A.

Kromatografi
Kromatografi pertama kali diberikan oleh Michel Tswett, seorang ahli dari Botani Rusia,
yang menggunakan kromatografi untuk memisahkan klorofil dari pigmen - pigmen lain pada
ekstrak tanaman. Kromatografi berasal dari bahasa Yunani yang terdiri dari dua kata
yaitu chromos yang berarti warna dan graphos yang berarti menulis. Meskipun kromatografi
diturunkan dari kata warna dan tulis, warna senyawa-senyawa tersebut jelas hanya kebetulan
saja terjadi dalam proses pemisahan ini. Tswett sendiri mengantisipasi penerapan pada
beraneka ragam sistem kimia. Seandainya karyanya segera ditanggapi dan diperluas, beberapa
bidang sains mungkin akan lebih cepat maju. Demikianlah kromatografi tetap tersembunyi
sampai sekitar tahun 1931, ketika pemisahan karotena tumbuhan dilaporkan oleh ahli sains
organik terkemuka. Penelitian ini menarik lebih banyak perhatian dan kromatografi adsorsi
menjadi meluas pemakaiannya dalam bidang kimia hasil alam.

Ada dua fase dalam kromatografi, yaitu:

a.

Fasa diam (adsorben atau lapisan penyerap)

Bertindak sebagai pemisah campuran.Contoh pelrut yang digunakan adalah silika gel,
alumunium oksida, selulosa. Namun yamg paling banyak digunakan adalah slika gel dan
alumunium oksida karena kadar air yang digunakan berpengaruh nyata terhadap daya.

b.

Fasa gerak (Eluen)

Bertindak sebagai pembawa campuran. Komponen-komponen
campuran akan
bergerak dengan kecepatan yang berbeda-beda akibat hambatan dari fase diam sehingga
terjadi pemisahaan.

Seiring perkembangan zaman, terdapat 4 perkembangan utama yaitu :

1.

Kromatografi pertukaran ion dalam akhir dasawarsa 1930-an

2.

Kromatografi partisi dalam tahun 1941

3.

Kromatografi gas pada tahun 1952

4.

Kromatografi gel pada tahun 1959

Selain kemajuan utama ini, yang memberi mekanisme tambahan pada adsorpsi untuk
mendistribusikan zat terlarut antara fase - fase stationer dan mobil, muncul juga modifikasi
dalam geometri sistem kromatografi, seperti dalam kromatografi kertas dan kromatografi lapis
tipis.
Perkembangan teoritis yang memungkinkan pemahaman tuntas akan proses kromatografi
dan karenanya menjelaskan faktor - faktor yang menentukan penampilan kolom, pertama kali
muncul dalam hubungan dengan kromatografi gas. Namun pandangan-pandangan tertentu
diantaranya terbukti dengan penyesuaian yang cocok, sama menolongnya dengan memahami
kromatografi dalam mana fase geraknya adalah cairan. Jadi sekitar tahun 1968 mulailah suatu
revolusi dalam kromatografi cairan yang menjanjikan kecepatan dan efisiensi baru dalam
memisahkan senyawa yang tak dapat dikerjakan dengan kromatografi gas ( Aphiin, 2012).
Kromatografi adalah suatu metode pemisahan fisik, di mana komponen-komponen yang
dipisahkan didistribusikan di antara dua fasa, salah satu fasa tersebut adalah suatu lapisan
stasioner dengan permukaan yang luas, yang lainnya sebagai fluida yang mengalir lembut di
sepanjang landasan stasioner. Fasa stasioner bisa serupa padatan maupun cairan, sedangkan
fasa bergerak bisa berupa cairan maupun gas. Dalam semua teknik kromatografi, zat - zat
terlarut yang dipisahkan bermigrasi sepanjang kolom (seperti dalam kromatografi kertas atau
lapis tipis, ekivalen fisik kolom), dan tentu saja dasar pemisahan terletak dalam laju
perpindahan yang berbeda.
Metode kromatografi adalah teknik yang efektif dan dapat digunakan untuk memisahkan
komponen yang sulit dipisahkan dengan metode lain. Berdasarkan proses terjadi, kromatografi
dibedakan menjadi kromatografi partisi, ditemukan dalam kromatografi kertas dan kromatografi
lapis tipis, kromatografi adsorpsi, ditemukan dalam kromatografi kolom, kromatografi pertukaran
ion dan kromatografi eklusi.
Beberapa zat yang diteteskan pada kertas dapat bergerak pindah lebih cepat daripada
yang lain. Kelarutan suatu partikel terhadap pelarutnya mempengaruhi kecepatan perpindahan
tersebut. Semakin mudah suatu partikel larut, semakin cepat pula laju geraknya. Suatu
campuran pewarna dapat dipisahkan dengan teknik kromatografi karena adanya perbedaan
kelarutan antara zat penyusun campuran pewarna tersebut. Selain itu, kecepatan bergerak
partikel penyusun sangat dipengaruhi oleh ukuran partikel penyusunnya. Partikel penyusun
yang lebih akan bergerak lebih cepat daripada partikel penyusun yang berukuran lebih besar .
Pengukuran uji kromatografi dapat dilakukan secara kualitatif dan kuantitatif. Secara
kuantitatif, perbandingan jarak yang ditempuh oleh suatu warna dengan jarak pelarut disebut
dengan Rf. Variasi jumlah Rf menunjukkan banyaknya komponen penyusun campuran yang

