RESUME ARTIKEL

LEVOSIMENDAN ALONE AND IN COMBINATION WITH

VALSARTAN PREVENTS STROKE IN DAHL SALTSENSITIVE RATS
Disusun untuk memenuhi tugas mata kuliah Kapita Selekta departemen
Farmakologi dan Farmasi Klinis

Disusun oleh:
Rika Fitri Maulinawati
260110120004
Priska Aryani Darmawan 260110120005
Siti Amirotun Zakiyah
260110120015
Anita Putri Pratama
260110120016
Tazyinul Qoriah Alfauziah 260110120027

FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS PADJADJARAN
JATINANGOR
2015

ABSTRAK
Efek levosimendan pada lesi serebrovaskular dan mortalitas diselidiki
dalam model stroke primer dan sekunder. Penelitian ini bertujuan untuk
menentukan apakah efek levosimendan sebanding dan /atau kumulatif dengan
valsartan, dan untuk menyelidiki apakah

levosimendan-diinduksi vasodilatasi

memiliki peran dalam efeknya pada stroke. Dalam stroke primer model tikus
Dahl/Rapp, angka kematian adalah 70% dan 5% untuk vehicle dan
levosimendan. Kedua kejadian stroke (85% vs 10%, P <0.001) dan defisit perilaku
terkait stoke (7 titik neuroscore: 4,59 vs 5.96, P<0.001) lebih buruk untuk vehicle
dibandingkan dengan levosimendan. Dalam model stroke yang kedua di mana
pengobatan levosimendan dimulai setelah insidensi serebrovaskular sudah
terdeteksi, rata-rata waktu hidup 15 hari dengan vehicle, 20 hari dengan
levosimendan (P=0.025, vs vehicle),
(P=0.001, vs vehicle),

dan

31

22
hari

hari
dengan

dengan
levosimendan

valsartan
ditambah

valsartan (P<0.001, vs vehicle). Kelangsungan hidup masing-masing adalah 0%,

16%, 20% dan 59%, dan insiden masing-masing lesi berat adalah 50%, 67%, 50%
dan 11%. Dalam model tikus ini, levosimendan meningkatkan volume darah
pembuluh otak, dengan efek yang signifikan dalam microvessels dari korteks
( R=3.570.15 vs 2.770.17 ml untuk vehicle; P=0.001) dan hemisphere
( R=3.20.23 vs 2.60.14 ml untuk vehicle; P=0.018). Secara keseluruhan,
levosimendan secara signifikan mengurangi stroke yang menyebabkan mortalitas
dan morbiditas, baik tunggal maupun dengan valsartan, dengan efek kumulatif
yang jelas, aktivitas di mana efek vasodilatasi dari levosimendan memiliki peran.

PENDAHULUAN

Struktur Levosimendan
Levosimendan adalah kalsium sensitizer yang digunakan dalam mengatur
dekompensasi dari penyakit jantung kongestif. Levosimendan ini meningkatkan
kontraktilitas kardiak. Levosimendan mempunyai dua mekanisme kerja utama,
yaitu: sensitisasi Ca++ dari protein yang contractile yang bertanggung jawab
terhadap aksi inotropik positif dan membuka pintu (channel) ion K+ dari otot
polos yang bertanggung jawab pada vasodilator perifer. Levosimendan
diindikasikan pada pasien gagal jantung dengan cardiac output yang rendah,
akibat disfungsi sistolik tanpa hipotensi yang berat (Class Iia recommendation,
level of evidence B).
Levosimendan adalah inodilator kardioprotektif yang dikembangkan untuk
pengobatan intravena gagal jantung dekompensasi akut. Mekanisme aksi ( Papp et
al., 2012 ) dan efek klinis ( Nieminen et al., 2013 ) dari levosimendan telah
dijelaskan sebelumnya. Secara singkat, levosimendan memiliki efek inodilator
kardioprotektif dengan bekerja pada tiga sasaran utama: troponin C jantung pada
aparattus

