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CONTAGEM MANUAL DE PLAQUETAS PELO MÉTODO DE

MASPES & JAMRA

INTRODUÇÃO
A contagem de plaquetas é uma prática rotineira em laboratórios, mesmo naqueles com hematologia
totalmente automatizados. Dentre as principais limitações da automação, destaca-se a elevação do
coeficiente de variação (CV) em trombocitopenias, sendo relatado um CV de 10% nas contagens entre 40
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mil a 50 mil/mm , chegando a 50% em contagens abaixo de 20 mil plaquetas/mm (1). Convém mencionar
que uma contagem exata é extremamente importante nas trombocitopenias graves.
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No Brasil é muito difundido o uso de equipamentos CC-530 e CC-550 , fabricados pela CELM. Tais
sistemas de automação em hematologia satisfazem o binômio custo-benefício para laboratórios de pequeno
e médio porte, porém apresentam como limitação não realizarem a contagem de plaquetas. Adicionalmente,
ainda é rotineira a realização manual do hemograma e que os sistemas totalmente automatizados de
hematologia apresentam limitações para contagem de plaquetas em diversas situações.

INTERFERÊNCIAS PRÉ-ANALÍTICAS
As interferências pré-analíticas respondem pela maior parte das contagens de plaquetas diminuída. A coleta
torna a fase mais crítica. Os erros podem ser atribuídos a:
• Coleta traumática, coleta demorada, venopunção múltipla. Conseqüências:
→ Agregação plaquetária
→ Microcoágulos
→ Coágulos
• Agregação plaquetária dependente de EDTA
• Satelitismo plaquetário

SIGNIFICADO CLÍNICO
As contagens de plaquetas mais precisas são importantes no tratamento de um paciente trobocitopênico, a
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diferença de um número de plaquetas de 5.000 e 20.000 mm representa uma diferença real em risco de
sangramento potencialmente fatal (2).
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• 150 mil a 400 mil/mm : intervalo de referência normal;
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• De 100 mil a 150 mil/mm : o paciente permanece, geralmente, assintomático e com o tempo de
sangramento normal;
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• Inferior a 50 mil a 100 mil/mm : hemorragias após trauma grave; o tempo de sangramento está
ligeiramente prolongado;
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• Inferior a 50 mil/mm : aparecimento de lesões purpúricas após trauma ligeiro e hemorragias após
cirurgia envolvendo mucosas, isto é, contra-indica a cirurgia;
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• Inferior a 20 mil/mm : hemorragias espontâneas (geralmente petéquias, mas também
intracranianas ou outras).

METODOLOGIAS

MÉTODOS INDIRETOS
Os métodos indiretos consistem em verificar a proporção de plaquetas em esfregaço de sangue corado e
relacionar estes dados com o número de eritrócitos por milímetro cúbico. A contagem de plaquetas é feita
obrigatoriamente em objetiva de imersão onde os eritrócitos se encontram bem soltos, sendo que esta
afirmação apresenta conotações subjetivas.

Contagem_de_plaquetas_6725661.doc Criado por Rubens de Oliveira Santos pagina 1


Limitações dos métodos indiretos:
• Elevado coeficiente de variação
• Dificuldade em padronização da técnica.

Método de Fônio
A técnica consiste em contar as plaquetas existentes em cinco campos, que devem conter cerca de 200
hemácias cada campo, logo se faz regra de três, relacionando o número de plaquetas contado, o número de
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hemácias contado e o número de hemácias por mm de sangue.

Método de Nosanchuk
Este método advém de estudos com contadores automatizados, determinam o número de plaquetas pela
multiplicação por um fator de 20.000, que transforma o número de plaquetas por campo em número de
plaquetas por milímetro cúbico, o fator determinado foi obtido em estudos com contadores automatizados.
Neste tipo de estimativa não se faz necessário correlacionar eritrócitos e plaquetas, tampouco saber a
contagem de eritrócitos.Mas por outro lado, requer, de modo determinante que a análise da média de
plaquetas por campo ao final da contagem de dez campos.
Deve ser realizada obrigatoriamente em local onde a extensão de eritrócitos seja nítida e majoritariamente
solta, mas ainda assim com alguns eritrócitos ainda se tocando, independente do número de eritrócitos por
campo, o que requer de uma ótima prática, por isso operadores menos experientes devem dobrar os
cuidados com sangues anêmicos, porque a região ideal para avaliação dos eritrócitos certamente terá
menor número de células que aquela mesma região de esfregaço corado de um paciente normal, ou seja,
não anêmico e com número maior de eritrócitos.

MÉTODO DIRETO AUTOMATIZADO


Os métodos diretos de contagem de plaquetas podem ser realizados por sistemas automatizados ou
contagem em câmara de Neubauer.