sedang kita pisahkan dengan metode kromatografi ini. Berbagai nilai Rf ini kita bandingkan satu
sama lain. Nilai Rf yang terbesar dimiliki oleh komponen penyusun yang memiliki ukuran
partikel terkecil dan sebaliknya nilai Rf yang terkecil adalah yang memiliki ukuran partikel
penyusun terbesar (Rizki, 2010).

Secara umum, teknik kromatografi terbagi ke dalam beberapa jenis yaitu, Kromatografi gas dan
Kromatografi cair

1. Kromatografi Cair ( Liquid Chromatography )

Kromatografi Cair adalah kromatografi dengan fasa gerak berupa zat cair, Kromatografi cair
merupakan teknik yang tepat untuk memisahkan ion atau molekul yang terlarut dalam suatu
larutan. Jika larutan sampel berinteraksi dengan fase stasioner, maka molekul-molekul
didalamnya berinteraksi dengan fase stasioner; namun interaksinya berbeda dikarenakan
perbedaan daya serap (adsorption), pertukaran ion (ion exchange), partisi (partitioning), atau
ukuran. Perbedaan ini membuat komponen terpisah satu dengan yang lain dan dapat dilihat
perbedaannya dari lamanya waktu transit komponen tersebut melewati kolom. Terdapat
beberapa jenis kromatografi cair, diantaranya :

 Kromatografi Kolom
Kromatografi kolom adalah suatu metode pemisahan yang di dasarkan pada pemisahan daya
adsorbsi suatu adsorben terhadap suatu senyawa, baik pengotornya maupun hasil isolasinya

Kromatografi Kertas (Partisi)

Kromatografi kertas adalah suatu metode pemisahan yang menggunakan media kertas
(selulosa) sebagai fase diam, sedangkan untuk fase gerak menggunakan pelarut atau
campuran pelarut yang sesuai. Kromatografi kertas termasuk pada kromatografi partisi cair-cair.
Prinsip kromatografi partisi cair-cair adalah distribusi sampel antara fase caie diam dan fase cair
bergerak dengan membatasi kemampuan pencampuran (contoh, pemisahan tinta, zat warna,
klorofil, make up, dll )

Kromatografi Lapisan Tipis (Absorbsi)

Kromatografi lapisan Tipis adalah suatu metode pemisahan yang menggunakan lempengan
tipis yang terbalut gel silica atau alumina sebagai fase diam, sedangkan untuk fase gerak
menggunakan pelarut atau campuran pelarut yang sesuai, digunakan untuk mengetahui jenis
campuran asam amino

High Performance Liquid Chromatography (HPLC)

Kromatografi jenis ini sering juga dikenal dengan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT)
merupakan salah satu teknik kromatografi untuk zat cair yang biasanya disertai dengan tekanan
tinggi. Seperti teknik kromatografi pada umumnya, HPLC berupaya untuk memisahkan molekul
berdasarkan perbedaan afinitasnya terhadap zat padat tertentu. Cairan yang akan dipisahkan
merupakan fasa cair dan zat padatnya merupakan fasa diam (stasioner).
Kromatografi penukar ion

Kromatografi pertukaran ion adalah salah satu teknik pemurnian senyawa spesifik di dalam
larutan campuran. Prinsip utama dalam metode ini didasarkan pada interaksi muatan positif dan
negatif
antara
molekul
spesifik
dengan
matriks
yang
barada
di
dalam
kolom kromatografi.Metode ini pertama kali dikembangkan oleh seorang ilmuwan bernama