kontraktil

kardiomiosit; Saluran

kalium

ATP-dependent

pada

sarcolemma sel otot polos pembuluh darah; dan saluran kalium ATP-dependent
mitokondria dalam kardiomiosit, dan berpotensi organ penting lainnya ( Papp et
al., 2012 ).
Secara lebih rinci, levosimendan menginduksi vasodilatasi telah dijelaskan
dalam berbagai model untuk arteri ( Montes et al., 2006; Ozdem et al., 2006; Usta

et al., 2006; Yildiz et al., 2006 ), Vena ( Bragadottir et al, 2013.; Rheinhotel
Rudesheim et al., 2004; Pataricza et al., 2000 ), arteri koroner ( Gruhn et al.,
1998; Kaheinen et al., 2001; Krassi et al., 2000; Michaels et al., 2005 ), Dan
pembuluh resistensi kecil ( Erdei et al., 2006; Gdny et al., 2013 ). Baru-baru ini,
setelah eksperimental serangan jantung resusitasi cardiopulmonary dalam model
tikus, levosimendan ditunjukkan untuk meningkatkan aliran darah otak,
mengurangi cedera neuronal, dan meningkatkan hasil neurologis ( Kelm et al.,
2014 ).
Dalam penelitian sebelumnya dengan model tikus garam-sensitif Dahl /
Rapp, levosimendan terbukti mengurangi morbiditas dan mortalitas ( Louhelainen
et al., 2007 ), yang berasal hipertensi yang diinduksi gagal jantung
diastolik. Menurut literatur, bagaimanapun, model kematian di tikus Dahl sensitif
garam bisa juga disebabkan oleh stroke ( Yamamoto et al., 2007 ), dan memang
beberapa studi mortalitas stroke yang disebabkan telah dilakukan dalam model
tikus ( Lin et al, 1999;.. von Lutterotti et al, 1992 ). Oleh karena itu, muncul
pertanyaan apakah efek levosimendan pada kematian terlihat pada studi
sebelumnya mungkin telah berkorelasi, pada setidaknya sebagian dengan efek
pada stroke.
Untuk menyelidiki hal ini lebih lanjut, dilakukan model eksperimental yang mana
efek levosimendan diuji pada stroke primer dan stroke. Dalam penelitian ini
dilakukan tiga langkah strategi, dilakukan tiga protokol eksperimental secara
berurutan: (A) studi uji coba yang bertujuan untuk menguji apakah levosimendan
memiliki efek pada stroke primer, dan pemilihan waktu yang tepat untuk
menentukan model stroke sekunder (studi A); (B) studi mortalitas model stroke
sekunder, yang divalidasi oleh ditambahkannya valsartan, sebagai angiotensin
receptor blocker yang umum digunakan dalam pencegahan stroke sekunder (studi
B); dan (C) sebuah studi pada model stroke sekunder untuk menentukan
mekanisme kerja dari efek levosimendan (studi C). Hipotesisnya adalah bahwa
levosimendan memiliki efek positif pada stroke. Secara rinci, tujuannya adalah:
(1) untuk menentukan dampak dari levosimendan pada tingkat kematian akibat
stroke yang disebabkan dalam model tikus Dahl/Rapp stroke primer dan

sekunder; (2) untuk menentukan apakah efek levosimendan sebanding dengan dan
/ atau kumulatif dengan dari valsartan; dan (3) untuk menentukan menentukan
apakah Efek vasodilatasi dari levosimendan memiliki peran dalam aksi
levosimendan.
ALAT DAN BAHAN
1.Hewan Percobaan
Penelitian ini dilakukan sesuai dengan pedoman Dewan
Eropa dan Dewan Riset Nasional AS. Persetujuan diberikan oleh
Komite Etika Hewan Orion Pharma, atau National Laboratory
Centre Hewan, Kuopio, Finlandia.

Tikus Jantan Dahl Salt-sensitive (SS / JrHsd; umur 4-6

minggu)

Tempat yang digunakan standar pada suhu (22 2 C) dan

dalam lingkungan cahaya yang dikendalikan.

