Qisthy Adillah

240210120006
V.

PEMBAHASAN
Praktikum kali ini yaitu mengenai kromatografi preparatif. Dalam

praktikum ini dipelajari operasi pemisahan dan pemurnian suatu komponen

bioaktif

dengan

menggunakan

kromatografi

kolom

preparatif.

Tujuan

dilakukannya praktikum ini adalah agar dapat memahami prinsip kerja

kromatografi kolom preparatif dalam memisahkan dan memurnikan komponen
bioaktif kemudian dapat memilih jenis pelarut (fase gerak) dan adsorben (fase
diam) yang tepat untuk suatu pemisahan dan pemurnian komponen bioaktif.
Kromatografi adalah teknik pemisahan komponen bahan dengan
kemurnian yang tinggi dan biasanya digunakan pada analisa. Namun biasanya
kapasitas bahan yang dapat dipisahkannya sangat sedikit dan hanya untuk
keperluan analisis (Claeson, 1992). Teknik kromatografi bermanfaat sebagai cara
untuk menguraikan suatu campuran. Dalam kromatografi, komponen terdistribusi
dalam dua fase. Salah satu fase adalah fase diam. Transfer massa antar fase
bergerak dan fase diam terjadi bila molekul-molekul campuran terserap pada
permukaan partikel atau terserap didalam pori-pori partikel atau terbagi ke dalam
sejumlah cairan yang terikat pada permukaan atau di dalam pori. Laju
perpindahan suatu molekul zat terlarut tertentu didalam kolom atau lapisan tipis
zat penyerap secara langsung berhubungan dengan bagian bagian molekulmolekul tersebut diantara fase bergerak dan fase diam (Gritter, 1991).
Jenis kromatografi yang digunakan pada prktikum ini adalah HPLC (High
Performance

Liquid

Chromatography).

Sampel

yang

digunakan

yaitu

Kratingdeng, Lipovitan, Promen, dan Hemaviton. Penggunaan kromatografi pada

praktikum ini bertujuan untuk menghitung kadar kafein dalam minuman energi.
Fase gerak yang digunakan adalah methanol dan air yang bersifat polar dengan
perbandingan 70 : 20 dan 80 : 20. Setiap sampel yang akan diuji diberi dua
perlakuan terlebih dahulu yaitu sampel dengan pengenceran dan sampel tanpa
pengenceran. Hasil pembacaan komponen bioaktif pada sampel akan keluar
sebagai kromatogram. Sebelum sampel diinjeksikan ke dalam kolom, harus
ditetapkan terlebih dahulu standar komponen bioaktif yang ingin diidentifikasi.
Kromatografi didasarkan pada distribusi atau partisi solut (analit) sampel
antara fase diam dan fase gerak. Teknik kromatografi yang saat ini umum
digunakan untuk analisis bahan makanan adalah: kromatografi lapis tipis,

Qisthy Adillah
240210120006
kromatografi cair kinerja tinggi, kromatografi cair super kritik, dan kromatografi
gas. Metode-metode kromatografi sering difungsikan sebagai metode pemisahan
analit dalam sampel makanan. Metode kromatografi juga seringkali dihubungkan
dengan instrumen yang lain seperti dengan sprektometer massa sehingga terdapat
kromatografi

cair-spektrometri

massa

(LC-MS)

dan

spektrometri massa (GC-MS) (Rohman, 2013).

Pemisahan yang terjadi pada kromatografi

kromatografi

dilaksanakan

gas-

dengan

memanipulasi sedemikian rupa sifat-sifat fisik umum dari suatu senyawa atau
molekul, yaitu:
a. Kecenderungan suatu molekul untuk larut dalam cairan (kelarutan).
b. Kecenderungan suatu molekul untuk bertaut dengan suatu serbuk bahan
padat (absorbsi).
c. Kecenderungan suatu molekul untuk menguap (volatilitas) (Sudarmadji,
2010).
Dalam kromatografi, senyawa-senyawa yang akan dipisahkan ditempatkan
pada situasi dinamik (bergerak) yaitu dengan melakukan pengaliran dan selama
itu akan terjadi peristiwa pelarutan, absorbsi atau penguapan (Sudarmadji, 2010).
(a)
(b)