Thompson pada tahun1850. Secara umum, teradapat dua jenis kromatografi pertukaran ion,
yaitu:

Kromatografi pertukaran kation, bila molekul spesifik yang diinginkan bermuatan positif
dan kolom kromatografi yang digunakan bermuatan negatif.Kolom yang digunakan
biasanya berupa matriks dekstran yang mengandung gugus karboksil (-CH2-CH2-CH2SO3dan -O-CH2COO-). Larutan penyangga (buffer) yang digunakan dalam sistem ini
adalah asam sitrat, asam laktat, asam asetat, asam malonat, buffer MES dan fosfat.

kromatografi pertukaran anion, bila molekul spesifik yang diinginkan bermuatan negatif
dan kolom kromatografi yang digunakan bermuatan positif. Kolom yang digunakan biasanya
berupa matriks dekstran yang mengandung gugus -N+(CH3)3, -N+(C2H5)2H, dan N+
(CH3)3. Larutan penyangga (buffer) yang digunakan dalam sistem ini adalah N-metil
piperazin, bis-Tris, Tris, dan etanolamin.
Metode ini banyak digunakan dalam memisahkan molekul protein (terutama enzim).Molekul lain
yang umumnya dapat dimurnikan dengan menggunakan kromatografi pertukaran ion ini antara
lain senyawa alkohol, alkaloid, asam amino, dan nikotin.
Fase Diam
Ada banyak macam penukar ion, tetapi penukar ion polisterina berikatan silang paling luas
penggunaannya.Gambar 65. b menggambarkan struktur resina penukar anion dengan matriks
poliestirena berikatan silang yang sama, tetapi dengan gugus tetraalkilamonium. Resina
poliestirena kerng cenderng mengembang jika dimasukkan dalam pelarut. Air menetrasi ke
dalam resina dan hidrasi, membentuk larutan sangat pekat dalam resina. Tekanan osmosa
cenderung menekan air lebih banyak ke dalam resina dan padatan itu mengembang, jadi
volumenya bertambah. Jumlah air yang diambil resina tergantung pada ion penukar dari resina
dan menurun dengan bertambahnya jumlah ikatan silang. Resina penukaran ion juga
mengembang dalam pelarut organik, tetapi pengembangannya lebih kecil daripada dalam air.
Fase Gerak
Kebanyakan pemisahan kromatografi penukar ion dilakukan dalam media air sebab sifat
ionisasi dari air. Dalam beberapa hal, digunakan pelarut campuran seperti air, alkohol dan juga
pelarut organik. Kromatografi penukar ion dengan fase gerak media air, reteni puncak
dipengaruhi oleh kadar garam total atau kekuatan ionik dan oleh pH fasa gerak. Kenaikkan
kadar garam dalam fasa gerak menurunkan retensi senyawa cuplikan. Hal ini disebabkan oleh
penurunan kemampuan ion cuplikan bersaing dengan ion fasa gerak untuk gugus penukar ion
pada resina.

4. Kromatografi elektroforesis
Kromatografi elektroforesis menyangkut perbedaan migrasi spesies-spesies bermuatan dalam
suatu larutan di bawah pengaruh dari penggunaan suatu gradient potensial. Kecepatan migrasi
setiap spesies tergantung atas ukuran, bentuk dan muatan spesiesnya. Metoda elektroforesis
merupakan metoda pemisahan suatu zat berdasarkan perbedaan muatan dan massa melekul

relative dari komponen-komponennya. Pemisahan terjadi karena perbedaan laju migrasi

komponen-komponen bermuatan oleh pengaruh medan listrik.

2. Kromatografi Gas ( Gas Chromatography )

Kromatografi gas yang biasa juga disebut dengan Gas Chromatography (GC) adalah proses
pemisahan campuran menjadi komponen-komponennya dengan menggunakan gas sebagai
fase bergerak yang melewati suatu lapisan serapan (sorben) yang diam. Teknik instrumental ini
dikenalkan pertama kali pada tahun 1950-an.