Tikus-tikus diberikan air dan makanan semaunya

Seminggu

pertama

tikus

diberikan

makan,

dengan

makanan standar pellet

Setelah itu, tikus sampai akhir penelitian

diberi makan

dengan

diet

kaya

garam

(NaCl

SpecialDiet

Services,UK)
2. Levosimendan dan Valsartan
Levosimendan

adalah

(-)

enansiomer

tetrahidro-4-metil-6-okso-3-pyridazinyl)
propanedinitrile,

yang

disintesis

{[4-

fenil]
oleh

(1,4,5,6-

hydrazono}

Orion

Pharma,

Finlandia. Valsartan [(S) -3-metil-2- (N - {[20 - (2 H-1,2,3,4-

tetrazol-5-il) bifenil-4-il] metil}pentanamido) Asam butanoic]

dibeli dari Haorui Pharma Chem Inc (New Jersey, USA).
Semua perawatan diberikan melalui air minum. Kelarutan
dan stabilitas levosimendan dan valsartan dikonfirmasi sebelum
studi. Dosis levosimendan dipilih atas dasar yang farmakokinetik
dan farmakodinamik data yang dijelaskan oleh (Louhelainen et
al.,2007).
Konsumsi air minum diukur setiap hari. Pemaparan dari
levosimendan dan valsartan pada tikus dihitung berdasarkan
rata-rata

minum

air

yang

dikonsumsi

pertikus,

menurut

konsentrasi obat dalam air minum.

Setelah itu, kadar plasma dari levosimendan dari tikus
ditentukan

setelah

minggu

dan

minggu

perawatan,

menggunakan kromatografi cair-spektrometri massa tandem.

3. Studi Protokol

4. Status Kesehatan dan Kematian

Status kesehatan secara keseluruhan dari masing-masing
tikus dipantau setiap hari dengan pemantauan umum, kesehatan
tikus dilihat ketika tikus masih hidup dan mampu minum dan
makan. Selama perawatan menggunakan levosimendan dan
valsartan,

selain

pemeriksaan

umum,

masing-masing

tikus

adalah ditangani setiap hari kerja (yaitu, Senin sampai Jumat)

untuk memantau perubahan status umum mereka.
Jika kondisi tikus itu tidak normal, kelainan diamati dicatat
dan kondisi diikuti dengan hati-hati. Bobot tubuh normal perilaku
tikus diukur tiga kali per minggu. Jika secara umum kondisi tikus
kurang optimal, dan jika muncul bahwa tikus tidak akan bertahan
hidup, itu dikorbankan menggunakan karbon dioksida inhalasi.

6. Insidensi Stroke
Dalam model primer dan sekunder studi A dan C, masingmasing, kejadian stroke dinilai menggunakan MRI. Dalam model
primer, analisis MRI diaplikasikan pada beberapa kali, untuk
mengikuti perkembangan kejadian stroke dari waktu ke waktu.
Dalam model sekunder, analisis MRI dilakukan pada akhir
studi. Lesi otak juga dievaluasi oleh histopatologi di kedua model
stroke (studi A dan B), untuk memvalidasi temuan MRI.
7. Magnetic Resonance Imaging (MRI)
Pemeriksaan

MRI

merupakan

salah

satu

bentuk

pemeriksaan radiologi yang menggunakan prinsip magnetisasi.

Medan magnet digunakan untuk proses magnetisasi komponen
ion

hidrogen

dari

kandungan

air

di

tubuh.

MRI

dapat

menggambarkan dengan sangat jelas dan kontras berbagai

bagian organ tubuh.
Untuk pengukuran MRI, konsol Varian Inova dihubungkan
untuk magnet 4,7 T horisontal digunakan (Magnex Ilmiah Ltd,
Abington, UK), yang dilengkapi dengan pelindung kumparan
(Magnex Ilmiah). Pengukuran secara In-Vivo, tikus dibius dengan
Isoflurane (1% pada 30/70 O2 / N2O), kepala tikus diposisikan
dalam lubang magnet dalam orientasi standar relatif terhadap
kumparan gradien. Sebuah aktif dipisahkan quadrature volume
permukaan pasangan coil frekuensi radio digunakan untuk
transmisi sinyal dan sinyal yang diterima.
8. Histopatologi
Otak evaluasi histopatologi dilakukan untuk kedua model
stroke. Dalam