Método Direto Automatizado


São duas as tecnologias básicas de contagem de células: Impedância elétrica e tecnologia de contagem de
células por difração da luz. Atualmente grande parte dos contadores automatizados baseia-se no princípio
de impedância elétrica ou de sinais ópticos para contar plaquetas no sangue periférico, usando o volume de
partículas para contá-las (3).
Dentre as limitações dos métodos automatizados destacam-se:
• Presença de macroplaquetas
• Presença de agregados plaquetários
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• Alto coeficiente de variação em trombocitopenias inferiores a 40 mil/mm

MÉTODO DIRETO EM CAMARA DE NEUBAUER


Todos os métodos em câmara apresentam como limitações:
• São trabalhosos
• Erros inerentes devido à distribuição irregular de células na câmara de contagem

Método de Brecher & Cronkite


Está fundamentado em determinar as plaquetas em câmara de Neubauer após diluição de sangue total em
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oxalato de amônio a 1% (lise os eritrócitos), desta forma obter o número de plaquetas/mm de sangue.
Para esta técnica se faz diluição 1:20, diluindo 20µL de sangue total em 400µL de diluente, encher a câmara
e deixá-lo em repouso por 20 minutos em câmara úmida, fazer a leitura e determinar o número total de
plaquetas observados nos cinco quadrados do quadrante central do retículo, ou seja, no local também
destinado à contagem de hemácias.
Desvantagens:
• Erros inerentes à contagem em câmara
• Detritos celulares que dificultam a contagem

Contagem_de_plaquetas_6725661.doc Criado por Rubens de Oliveira Santos pagina 2


Método de Todd & Sanford
Trata-se de um método direto de contagem de plaquetas em câmara de Neubauer. A amostra é
previamente diluída 1:200 numa das seguintes diluições (4):
a) Líquido de Rees e Ecker: citrato de sódio 3,8 g, formol 40% 0,2 mL, azul de cresil brilhante 0,1 g e
água destilada 100,0 mL. Este líquido preserva as hemácias, permitindo contagem simultânea;
b) Líquido de Leake e Guy: oxalato de sódio 1,6 g, formol 40% 6,0 mL, Cristal de violeta 0,05g e água
destilada 100,0 mL;
c) Liquido de Wright e Kinnicutt: duas partes de solução aquosa de azul de cresil brilhante e três
partes de solução aquosa de cianeto de potássio 1:1400.
A diluição é colocada em câmara de Neubauer. Deixa em repouso em câmara úmida por 10 minutos e
procede a leitura em aumento de 400 vezes. Conta-se as plaquetas nos cinco quadrantes da região central
(destinado à contagem de eritrócitos). O resultado é multiplicado por 10.000.
Desvantagens:
• Erros inerentes à contagem em câmara
• Presença de vários elementos fugurados na área de contagem (eritrócitos)

METODOLOGIA DE MASPES & JAMRA (3)


Trata-se de um procedimento de contagem de plaquetas manual e direto descrito em 1955 e modificado
posteriormente por Oliveira & Barreto em 2003. No processo de separação dos eritrócitos do plasma, tanto
por sedimentação espontânea, quanto por baixa força centrifuga, as plaquetas se arranjam de uma maneira
uniforme distribuídas no plasma e mantém em valores constantes, embora boa parte de plasma livre de
plaquetas fique retida entre os eritrócitos sedimentados, o que torna o plasma sobrenadante
superconcentrado de plaquetas (3). Alternativamente, o valor de plaquetas no plasma pode ser corrigido
empregando a tabela (anexo 1) com índices calculados através da fórmula:
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plaq/mm sangue = plaq/mm plasma x {[100 – (Ht + Ht/2)]/100}

AMOSTRA
• Sangue total com EDTA

MATERIAIS E EQUIPAMENTOS
• Material para determinação de hematócrito (manual ou automatizado)
• Centrífuga
• Câmara de Neubauer
• Microscópio
• Placa de Petri 100 mm com algodão umedecido
• Tubos de ensaio 12x75 mm (tubos de hemólise)
• Pipetadores automáticos

Solução diluidora (formalina 1%)

Formol 40% 1,0 mL


NaCl 0,85% q.s.p. 100 mL

QUADRANTES DE CONTAGEM
Os quadrantes no retículo de Neubauer destinados à contagem são os mesmos recomendados para
eritrócitos e estão indicados na figura 1 como H1, H2, H3, H4 e H5:

Contagem_de_plaquetas_6725661.doc Criado por Rubens de Oliveira Santos pagina 3


Figura 1: quadrantes de contagem para protocolos A, B e C.

PROCEDIMENTO
Um critério que assegura a exatidão e reprodutibilidade dos resultados é que a soma nos cinco quadrantes
de contagem (H1+H2+H3+H4+H5) seja entre 150 a 200 plaquetas. Em amostras plaquetopênicas, diluições
alternativas devem ser empregadas, sendo então sugeridos quatro protocolos de contagem conforme o
grau de trombocitopenia.