Gas Liquid Chromatography ( GLC )

Gas Liquid Chromatography merupakan salah satu jenis dari kromatografi gas yang mana fase
geraknya menggunakan gas dan fase diamnya menggunakkan zat Cair, Kromatografi jenis ini
digunakan untuk memisahkan senyawa-senyawa organik yang mudah menguap misalnya,
untuk menentukan komposisi kimia dari zat-zat yang tidak diketahui didalam bensin.
Gas Solid Chromatography ( GSC )
Gas solid Chromatography merupakan salah satu jenis dari kromatografi gas yang mana fase
geraknya menggunakan gas dan fase diamnya menggunakkan zat padat
Kromatografi juga dapat didasarka atas prinsipnya, misalnya kromatografi partisi (partition
chromatography) dan kromatografi serapan (adsorption Cromatography). (Kimia Fisika Untuk
Paramedis, Estien Yazid, 2005)
Kromatografi partisi cair-cair terdiri dari suatu kolom yang berisi zat padat penunjang halus di
mana pada permukaan terdapat pelarut sebagai fase diamnya. Fase kedua yaitu fase bergerak
yang tidak bercampur dengan cairan dari fase diamnya akan mengalir sepanjang kolom.
Komponen-komponen dari campuran akan terpartisi pada kedua fase akibat adanya
perpindahan diantara kedua fase tersebut. Komponen yang terpartisi lebih banyak pada fase
diam akan tertahan lebih lama di dalam kolom dibandingkan komponen yang lebih banyak
terpartisi pada fase gerak.
Kromatografi adsorpsi didasrkan pada retensi zat terlarut oleh adsorpsi permukaan. Teknik ini
berguna dalam pemisahan senyawa-senyawa nonpolar dan konstituen-konstituen yang sulit
menguap. Pada kromatografi cair-padat, suatu substrat padat bertindak sebagai fase diam.
Pemisahan tergantung pada keteseimbangan yang terbentuk pada bidang antarmuka diantara
butiran-butiran fase diam dan fase cair yang bergarak serta pada kelarutan relatif zat terlarut
pada fase bergaraknya. (Konsep Dasar Kimia Analitik ,S.M. Khopkar,2008)
Berdasarkan fase yang terlibat kromatografi dibedakan menjadi:

a. Kromatografi gas-cair, bila fase geraknya berupa gas dan fase diamnya berupa cairan
yang dilapiskan pada padatan pendukung yang inert.
b. Kromatografi gas-padat, bila fase geraknya berupa gas dan fase diamnya berupa
padatan yang dapat menyerap atau mengadsorb.
c. Kromatografi cair-cair, bila fase gerak dan fase diamnya berupa cairan, di mana fase
diamya dilapiskan pada permukaan padatan pendukung yang inert.
d. Kromatografi cair-padat, bila fase geraknya berupa caiaran sedangkan fase diamnya
berupa padatan yang amorf yang dapat menyerap.

Berdasarkan teknik yang digunakan kromatografi digolongkan menjadi :

a. Kromatogragfi kolom, apabila komponen yang akan dipisahkan bergarak bersama fase
gerak melalui sebuah kolom kemudian setiap komponen terpisahkan berupa zona-zona
pita.
b. Kromatografi planar ( kromatografi lapis tipis dan kromatografi kertas)
Apabila komponen yang akan dipisahkan bergerak bersama fase gerak dalam sebuah
bidang datar. Senyawa yang bergerak berupa noda (spot) yang dapat dikenali dengan
bantuan metode fisika dan kimia. Posisi noda menunjukan identitas suatu senyawa atau
komponen, sedangkan besar atau intensitasnya menunjukan konsentrasinya.

B. Kromatografi Kertas
Kromatografi
kertas
ditemukan
pertama
kali
oleh
Martri,
Consden
dan Gordon.Kromatografi kertas merupakan salah satu metode pemisahan berdasarkan
distribusi suatu senyawa pada dua fasa yaitu fasa diam dan fasa gerak. Pemisahan sederhana
suatu campuran senyawa dapat dilakukan dengan kromatografi kertas, prosesnya dikenal
sebagai analisis kapiler dimana lembaran kertas berfungsi sebagai pengganti kolom.
Kromatografi kertas diterapkan untuk analisis campuran asam amino dengan sukses besar.
Karena asam amino memiliki sifat yang sangat mirip, dan asam-asam amino larut dalam air dan
tidak mudah menguap (tidak mungkin didistilasi), pemisahan asam amino adalah masalah
paling sukar yang dihadapi kimiawan di akhir abad 19 dan awal abad 20. Jadi penemuan
kromatografi kertas merupakan berita sangat baik bagi mereka.
Kimiawan Inggris Richard Laurence Millington Synge (1914-1994) adalah orang pertama yang
menggunakan metoda analisis asam amino dengan kromatografi kertas. Saat campuran asam
amino menaiki lembaran kertas secara vertikal karena ada fenomena kapiler, partisi asam
amino antara fasa mobil dan fasa diam (air) yang teradsorbsi pada selulosa berlangsung
berulang-ulang. Ketiak pelarut mencapai ujung atas kertas proses dihentikan. Setiap asam
amino bergerak dari titik awal sepanjang jarak tertentu. Dari nilai R, masing-masing asam amino
diidentifikasi.
Kromatografi kertas dua-dimensi (2D) menggunakan kertas yang luas bukan lembaran kecil,
dan sampelnya diproses secara dua dimensi dengan dua pelarut.