model

sekunder

(studi

B),

yang

Evaluasi

histopatologi dilakukan juga pada jantung dan Ginjal semua tikus

dirawat

selama

minggu. Transmisi

mikroskop

elektron

diterapkan untuk sampel otak yang dipilih dari Model sekunder,

untuk mengevaluasi potensi stroke pencegahan mekanisme di

otak setelah perawatan dengan levosimendan, valsartan dan
kombinasi keduanya.
Pada nekropsi, jaringan yang dihilangkan dan tetap dalam
buffer larutan formalin 4% (pH 7.2-7.4) selama 2 hari, kemudian
dibilas tiga kali selama 2 jam dalam 0,1 M fosfat penyangga.
Otak

direndam

dalam

30%

sukrosa,

dan

kemudian

dipotong menjadi 50 bagian mm dan dibagi menjadi 20 seri di

beri larutan untuk melindungi dari kerusakan larutan yang
mengandung 30% etilena glikol dan 30% gliserol dalam dapar
fosfat, dan kemudian disimpan di - 20C sampai diproses lebih
lanjut. Salah satu seri bagian dipilih untuk pewarnaan. Untuk
memastikan bahwa setiap bagian memiliki kesempatan yang
sama untuk menjadi sampel untuk analisis.
Ginjal dan hati yang diproses dalam parafin, dipotong
menjadi 4 bagian mm, dan diwarnai dengan hematoxylin dan
eosin, untuk menyelidiki umum morfologi di bawah mikroskop
cahaya. Otak

mengalami

diaminobenzidin

(DAB)

pewarnaan

untuk peroxidase endogen, untuk memantau perubahan sirkulasi

darah.
Semua temuan itu dinilai dari 0 hingga 5:

di mana 0

menunjukkan tidak ada temuan; 1, minimal berubah; 2, sedikit

perubahan; 3, perubahan moderat; 4, ditandai perubahan; dan 5,
perubahan berat.
bagian

tipis/preparat

dipelajari

dengan

JEOL-1200EX

mikroskop transmisi yang beroperasi di 60 kV.

9. Pengukuran Tekanan Darah
Pengukuran tekanan darah dilakukan dengan menggunakan noninvasif metode ekor-cuff. Tikus yang terbiasa dengan prosedur
pengukuran tekanan darah. Sebelum pengukuran, tikus itu

dimasukkan ke dalam tabung penahan selama 10 menit, untuk

menjadi stabil di bawah kondisi pengamatan. Tekanan darah
diukur di kedua primer dan sekunder.
Pengukuran tekanan darah dengan cara Tail Cuff method
menggunakan

alat

blood

pressure

analyzer.

Metode

ini

memungkinkan peneliti untuk mengetahui tekanan darah sistolik

dan diastolik. Prinsip kerja pengukuran tekanan darah adalah
Cuff digelembungkan sampai mencapai tekanan darah diatas 33
tekanan darah sistolik, sehingga nadi menghilang kemudian
tekanan cuff dikurangi perlahan-lahan. Pada saat tekanan darah
mencapai di bawah tekanan sistolik nadi akan muncul kembali.
Cara pengukuran ini sesuai dengan cara pengukuran
tekanan darah menggunakan sphigmomanometer pada manusia.
Pengukuran

tekanan

darah

pada

metode

Tail

Cuff

selain

digunakan pada tikus juga dapat digunakan pada mencit, anjing,

dan primata kecil.
10. Peningkatan Volume Darah Otak oleh CBV-MRI
(CBV) -MRI digunakan untuk menyelidiki lokal peningkatan
volume darah microvessels kecil otak di berbagai daerah otak,
termasuk belahan otak, korteks, hipokampus, dan striatum.
injeksi

besi

berbasis-oksida

yang

merupakan

agen

pengkontras di dalam intravascular vena femoralis Perubahan

relaksasi disebabkan oleh agen kontras intravaskular yang
diasumsikan

berbanding lurus dengan volume darah di setiap

bagian otak.
11. Manajemen Data dan Analisis Statistik

Perbedaan antara kelompok eksperimen dianalisis dengan

menggunakan analisis varians (ANOVA) dengan tes posthoc (uji lanjut)

Perbedaan antara kelompok perlakuan untuk

Status

hewan,

dibandingkan

dengan

jumlah

menggunakan

Pearson chi-square.