Gambar 1.a) dan b) Rangkaian Alat HPLC

(Sumber : Dokumentasi pribadi, 2015)
Prinsip dari kromatografi yaitu didasarkan pada absorbsi komponenkomponen campuran dengan afinitas berbeda terhadap permukaan fase diam.
Absorben bertindak sebagai fase diam dan fase geraknya adalah cairan yang
mengalir membawa komponen campuran sepanjang kolom. Sampel yang
mempunyai afinitas besar terhadap absorben akan secara selektif tertahan dan
afinitasnya paling kecil akan mengikuti aliran pelarut (Rebolegi, 2013).
Alatnya terdiri dari kolom (sebagai fasa diam) dan larutan tertentu sebagai
fasa geraknya. Yang paling membedakan HPLC dengan kromatografi lainnya
adalah pada HPLC digunakan tekanan tinggi untuk mendorong fasa gerak. Fasa

Qisthy Adillah
240210120006
diam yang biasa digunakan (pada kolom) HPLC jenis fasa terbalik adalah RMe 2
SiCl dimana R adalah rantai alkana C-18 atau C-8. Sementara fasa geraknya
berupa larutan yang diatur komposisinya (gradien elusi), misalnya air: asetonitril
(80:20) dan sebagainya. Hal ini bergantung pada kepolaran analit yang akan
dipisahkan. Campuran analit akan terpisah berdasarkan kepolarannya, dan waktu
retensinya akan berbeda, hal ini akan teramati pada spektrum yang puncakpuncaknya terpisah. Waktu retensi yaitu waktu yang dibutuhkan oleh senyawa
untuk bergerak melalui kolom menuju detektor. Waktu retensi diukur berdasarkan
waktu dimana sampel diinjeksikan sampai sampel menunjukkan ketinggian
puncak yang maksimum dari senyawa itu. Senyawa-senyawa yang berbeda
memiliki waktu retensi yang berbeda.
Seluruh bentuk kromatografi memiliki fase diam (berupa padatan atau
cairan yang didukung pada padatan) dan fase gerak (cairan atau gas). Fase gerak
mengalir melalui fase diam dan membawa komponen-komponen dari campuran
bersama-sama. Komponen-komponen yang berbeda akan bergerak pada laju yang
berbeda pula. Kita akan melihat alasannya pada halaman selanjutnya. Dalam
kromatografi kertas, fase diam adalah kertas serap yang sangat seragam. Fase
gerak adalah pelarut atau campuran pelarut yang sesuai (Kristianingrum, 2011).
Teknik HPLC merupakan suatu metode kromatografi cair-cair, yang dapat
digunakan baik untuk keperluan pemisahan maupun analisis kuantitatif. Analisis
kualitatif dengan teknik HPLC didasarkan pada pengukuran luas area standar.
Pada prakteknya, metode pembandingan area standar dan sampel kurang
menghasilkan data yang akurat bila hanya melibatkan suatu konsentrasi standar.
Oleh karena itu, dilakukan dengan menggunakan teknik kurva kalibrasi (Wiji,
2010).
Cara kerja dari HPLC yaitu pertama fasa gerak dialirkan melalui kolom
kedetektor dengan bantuan pompa. Kemudian cuplikan dimasukan ke dalam
aliran fasa gerak dengan cara penyuntikan. Didalam kolom terjadi pemisahan
komponen-komponen campuran karena perbedan kekuatan interaksi antara solutsolut terhadap fasa diam. Solut-solut yang kurang kuat interaksinya dengan fasa
diam akan keluar dari kolom terlebih dahulu. Sebaliknya solut-solut yang
interaksinya kuat dengan fasa diam akan keluar dari kolom lebih lama. Setiap

Qisthy Adillah
240210120006
komponen yang campuran yang keluar kolom dideteksi oleh detektor kemudian
direkam dalam bentuk kromatogram (Hendayana, 2006).
Konsentrasi sampel dapat diperoleh dengan menggunakan perhitungan
sebagai berikut.
Praktikum kali ini berjalan dengan kurang baik karena penetapan standar
memerlukan waktu yang lama dan tidak terbaca oleh detector HPLC. Hal ini bisa
disebabkan karena standar yang digunakan telah disimpan dalam waktu yang
cukup lama sehingga memungkinkan adanya kerusakan atau terdapat kotoran
pada alat yang menyebabkan proses pembacaannya terganggu.
HPLC merupakan salah satu metode kromatografi cair yang menggunakan
fasa diam yang ditempatkan dalam suatu kolom tertutup dan juga fasa geraknya
berupa pelarut yang dialirkan dengan cepat ke dalam kolom dengan bantuan
pompa/tekanan. Berikut adalah ilustrasi dari HPLC.

