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INTRODUCCIN
Las clulas aparecieron sobre la tierra hace 3,5 billones de aos, probablemente debido a la
agregacin espontnea de molculas. Las primeras clulas eran relativamente simples y
pequeas, similares a los organismos que actualmente conocemos como procariontes.
Luego aparecieron las clulas eucariontes, ms grandes y de organizacin ms compleja, que
hoy forman parte de animales y plantas.
Por definicin, y a diferencia de las clulas procariontes, las clulas eucariontes poseen un
ncleo que contiene la mayora del DNA envuelto en una membrana. Esto deja al material
gentico en un compartimiento separado del resto de los contenidos de la clula o
citoplasma, donde ocurren las reacciones metablicas.
En el citoplasma se pueden distinguir varios organelos: cloroplastos, mitocondrias, retculo
endoplsmico, aparato de Golgi, ribosomas, peroxisomas, lisosomas, citoesqueleto, los
cuales cumplen funciones especficas dentro de la clula.
.
Fig 2:Clula Eucarionte Vegetal
El Ncleo (Fig.3) es el organelo ms grande de la clula y est separado del citoplasma por
una envoltura nuclear compuesta por dos membranas, estas membranas aparecen
perforadas por poros, a travs de los cuales se comunica con el citosol. El ncleo contiene
todo el DNA cromosomal, el que se encuentra empacado en las fibras de cromatina por su
asociacin con protenas denominadas histonas.
Fig 3: Nucleo.
Las Mitocondrias (Fig.5) son muy similares a las bacterias tanto en tamao como en
forma. Poseen dos membranas una externa y otra interna, que dan lugar a dos
compartimentos, el espacio intermembrana y la matriz mitocondrial. Las Mitocondrias
contienen su propio DNA, sintetizan protenas y pueden reproducirse al dividirse en dos, por
lo que se cree que proviene de la simbiosis de una clula eucarionte primitivo con un
organismo procarionte. Este organelo es responsable de los procesos de respiracin celular y
produccin de energa.
Fig 5: Mitocondria.
Los Cloroplastos (Fig.6), al igual que las mitocondrias, tambin tendran un origen
simbitico. Se encuentran slo en los organismos capaces de realizar la fotosntesis, como
las algas verde-azules y las plantas.
Los cloroplastos corresponden a plastidios que contienen clorofila, y estn rodeados de
una membrana doble. Los cloroplastos estn compuestos por la envoltura, estroma y los
tilacoides.
Fig 6: Cloroplasto.
Para aumentar el campo gravitatorio se usan las Centrfugas (Fig.10). Estos instrumentos
consisten en rotores con cavidades para los tubos, los que se hacen girar a diferentes
velocidades, de manera que a mayor velocidad el campo gravitacional obtenido es mayor. Lo
mismo ocurre a mayor distancia entre el tubo y el eje de giro del rotor. En otras
palabras, el campo gravitacional generado depende directamente del radio de giro y de la
velocidad de rotacin.
Al trmino de una centrifugacin se pueden distinguir en el tubo dos fases. En el fondo del
tubo se obtiene un sedimento o pellet, y sobre l una parte lquida llamada sobrenadante.
Fig 10: Esquema de una centrfuga.
ACTIVIDADES PRCTICAS
ACTIVIDAD n 1: Fraccionamiento subcelular
A) Fraccionamiento Subcelular de Hgado:
El Fraccionamiento Subcelular comprende dos etapas, una primera etapa de ruptura u
homogeneizacin, y una segunda etapa de fraccionamiento propiamente tal.
El fraccionamiento o separacin de los distintos componentes celulares se realiza mediante
una serie de centrifugaciones sucesivas, las que sedimentan los diferentes organelos en un
campo gravitacional dependiendo de su masa y tamao.
Al centrifugar una muestra se obtienen dos fases claramente definida: el pellet que
corresponde al sedimento propiamente tal y el sobrenadante, que corresponde a la
fraccin lquida que permanece sobre el material sedimentado.
Los pellet obtenidos corresponden a los organelos que han sedimentado, stos s
resuspenden y se guardan para el resto de los anlisis bioqumicos, mientras que los
sobrenadantes se vuelven a centrifugar.
La etapa de ruptura y homogeneizacin de la muestra se realiza colocando el tejido fresco a
fraccionar y una cantidad adecuada de solucin tampn, la que deja los organelos en
suspensin y sirve para que no se rompan durante el fraccionamiento en un homogeneizador.
Todo el proceso se realiza adems en fro (4C) para evitar una posible degradacin de las
estructuras celulares y as conservar intactas la mayor parte de las caractersticas
funcionales originales del organelo que se pretende aislar.
Procedimientos y observaciones
Usted recibir un homogenizado filtrado, preparado por sus profesores, el cual se obtuvo de
la siguiente manera:
1. Tomar un trozo (10 g aprox) de tejido de hgado de pollo frio (mantener siempre en
hielo, 4C)
2. Dejar el hgado libre de sangre usando PBS o NaCl 0,9% (suero fisiolgico) fro.
(Usualmente entre 4 y 5 clarificaciones es suficiente)
3. Picar el hgado en pequeos pedazos utilizando tijeras. Esto podra ser realizado
mientras se mantenga el vaso en una fuente con hielo.