Kromatografi kertas adalah salah satu pengembangan dari kromatografi partisi yang
menggunakan kertas sebagai padatan pendukung fasa diam. Oleh karena itu disebut
kromatografi kertas. Sebagai fasa diam adalah air yang teradsorpsi pada kertas dan sebagai
larutan pengembang biasanya pelarut organik yang telah dijenuhkan dengan air.
Dalam kromatografi kertas fasa diam didukung oleh suatu zat padat berupa bubuk
selulosa. Fasa diam merupakan zat cair yaitu molekul H 2O yang teradsorpsi dalam selulosa
kertas.fasa gerak berupa campuran pelarut yang akan mendorong senyawa untuk bergerak
disepanjang kolom kapiler. Analisis kualitatif menggunakan kromatografi kertas dilakukan
dengan cara membandingkan harga relative response factor (Rf). Nilai Rf identik dengan time
retention (tR) atau volume retention (VR).
Harga Rf zat baku dapat diidentifikasikan komponen campuran, karena harga besaran
ini bersifat khas untuk setiap zat asal digunakan jenis pengembang yang sama. Kadang-kadang
pemisahan dalam satu arah belum memberikan hasil yang memuaskan. Untuk mendapatkan
hasil yang lebih baik, dapat dipakai cara kromatografi kertas dua dimensi, yang mana letak
kertas diubah sehingga arah pemisahan juga berubah.
Prinsip kerja kromatigrafi kertas
Kromatografi kertas digunanakan baik untuk analisa kualitatif maupun kuantitatif.
Senyawa-senyawa yang dipisahkan kebanyakan bersifat sangat polar, misalnya assam-asam
amino, gula atau pigmen-pigmen alam. Prinsip dasar kromatografi kertas adalah partisi
multiplikatif suatu senyawa antara dua cairan yang saling tidak bercampur. Jadi partisi suatu
senyawa terjadi dalam pelarut yang bergerak lambat pada kertas, komponen-komponen
bergerak pada laju yang berbeda dan campuran dipisahkan berdasarkan pada perbedaan
bercak warna.
Pada teknik kromatografi kertas dipotong memanjang sesuai ukuran bejana yang akan
digunakan. Kertas yang dipakai adalah kertas whatman yang secara komersial tersedia dalam
berbagai macam ukuran dan lembaran. Biasanya dipakai kertas whatman No.1 dengan
kecepatan sedang. Tersedia juga kertas selulosa murni, kertas selulosa yang dimodifikasi,
kertas asam asetil dan kertas serat kaca. Kertas asam asetil dapat digunakan untuk zat-zat
hidrofobik, sedangkan untuk reagen yang korosif dapat digunakan kertas serat kaca. Untuk
pemilihan kertas yang menjadi pertimbangan adalah tingkat kesempurnaan pemisahan,
difusifitas pembentukan spot, efek tailing serta laju pergerakan pelarut. Kertas yang akan
digunakan harus disimpan dalam ruang tertutup atau di tempat yang kering jauh dari sumber
uap terutama yang mempunyai afinitas tinggi terhadap selulosa.
Secara umum kromatografi kertas dilakukan dengan menotolkan larutan yang berisi
sejumlah komponen pada jarak 0,5 sampai 1cm dari tepi kertas. Setelah penetesan larutan
pada kertas, maka bagian bawah kertas dicelupkan dalam larutan pengambang (developing
solution). Larutan ini umumnya terdiri atas campuran beberapa pelarut organik yang telah
dijenuhkan dengan air.
Sistem ini akan terserap oleh kertas dan sebagai akibat dari gaya kapiler akan
merambat sepanjang kertas tersebut. Rambatan ini dapat diusahakan dalam modus naik atau
menurun. Selama proses pemisahan dilakukan, sistem secara keseluruhannya disimpan dalam
tempat tertutup, ruang didalamnya telah jenuh dengan uap sistem pelarut ini.