Gambar 2. Komponen Pokok dalam Alat HPLC

Sumber: http://pustaka.unpad.ac.id/wpcontent/uploads/2009/12/diktat_pelatihan_hplc_2007.pdf
1. Gradien Controller/Solvent Reservoir :
Fungsinya untuk menampung fasa gerak yang akan dialirkan ke dalam
kolom dengan bantuan pompa. Syarat fasa gerak yang digunakan harus
dimilipore (pori-pori

5m) dan didegass.

2. Pompa :
Fungsinya untuk mendorong fasa gerak masuk ke dalam kolom.
3. Sample Introductions/Injector :
Fungsinya sebagai tempat memasukkan cuplikan/sampel dengan
bantuan syringe.

Qisthy Adillah
240210120006
4. Kolom :
Merupakan jantung dari sistem HPLC, karena di dalam kolomlah
terjadi pemisahan komponen-komponen cuplikan.
5.

Detektor :
Fungsinya untuk mendeteksi komponen-komponen cuplikan hasil
pemisahan kolom.

6.

Data Output :
Fungsinya untuk menampilkan hasil yang diperoleh (Anshori,
2007).
Keuntungan dari penggunaan HPLC antara lain:

Kerja lebih mudah dengan automatisasi dalam prosedur analisis dan

pengolahan data
Volume sampel kecil
Daya pisah tinggi
Merupakan metode analitis:
a. Cepat
b. Peka
c. Akurat
d. Tepat
e. Reproducible
Juga Preparatif
Dapat digunakan untuk analisis sampel organik dan anorganik, bersifat

volatil dan non-volatil, stabil dan tidak stabil secara thermal.

Pilihan fasa diam dan fasa geraknya luas (Anshori, 2007).

Beberapa contoh aplikasi HPLC adalah sebagai berikut.

HPLC dengan prinsip kromatografi banyak digunakan pada industri

farmasi dan pestisida.

Zat- zat dengan kepolaran berbeda yaitu antara sedikit polar sampai polar

dapat dipisahkan dengan HPLC berdasarkan partisi cair-cair.

Asam-asam nukleat dapat dipisahkan dengan kolom penukar ion yang

dikombinasikan dengan kolom butiran berlapis zat berpori.

Morfin, heroin dan semacamnya telah dapat dipisahkan dengan rezin

Zipax-SAX.
Dapat memisahkan vitamin-vitamin yang larut dalam air.
Digunakan untuk menentukan berat molekul polimer dan masalah-masalah
biokimia.

Qisthy Adillah
240210120006

Kromatografi cairan kinerja tinggi (KCKT/HPLC) digunakan untuk

memisahkan golongan-golongan takatsiri, misalnya terpenoid tiggi, segala
jenis senyawa fenol, alkaloid, lipid dan gula.
HPLC cocok digunakan untuk memisahkan minyak atsiri. Minyak atsiri

terdiri atas campuran yang sangat rumit menjadi golongan-golongan

senyawa atau memisahkan golongan senyawa menjadi komponenkomponennya (Anshori, 2007).
Instrumentasi HPLC terdiri dari fase gerak, pompa, injektor, kolom,
detektor dan pengolah data.

Gambar 3. Skema Instrument HPLC

Sumber: https://arycho.wordpress.com/2012/04/08/53/
Fase gerak (eluen)
Berupa zat cair. Fase gerak selain sebagai pembawa senyawa campuran
menuju detektor, fase gerak juga dapat berinteraksi dengan solut-solut. Beberapa
persyaratan HPLC antara lain :

Harus bertindak sebagai pelarut yang baik untuk sampel yang akan

dianalisis
Zat cair harus murni dan jernih untuk menghindari kotoran yang dapat
mengganggu interpretasi kromatogram dan menghindarkan penyumbatan

kolom
Mudah diperoleh, murah, tidak mudah terbakar dan tidak beracun
Memiliki viskositas rendah
Sesuai dengan detektor yang digunakan

Pompa
Dianalogikan sebagai jantung, berfungsi mengalirkan fase gerak cair
melalui kolom.