4. Descartar el PBS o NaCl 0,9% usado durante picado y reemplazarlo con 5 ml de IBc
fro fresco y transferir la suspensin al tubo de homogenizado (mortero) y operarlo a
1600 RPM mezclndolo de 3 a 4 veces.
Recordar:
A 4C se minimiza la activacin de dao generado por fosfolipasas y proteasas.
El radio ptimo entre el tejido y el buffer de aislamiento es de 1:5 a 1:10
(peso:volumen)
Enfriar el tubo de homogenizado en hielo por 5 minutos antes de iniciar el
procedimiento.
6. Trasferir el homogenizado a un tubo Falcon de polipropileno y centrifugar a 600 g (2500
RPM aprox) por 10 minutos a 4C.
7. Transferir el sobrenadante a tubo de centrifugacin y centrifugar a 7000 g (6000 RPM aprox)
por 20 minutos a 4C.
8. Descartar el sobrenadante y lavar el pellet con 5 ml de PBS o NaCl fro.
9. Centrifugar a 7000 g (6000 RPM aprox) por 20 minutos a 4C.
10. Descartar el sobrenadante y resuspender el pellet conteniendo mitocondrias en 1 ml de PBS o
NaCl 0,9 %
11. Trasferir la suspensin mitocondrial en un tubo Falcon y guardar en hielo.
Recordar:
Minimizando la exposicin al oxigeno se puede mantener la funcionalidad de la
porcin mitocondrial por largo tiempo.
Es recomendable utilizar esta preparacin mitocondrial entre 1 a 3 horas
despus del aislamiento.
La concentracin usual de mitocondrias en este tipo de preparacin es de cerca de 80
mg/ml y el volumen total es de 1 ml.
Los protones y electrones liberados permiten seguir la reaccin a travs de la decoloracin del
azul de metileno, que en su estado oxidado es azul y al reducirse se torna incoloro. Sin
embargo, el azul de metileno reducido puede fcilmente ser oxidado por el oxgeno del
aire, y recobrar su coloracin azul intensa. Para evitar esto, se cubre el medio de reaccin con
aceite mineral o vaselina lquida, lo que permite realizar la reaccin en ausencia de
oxgeno.
Procedimientos y observaciones
En un portaobjetos limpio y seco coloque una gota de la suspensin de ncleos
P1 obtenida anteriormente y que usted ha mantenido en hielo.
Coloque sobre ella un cubreobjetos y observe su preparacin al microscopio usando
para ello el objeto de 40X.
Prepare un nuevo portaobjetos limpio y seco con una gota de la solucin de nucleos P1 obtenida
anteriormente y agregue el azul de tripn y vuelva a observar su preparacin de ncleos. Qu
observa?.
Procedimientos y observaciones
Separe 4 tubos de ensayo, rotlelos en forma adecuada y colquelos en hielo de
manera que estn fros.
Agregue a cada uno de los tubos las soluciones que correspondan segn el siguiente
esquema:
Succinato Azul de
Tubo
1 Blanco
0,1M
Agua
metileno destilada
1 ml
1 ml
1 ml
1 ml
1 ml
1 ml
1 ml
1 ml
1 ml
1 ml
1 ml
1 ml
Fraccin
nuclear
Fraccin
Fraccin
mitocondrial microsomal
Fraccin
2
nuclear
1 ml
Fraccin
3
mitocondrial
1 ml
Fraccin
4 microsomal
1 ml
BIBLIOGRAFIA
Biologa Celular y Molecular. De Robertis y de Robertis. 11 Ed., 2da impresin, 1998, Ed.
El Ateneo, Bs. Aires.
Biologa Celular y Molecular. Lodish y col. (2002) 4Edicin, Ed. Panamericana.
Elementos de Biologa Celular y Gentica. Parte 2: Estructura y Funcin Celulares.
Mtodos de Estudio en Biologa Celular. Fraccionamiento Subcelular. Lpez, R.
1 ed., 1985, Departamento de Biologa Celular y Gentica, Facultad de Medicina,
Universidad de Chile.
Molecular Biology of de Cell. Alberts, Bray, Lewis, Raff Roberts & Watson. 3ra ed.,
1994, Garland Publishing Inc. , New York & London.
The Cell: A Molecular Approach. Cooper, G.M. 1997, ASM Press, Washington, U.S.A.
Organelle isolation: functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured
filroblasts. Christian Frezza, Sara Cipolat & Luca Scorrano. NATURE PROTOCOLS VOL.2
NO.2. 2007.
Materiales Laboratorio. Fraccionamiento Sub Celular
1.
Para el homogenizado
Higado de Pollo
Pinzas
Bistur
Tijeras
Homogenizador
Embudo
Gasa
Centrifuga
Hielo
Buffer PBS o Suero Fisiolgico
Porta objetos.
Cubreobjetos.
1 Lpiz rotulador
Centrifuga.
Bao termorregulador.
Hielo
2 gotarios (p/g)
8 tubos de ensayo (p/g)
Gradilla para tubos de ensayo
3 pipetas 1 ml (p/g)
1 pipeta 5 ml (p/g).
1 vaso precipitado de 50 ml (p/g)
Azul de Metileno.
Succinato 0.1 M.
H2O destilada. (picetas).
Azul de tripan.
Aceite mineral o vaselina.
Tubos para centrifuga (p/g)