Kumulatif

Data

hewan

yang

hidup/mati

dianalisis

dianalisis

dengan

menggunakan metode Kaplan-Meier

Kejadian

temuan

histologis

menggunakan tes Cochran-Armitage.

HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil studi A

Studi A merupakan model pencegahan stroke primer,

dimana studi mengenai pengobatan dimulai sebelum lesi otak
terjadi. Saat ini memang sudah banyak cara pencegahan untuk
stroke sekunder, untuk meniru pencegahan stroke sekunder
percobaan pengobatan hanya dimulai setelah diduga atau telah
terjadinya lesi otak. Berdasarkan data dari studi A, dapat
disimpulkan bahwa pada tingkat kematian 10%, sebagian besar
tikus memiliki lesi. Adanya lesi otak yang terdeteksi menjadi titik
awal

terapi

obat

eksperimental

yaitu

pada

sebagai

pencegahan

studi
stroke

C,

untuk

mewakili

sekunder.

Dalam

percobaan ini, digunakan kontrol positif dalam studi B yaitu

valsartan, yang merupakan penghambat reseptor angiotensin
yang

telah

banyak

digunakan

dalam

pencegahan

stroke

sekunder. Dalam studi B, obat uji yang diberikan adalah

levosimendan, dalam bentuk tunggal maupun dalam kombinasi
dengan valsartan. Akhirnya, penelitian ketiga (studi C) dilakukan
pada model pencegahan stroke sekunder, untuk menentukan apa
peran levosimendan dalam menginduksi vasodilatasi.
Hasil studi B
Ditemukan

bahwa

dalam

model

pencegahan

primer

dan

sekunder pada tikus Dahl yang sensitive garam, levosimendan

meningkatkan kelangsungan hidup dan mencegah stroke. Efek

menguntungkan dari levosimendan dan valsartan adalah serupa
pada model pencegahan stroke sekunder, dan peningkatan
supra-aditif

dalam

kelangsungan

hidup

terlihat

ketika

levosimendan dan valsartan digabungkan.

A. Tingkat keparahan histologi dari lesi otak

dalam pengobatan tikus yang bertahan
setidaknya 3 minggu. Lesi yang dinilai
menggunakan skala lima langkah: 1,
minimal; 2, sedikit; 3, sedang; 4, parah; 5,
sangat parah.

B.

mikroskop elektron korteks otak tikus yang

bertahan sampai akhir penelitian. Tikustikus diobati dengan a. levosimendan ; b.
valsartan ; c. levosimendan dan kombinasi
valsartan; d. valsartan.
Dengan levosimendan atau valsartan,
pembentukan vesikel meningkat (kepala
panah). Setelah pengobatan kombinasi,
lamina basal halus, homogen dan lebih
tebal daripada setelah pengobatan
levosimendan atau valsartan (panah putih).

C. Insiden darah
pembentukan oklusi pada kelompok
perlakuan, sebagaimana ditentukan untuk
tikus yang bertahan sampai akhir penelitian

D. Kelangsungan hidup selama perawatan (air

keran; n=20)., levosimendan (1 mg / kg /
hari; n=45,*, P=0. 025), valsartan (10 mg /
kg / hari; n=46, **, P=0.001; Log Rank
(Mantel-Cox)), dan levosimendan ditambah
valsartan (n=46, ***, P<0.001).

Hasil Studi C

Perbaikan dalam kelangsungan hidup terutama berkaitan dengan

pencegahan

stroke,

seperti

dapat

dilihat

dari

MRI

dan

histopatologi otak temuan. Hewan-hewan yang mati di pada

studi ini hanya menunjukkan minor pathologies untuk jantung

dan ginjal. Memang, pada akhir studi model stroke primer, 85%
dari tikus menunjukkan lesi otak histologi parah.
Manfaat levosimendan yang dikombinasikan dengan valsartan
tidak hanya terbatas pada tingkat kematian yang lebih rendah
dan kejadian stroke yang lebih rendah. Tetapi juga tikus menjadi
lebih sehat, seperti yang ditunjukkan oleh neuroscores yang lebih
tinggi dan kenaikan berat badan yang normal serta asupan air.
Hasil

penelitian,

menunjukkan

efek

positif

levosimendan

terhadap kelangsungan hidup tidak tergantung turunnya tekanan

darah. Ditemukan kenaikan volume darah di bagian sel otak
karena levosimendan. Keuntungan dasar levosimendan adalah
sebagai

vasodilator.