Qisthy Adillah
240210120006
Injektor
Merupakan tempat masuknya sampel. Sampel yang dimasukkan ke dalam
HPLC hanya beberapa puluh mikroliter. adakalanya injektor merupakan suatu
sistem autosampler.
Kolom
HPLC berisi fase diam, tempat terjadinya pemisahan campuran menjadi
komponen-komponennya. Biasanya berukuran antara 5-30 cm dan diameter
dalam berkisar antara 4-10 mm. Jenis kolom bervariasi bergantung keperluan,
misalnya dikenal kolom C-18, C-8, cyanopropyl, penukar ion. Yang paling banyak
dipakai adalah kolom C-8 dan C-18. Saat ini yang baru diperkenalkan adalah
kolom HILIC (Hidrophilic Interactive Liquid Chromatography)
Detektor
Dengan persyaratan untuk detektor antara lain harus cukup sensitif,
stabilitas dan keterulangannya tinggi, respon terhadap sampel linier, waktu respon
pendek sehingga tidak tergantung pada kecepatan alir, reliabilitas tinggi, mudah
digunakan serta tidak merusak sampel (Arycho, 2012).
VI.

KESIMPULAN
Berdasarkan praktikum yang telah dilaksanakan, maka dpaat ditarik

beberpa kesimpulan sebagai berikut.

Kromatografi adalah teknik pemisahan komponen bahan dengan

kemurnian yang tinggi dan biasanya digunakan pada analisa.

Metode-metode kromatografi sering difungsikan sebagai

metode

pemisahan analit dalam sampel makanan.

Pemisahan yang terjadi pada kromatografi

dengan

dilaksanakan

memanipulasi sedemikian rupa sifat-sifat fisik umum dari suatu senyawa

atau molekul.
Prinsip dari kromatografi yaitu didasarkan pada absorbsi komponenkomponen campuran dengan afinitas berbeda terhadap permukaan fase

diam.
Teknik HPLC merupakan suatu metode kromatografi cair-cair, yang dapat

digunakan baik untuk keperluan pemisahan maupun analisis kuantitatif.

Analisis kualitatif dengan teknik HPLC didasarkan pada pengukuran luas
area standar.

Qisthy Adillah
240210120006

DAFTAR PUSTAKA
Anshori, J. A. Diktat Pelatihan HPLC. Available online at:
http://pustaka.unpad.ac.id/wpcontent/uploads/2009/12/diktat_pelatihan_hplc_2007.pdf (diakses pada 28
Mei 2015)
Arycho. 2012. Prinsip dan Instrumentasi High Performance Liquid
Chromatography (HPLC).
Available
online
at:
https://arycho.wordpress.com/2012/04/08/53/(diakses pada 28 Mei 2015)
Claeson P. 1992. Practical aspects on flash chromatography and preparative liquid
chromatography (MPLC). Buchi Laboratoriums-technik AG 9230 Flawil,
Switzerland
Gritter, R.J. J.M. Bobit, and A.E. Schwarting. 1991. Pengantar Kromatografi.
(Terjemahan). ITB, Bandung.
Hendayana, S. (2006) . Kimia Pemisahan Metode Kromatografi dan
Elektroforensis Modern. PT. Remaja Rosdakarya : Bandung.
Kristianingrum, S. 2011. Kromatografi Kertas. Available online
http://staff.uny.ac.id/sites/default/files/pendidikan/Susila
%20Kristianingrum,%20Dra.,%20M.Si./Handout-KA%20IIKROM.KERTASs.pdf. (diakses pada 28 Mei 2015)

at:

Rebolegi.
2013.
Kromatografi.
Available
online
at:
http://www.slideshare.net/rebolegi/kromatografi-26592457 (diakses pada
28 Mei 2015)
Rohman, A. 2013. Analisis Komponen Makanan. Graha Ilmu : Yogyakarta.
Sudarmadji, S. Bambang Haryono dan Suhardi. 2010. Analisa Bahan Makanan
dan Pertanian. Penerbit Liberty : Yogyakarta.