Obtenção de plasma rico em plaquetas (PRP)


1. Determinar o hematócrito do paciente por centrifugação ou automação;
2. Centrifugar o sangue total do paciente (2,5 a 4,0 mL) a 1.000 rpm por um minuto. Alternativamente
pode deixar a amostra em repouso por 30 min

Protocolo A – PARA AMOSTRAS NÃO-PLAQUETOPÊNICAS


1. Pipetar 980 µL de solução diluente em um tubo 12x75 mm;
2. Aspirar 20 µL de PRP e diluir no tubo com solução diluidora (1:50);
3. Encher o retículo de Neubauer;
4. Colocar em câmara úmida e deixar em repouso por 20 min em posição horizontal;
5. Contar as plaquetas nos cinco quadrantes de contagem de hemácias (H1+H2+H3+H4+H5) em
aumento de 400x (objetiva de 40x e ocular de 10x).

Protocolo B – PARA AMOSTRAS PLAQUETOPÊNICAS


• Proceder como protocolo A, empregando diluição de 1:20:
→ 20 µL PRP + 380 µL solução diluente.

Protocolo C – PARA AMOSTRAS PLAQUETOPÊNICAS


• Empregar diluição de 1:10:
→ 20 µL PRP + 180 µL solução diluente.

Protocolo D – PARA AMOSTRAS SEVERAMENTE PLAQUETOPÊNICAS


• Proceder como no protocolo C, mas quando a contagem nos cinco quadrantes de hemácias
(H1+H2+H3+H4+H5) for inferior a 150 plaquetas;
• Contar todo o quadrante central, indicado pela região circundada na figura 2.

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Figura 2: quadrantes de contagem para protocolo D.

CÁLCULOS
Os resultados da contagem em câmara representam o valor de plaquetas no plasma, devendo utilizar o
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fator de correção (FC) para conversão de plaq/mm plasma para plaq/mm sangue através da formula
abaixo. Esta fator tem um valor fixo para cada valor de hematócrito. A tabela no anexo 1 apresenta os
valores de acordo com o hematócrito.

FC = {[100 – (Ht + Ht/2)]/100}

Deve-se considerar também o fator de diluição empregado.


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Com os cálculos abaixo se obtém a contagem de plaquetas por plaq/mm sangue, já considerando a
diluição empregada (protocolo) e o fator de correção pelo hematócrito (FC).

Protocolo A

(H1+H2+H3+H4+H5) x 2500 x FC*

Protocolo B

(H1+H2+H3+H4+H5) x 1000 x FC*

Protocolo C

(H1+H2+H3+H4+H5) x 500 x FC*

Protocolo D

(Quadrante central) x 100 x FC*

* Anexo 1

Contagem_de_plaquetas_6725661.doc Criado por Rubens de Oliveira Santos pagina 5


REFERÊNCIAS
1. LEITE, LAC; SILVA JUNIOR, MN; MIRANDA, MS. Comparação Entre a Contagem de Plaquetas
pelos Métodos Manual e Automatizado. Newslab, 81 ed. 2007, p. 106-114.
2. RAPAPORT, S. I. Hematologia: introdução. 2. ed. São Paulo: Roca, 1900.
3. OLIVEIRA, R. A. G. Hemograma: como fazer e interpretar. São Paulo: Livraria Medica Paulista, 2007.
4. LIMA, AO et al. Métodos de laboratório aplicados à clínica. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan,
2001.

ANEXOS
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Anexo 1: fator de correção (FC) para conversão de plaq/mm plasma para plaq/mm sangue pela fórmula
matemática FC = {[100 – (Ht + Ht/2)] /100}

Hematócrito FC Hematócrito FC
10% 0,767 36% 0,394
11% 0,753 37% 0,380
12% 0,738 38% 0,365
13% 0,724 39% 0,351
14% 0,710 40% 0,408
15% 0,695 41% 0,394
16% 0,681 42% 0,380
17% 0,667 43% 0,365
18% 0,652 44% 0,351
19% 0,638 45% 0,336
20% 0,624 46% 0,322
21% 0,609 47% 0,308
22% 0,595 48% 0,293
23% 0,581 49% 0,279
24% 0,566 50% 0,265
25% 0,552 51% 0,250
26% 0,537 52% 0,236
27% 0,523 53% 0,222
28% 0,509 54% 0,207
29% 0,494 55% 0,193
30% 0,480 56% 0,179
31% 0,466 57% 0,164
32% 0,451 58% 0,150
33% 0,437 59% 0,135
34% 0,423 60% 0,121
35% 0,408 61% 0,085

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