Beberapa teknik elusi yang biasa digunakan dalam kromatografi kertas yaitu
Metode Penaikan (Ascending)

Kertas digantungkan sedemikian rupa sehingga bagian bawah kertas tercelup pada
pelarut yang terletak di dasar bejana. Noda harus diusahakan tidak sampai tercelup
karena dapat larut dalam pelarut. Pelarut akan naik melalui serat-serat kertas oleh gaya
kapiler menggerakan komponen dengan jarak yang berbeda-beda. Fase gerak akan
naik melalui serat-serat dari kertas oleh gaya kapiler. Biasanya perambatan pelan dan
makin lama menurun karena gaya berat. Cara yang paling sederhana.
Kertas atau lapis tipis sesudah diberi sampel, tepinya setinggi kurang lebih 2,5cm
dicelupkan pada eluen yang ditempatkan di dalam bejana. Eluen akan meresap
pada kertas atau bahan penyangga dan bergerak naik secara kapileri sampai pada
ketinggian yang dikehendaki.
-

Metode Penuurunan (Descending)

Alat yang pokok berupa bejana yang terbuat dari gelas, platina atau logam anti karat
serta bertutup untuk mencegah penguapan dari pelarut. Kertas digantung dalam bejana
dengan ujung di mana aliran mulai bergerak dicelupkan dalam palung kaca yang berisi
pelarut. Pertama kali fase gerak mengalir oleh gaya kapiler, setelah melewati batang
gelas maka aliranya disebabkan oleh gaya gravitasi. kebalikan dari teknik ascending.
Eluen dialirkan dari tepi kertas bagian atas dimana sampel diaplikasikan. Eluen akan

bergerak mengalir (meresap) ke bawah melalui kertas atau bahan penyangga secara
perlahan-lahan sampai batas yang dikehendaki. Agar kertas tidak lepas maka diberi
penahan dari batang gelas. Jika dibanding dengan teknik ascending, maka teknik
descending lebih cepat elusinya oleh karena faktor gravitasi berpengaruh pada
kecepatan aliran eluen dan gerakan komponen yang memisah. Ada satu hal yang perlu
mendapat perhatian pada teknik descending, yaitu cara mengalirkan eluen dan atas ke
bawah. ini dapat ditempuh dengan menghubungkan kertas atau lapis tipis dengan kertas
saring yang dicelupkan pada tangki atau bejana penyedia eluen.Pada kromatografi
kertas lebih banyak digunakan sistem menurun sehingga lebih cepat perambatannya.
Keuntungan yang lain, lembaran kertas yang digunakan lebih panjang sehingga dapat
dipisahkan campuran yang lebih kompleks. Pemisahan yang terjadi berdasar atas
peristiwa partisi, karena fase gerak yang digunakan adalah pelarut organik yang semi
polar. Dan umumnya pelarut yang digunakan mengandung air sehingga air akan
mudah terikat oleh selulosa, dan selulosa dapat mengembang menyerap air, maka air
akan berfungsi sebagai fase diam.

Metode Mendatar (Radial)

Metode ini sangat berbeda dari sebelumnya. Biasanya kertas dibentuk bulat yang
tengahnya diberi sumbu dari benang atau gulungan kertas. Noda ditempatkan pada
pusat kertas kemudian pelarut akan naik melalaui sumbu sehingga membasahi kertas
untuk kemudian mengembang melingkar membawa komponan yang di pisahkan.
Teknik horizontal (mendatar)
Noda dicelupkan ditempatkan pada pusat dari kertas (umumnya kertas saring berbentuk
bulat) yang diberi sumbu. Aliran pelarut disebabkan oleh gaya kapiler. Kertas diletakan secara
horisontal sehingga sumbu tercerlup pada fase gerak. Selanjutnya fase gerak bergerak ke arah
tepi kertas sambil membawa komponen-komponen campuran. Bercak-bercak yang terjadi
berupa garis lengkung dengan diameter makin panjang bila bercak makin ke tepi.
Teknik pengembangan