levosimendan

dapat

Hipotesis

dasar

meningkatkan

ini

aliran

didukung
darah

ke

karena
otak,

mengurangi cedera neural, meningkatkan hasil neurologis dari

percobaan pada tikus.
Pemberian Levosimendan atau valsartan

menunjukkan efek

yang signifikan pada

pada tekanan darah tikus. Pemberian

garam berlebih dapat

menyebabkan hipertensi, yang dapat

menggangu pengobatan. Namun, hal ini dapat berhasil bila tikus

memiliki tekanan darah yang lebih rendah dibandingkan kontrol
yang

menerima

konsumsi tinggi garam. Sehingga, tikus

meninggal secara prematur, dan karena tekanan darah tinggi

yang membuat sulit dideteksi

DAFTAR PUSTAKA
Artikel utama
Levijoki J, Matti K, Piero P, Jukka S, Minja H, Mikko K, Kristiina H,
Olli G, Riitta M, Jukka P, Leena T, Juha Y, Antti H. 2015.
Levosimendan alone and in combination with valsartan
prevents stroke in Dahl salt-sensitive rats. European Journal
of Pharmacology. 750: 132-140.
Artikel rujukan
Louhelainen, M., Vahtola, E., Kaheinen, P., Leskinen, H., Merasto,
S., Kyt, V., Finckenberg, P., Colucci, W.S., Levijoki, J.,
Pollesello, P., Haikala, H., Mervaala, E.M., 2007. Effects of
levosimendan on cardiac remodeling and cardiomyocyte
apoptosis in hypertensive Dahl/Rapp rats. Br. J. Pharmacol.
150, 851861.
Montes, F.R., Echeverri, D., Buitrago, L., Ramrez, I., Giraldo, J.C.,
Maldonado, J.D., Umaa, J.P., 2006. The vasodilatory effects
of levosimendan on the human internal mammary artery.
Anesth. Analg. 103, 10941098.
Nieminen, M.S., Fruhwald, S., Heunks, L.M., Suominen, P.K.,
Gordon, A.C., Kivikko, M., Pollesello, P., 2013. Levosimendan:
current data, clinical use and future development. Heart
Lung Vessel. 5, 227245.
Ozdem, S.S., Yalcin, O., Meiselman, H.J., Baskurt, O.K., Usta, C.,
2006. The role of potassium channels in relaxant effect of
levosimendan in rat small mesenteric arteries. Cardiovasc.
Drugs Ther. 20, 123127.
Papp, Z., des, I., Fruhwald, S., De Hert, S.G., Salmenper, M.,
Leppikangas, H., Mebazaa, A., Landoni, G., Grossini, E.,
Caimmi, P., Morelli, A., Guarracino, F., Schwinger, R.H.,
Meyer, S., Algotsson, L., Wikstrm, B.G., Jrgensen, K.,
Filippatos, G., Parissis, J.T., Gonzlez, M.J., Parkhomenko, A.,
Yilmaz, M.B., Kivikko, M., Pollesello, P., Follath, F., 2012.
Levosimendan:
molecular
mechanisms
and
clinical
implications: consensus of experts on the mechanisms of
action of levosimendan. Int. J. Cardiol. 159, 8287.
Usta, C., Eksert, B., Glbasi, I., Bigat, Z., Ozdem, S.S., 2006. The
role of potassium channels in the vasodilatory effect of
levosimendan in human internal thoracic arteries. Eur. J.
Cardiothorac. Surg. 30, 329332.

Yildiz, O., Nacitarhan, C., Seyrek, M., 2006. Potassium channels in

the vasodilating action of levosimendan on the human
umbilical artery. J. Soc. Gynecol. Investig.13, 312315.