la solucin de cido sulfrico 0.01 N hasta que vire de
verde a rosado fuerte.
F. Realizar un blanco siguiendo los pasos del 3 al 15.
4) Colocar en la salida del aparato de destilacin un vaso de precipitados de 50 ml, que
contenga 10 ml de la solucin de cido brico ms indicador.
5) Conectar el flujo de agua e iniciar la destilacin. Destilar hasta que el volumen alcance la
marca de 20 ml en el vaso de precipitados de 50 ml. Una vez alcanzado dicho volumen,
retirar el matraz y apagar el aparato.
6) Titular el nitrgeno amoniacal con la solucin de cido sulfrico 0.01 N hasta que vire de
verde a rosado fuerte.
7) Realizar un blanco siguiendo los pasos del 3 al 15.

En la Tabla 7 se presentan valores de nitrgeno que sirven para evaluar la calidad de un suelo.

Tabla 7. Criterios para evaluar un suelo con base en su contenido de nitrgeno total
Categora
Extremadamente pobre
Pobre
Medianamente pobre
Medio
Medianamente rico
Rico
Extremadamente rico

Valor (%) de nitrgeno en suelo

< 0.032
0.032 - 0.063
0.064 - 0.095
0.096 - 0.126
0.127 - 0.158
0.159 - 0.221
> 0.221

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