metode satu arah (one way direction) dan metoda dua arah (two ways direction).
Pada metoda satu arah, kertas atau lapis tipis dikembangkan melalui satu sisinya di mana
sampel dimuatkan. Pada metoda dua arah, kertas atau lapis tipis yang telah dikembangkan,
dilakukan pengembangan sekali lagi melalui tepi siku-siku kertas atau lapis tipis.
Pengembangan dikerjakan di dalam suatu tangki atau bejana dan kaca sepaya tampak dan
luar, dan ditutup sehingga ruang di dalam tangki akan jenuh dengan uap eluen. Kejenuhan
ruangan termasuk faktor keberhasilan pemisahan.
Bila permukaan pelarut telah mengembang atau bergerak pada batas tertentu, maka
kertas dikeluarkan dari bejana dan batas permukaan pelarut diberi tanda lalu dikeringkan. Jika
senyawa yang dipisahkan berwarna akan nampak sebagai noda-noda yang terpisah. Tetapi jika
komponen zat tidak berwarna (umumnya senyawa organik), maka dapat dideteksi dengan cara
fisika atau kimia. Pada cara fisika noda komponen disinari lampu ultraviolet dengan panjang
gelombang 254-370 nm yang akan memberikan fluorescensi. Secara kimia noda disemprot
dengan pereaksi tertentu, sehingga memberikan warna spesifik. Biasanya untuk mendeteksi
asam-asam amino digunakan pereaksi ninhidrin 0,1% dalam butanol. Warna akan nampak
merah-ungu sekitar 4 menit setelah dipanaskan 1000C.
Setelah letak noda komponen diketahui dan diberi tanda batas, harga Rf (retardation
faktor) dapat dihtung.

Rf =

jarak yang ditempuh komponen

jarak yang ditempuh pelarut

Nilai Rf bersifat karakteristik dan menunjukan identitas masing-masing komponen.

Komponen yang paling mudah larut dalam pelarut harganya akan mendekati satu. Sedangkan
komponen yang kelarutannya rendah akan mempunyai Rf hampir nol. Harga Rf dipengaruhi
oleh beberapa faktor seperti suhu, pelarut, kertas, sifat campuran, dan ukuran bejana. Nilai Rf
dapat digunakan untuk identifikasi kualitatif dari senyawa yang tidak diketahui dengan
membandingkan terhadap senyawa standar. Bila harga Rf-nya sama, berarti kedua senyawa
tersebut identik. Sedangkan untuk analisa kuantitatif, komponen-komponen yang terpisah dapat
dipotong-potong kemudian dilarutkan secara terpisah dalam pelarut yang sesuai untuk
ditetapkan kadarnya dengan metode lain, misalnya spektrofotometri.
Struktur dasar kertas

Kertas dibuat dari serat selulosa. Selulosa merupakan polimer dari gula sederhana, yaitu
glukosa. Sangat menarik untuk mencoba untuk menjelaskan kromatografi kertas dalam
kerangka bahwa senyawa-senyawa berbeda diserap pada tingkatan yang berbeda pada
permukaan kertas. Kompleksitas timbul karena serat-serat selulosa beratraksi dengan uap air
dari atmosfer sebagaimana halnya air yang timbul pada saat pembuatan kertas. Oleh
karenanya, anda dapat berpikir yakni kertas sebagai serat-serat selulosa dengan lapisan yang
sangat tipis dari molekul-molekul air yang berikatan pada permukaan. Interaksi ini dengan air
merupakan efek yang sangat penting selama pengerjaan kromatografi kertas.
Sifat Fisika kimia kertas
Kertas terdiri dari 98 -99 % selulose, 0,3-10 % selulose, dan 0,4-0,8 % pentosan.
Juga mempunyai gugus karboksilat yang dapat menimbulkan muatan negatif pada
kertas.
Kertas kromatografi terdapat kontaminan asam amino yang mempunyai kadar Nitrogen
15 mg/kg kertas.Senyawa lipofilik 25 mg/kg dan senyawa an organik (kadar abu) 0,040,07%,
Senyawa kontaminan tidak mengganggu dalam pemisahan sampel pada
kromatografi.Yang penting kemampuan absorbsi dan kenaikkan kapileritas masingmasing kertas.
Whatman no.1 sebagai kertas standard yang digunakan, no. 3MM digunakan untuk
preparatif. Sedangkan no. 4 untuk elusi yang cepat, dan 33 ET untuk elusi sangat cepat.

Ukuran kertas yang digunakan umumnya :

Kromatografi menaik : panjang kertas sekitar 20 cm
Kromatografi menurun : panjang kertas sampai 50 cm atau lebih
Kromatografi mendatar sirkuler : diameter kertas 12 20 cm.
Kerapatan dan ketebalan kertas akan berpengaruh pada kecepatan aliran eluen, sehingga
juga akan berpengaruh pada kesempurnaan pemisahan komponen-komponen. Gerakan dan
pemisahan komponen juga tergantung pada jenis pelarut (eluen) yang diguriakan. . Eluen dapat
terdiri atas satu macam pelarut atau campuran dan dua atau lebih pelarut, tetapi makin banyak
campuran pelarut akan sulit menjenuhkan lingkungan pelat. Juga perlu diingat bahwa
campuran pelarut harus saling tidak melarutkan atau bersifat immisibel, tetapi sampel harus
mempunyai kelarutan yang tinggi pada eluen. Eluen yang mudah menguap dan tidak
meninggalkan noda pada kertas pada umumnya lebih baik digunakan.

KLASIFIKASI KROMATOGRAFI KERTAS BERDASARKAN PELARUT YANG DIGUNAKAN

Kromatografi kertas menggunakan pelarut non polar Anggaplah anda menggunakan pelarut
non polar seperti heksana untuk mengerjakan kromatogram. Molekul-molekul polar dalam
campuran yang anda coba untuk pisahkan akan memiliki sedikit atraksi untuk molekul-molekul
air dan molekul-molekul yang melekat pada selulosa, dan karena akan menghabiskan banyak
waktunya untuk larut dalam pelarut yang bergerak. Molekul-molekul seperti ini akan bergerak
sepanjang kertas diangkut oleh pelarut. Mereka akan memiliki nilai Rf yang relatif tinggi.
Dengan kata lain, molekul-molekul polar akan memiliki atraksi yang tinggi untuk molekulmolekul air dan kurang untuk pelarut yang non polar. Dan karenanya, cenderung untuk larut
dalam lapisan tipis air sekitar serat lebih besar daripada pelarut yang bergerak. Karena molekulmolekul ini menghabiskan waktu untuk larut dalam fase diam dan kurang dalam fase gerak,
molekulmolekul
tidak akan bergerak sangat cepat pada kertas. Kecenderungan senyawa untuk membagi
waktunya antara dua pelarut yang tidak bercampur (misalnya pelarut heksana dan air yang
mana tidak bercampur) disebut sebagai partisi.
Kromatografi kertas menggunakan pelarut non-polar kemudian menjadi tipe kromatografi
partisi.

Kromatografi kertas menggunakan air dan pelarut polar lainnya

Jika anda mempunyai air sebagai fase diam, tidak akan sangat berbeda makna antara jumlah
waktu substansi menghabiskan waktu dalam campuran dalam bentuk lainnya. Seluruh
substansi seharusnya setimbang kelarutannya (terlarut setimbang) dalam keduanya. Namun,
kromatogram pertama yang telah anda buat mungkin merupakan tinta menggunakan air
sebagai pelarut. Jika air bertindak sebagai fase gerak selayaknya menjadi fase diam, akan
terdapat perbedaan mekanisme pada mekanisme kerja dan harus setimbang untuk pelarutpelarut polar seperti alkohol, misalnya. Partisi hanya dapat terjadi antara pelarut yang tidak
bercampur satu dengan lainnya. Pelarut-pelarut polar seperti alkohol rendah bercampur dengan
air.

Faktor yang mempengaruhi harga Rf yaitu

1.

Pelarut

Disebabkan pentingnya koefesien partisi, maka perubahan-perubahan yang sangat kecil dalam
komposisi pelarut dapat menyebabkan perubahan-perubahan harga Rf

2.

Suhu

Perubahan dalam suhu merubah koefesien partisi dan juga kecepatan aliran

3.

Ukuran dari bejana

Volume dari bejana mempengaruhi homogenitas dari atmosfer jadi mempengaruhi kecepatan
penguapan dari komponen-komponen pelarut dari kertas. Jika bejana besar digunakan, ada
tendensi perambatan lebih lama, seperti perubahan-perubahan komposisi pelarut sepanjang
keras, maka koefesien partisi akan berubah juga. Dua faktor yaitu penguapan dan komposisi
mempengaruhi harga Rf.

4.

Kertas

Pengaruh utama kertas pada harga-harga Rf timbul dari perubahan ion dan serapan, yang
berbeda untuk macam-macam kertas. Kertas-kertas mempengaruhi kecepatan aliran , ia akan
juga mempengaruhi pada keseimbangan partisi.

5.

Sifat dari campuran

Berbagai senyawa mengalami partisi diantara volume-volume yang sama dari fase tetap dan
bergerak . Mereka hampir selalu mempengaruhi karakteristik dari kelarutan satu terhadap lainya
hingga terhadap harga-harga Rf mereka.