APOPTOZA

Apoptoza (apoptosis caderea petalelor florilor sau a frunzelor din pom) sau
moartea celulara programata reprezinta un element central de mentinere a
echilibrului intre generarea si moartea celulelor. APPT apare intr-o varietate
de procese biologice: diferentiere, dezvoltare, maturizare celulara si in timpul
manifestarii proceselor imunologice.

Diferente intre apoptoza si necroza

Necroza este o forma patologica de moartea celulara aparuta ca urmare a

unei lezari celulare acute (distrugeri mecanice, hipoxie, liza celulare mediata
de complement sau actiunea unui agent toxic foarte puternic).

- este asociata initial cu o pierdere a integritatii membranei celulare,

urmata de o pierdere a continutului celular si aparitia unui proces inflamator
eliminarea celulelor necrotice este efectuata exclusiv de celulele sistemului
mononuclear fagocitic.

APPT afecteaza o singura celula sau grupuri mici de celule izolate si este un
proces asincron.

- moartea celulelor prin apoptoza este caracterizata printr-un proces

de autodigestie controlata a celulelor isi mentin integritatea membranei
plasmatice. - in faza finala se separa in fragmente mici, delimitatea de membrane,
denumite corpi apoptotici si care sunt ulterior fagocitate de macrofage, fara
inducerea unui raspuns inflamator.

Generalitati

APPT apare:
- in timpul embriogenezei (ex. involutia canalelor Wolff si Muller),
- in timpul organogenezei,
- in timpul turnover-ului tisular normal,
- in cazul absentei actiunii unui hormon trofic asupra tesutului

sau tinta,
- la indepartarea timocitelor imature care au suferit o selectie
negativa in timus (nu au fenotipul corespunzator)

APPT celulelor somatice adulte include:

- eliminarea celulelor din timpul refacerii tesutului epitelial si a

formarii keratinocitelor,
- atrofia prostatei si a cortexului adrenal a ca urmare a reducerii
stimulului hormonului trofic,
- atrofia fiziologica a glandei mamare postlactatie,

- eliminarea limfocitelor B sau T dupa indepartarea actiunii

stimulante a citokinelor trofice la sfarsitul reactiilor imunologice,
- indepartea PMN dupa extravazarea lor in tesuturile inflamate.

50-70 miliarde celule mor in fiecare zi, in corpul uman, ca rezultat al

apoptozei.

Declansarea APPT prin actiunea unor factori este specifica tipului celular,
acelasi factor putand induce sau nu acest proces, in functie de celulele
asupra carora actioneaza. (ex. radiatiile ionizante determina aparitia APPT in
celulele hematopoietice, dar nu au acelasi efect si asupra fibroblastilor sau
celulelor de origine epiteliala).

APPT este reglata prin cai de traducere ale semnalelor imlicate si in alte
raspunsuri celulare specifice: modificarea calciului intracelular, activarea
protein kinazelor si a fosfatazelor, modificari ale ph-ului si stressul oxidativ

Se caracterizeaza printr-o cascada de modificari morfologice si biochimice

distincte.

Stimuli care induc APPT

- semnale fiziologice normale, cum ar fi hormonii care produc eliminarea

celulelor in timpul diferentierii sau involutiei tesuturilor si organelor

- eliminarea factorilor care inhiba APPT sau a unor componenti extracelulari

importanti, ex. factorii de crestere.

- actiunea unor stimuli toxici in doze mici: medicamente citotoxice,

hipertermia, hipoxia in grad redus.

Etapele apoptozei
In urma stimulului apoptotic, celula va suferi o degradare controlata a organitelor
celulare prin activarea caspazelor proteolitice. Modificarile morfologice sunt:

Micsorarea celulei datorita dezintegrarii citoscheletului proteic de catre

caspaze.

Citoplasma apare densa si organitele strans compactate.

Condensarea cromatinei de-a lungul membranei nucleare (picnoza)

Membrana nucleara se intrerupe si ADN-ul se fragmenteaza intr-un proces

numit kariorrhexis. Nucleul se imparte in mase granulare acestei degradari.

Membrana celulara prezinta umflaturi neregulate.

Celula se fragmenteaza in vezicule denumite corpi apoptotici, care sunt apoi

fagocitati.

Apoptoza progreseaza rapid si in timpul kariorrhexis-ului, activarea

endonucleazelor produce fragmente scurte de ADN, de marimi egale. Acestea
prezinta un aspect caracteristic de scara (ADN ladder) in gelul de agar dupa
electroforeza in laborator. Vizualizarea acestui fenomen diferentiaza apoptoza
de moartea celulara ischemica sau toxica.

Modificarile nucleare

Fazele initiale sunt caracterizate prin condensarea materialului nuclear

(picnoza), urmata de o marginalizare marcata a cromatinei de-a lungul
membranei nucleare. Microscopic, apar ca granule fine, impachetate strans.

Modificarile cromatinei sunt deseori insotite de convolutii ale membranei

nucleare. O caracteristica este prezenta unor mase granulare rotunde sau
ovalare provenite din centrul nucleolar fibrilar situatie in stransa apozitie cu
cromatina condensata.

Nucleul se rupe prin inmugurire in fragmente discrete care sunt inca

marginite de o membrana dubla.

Modificarile membranei celulare

La nivelul membranei celulare, APPT este caracterizata initial prin pierderea

structurilor membranare specializate, cum ar fi microvilii si regiunile de
contact reprezentate de desmozomi. In aceasta faza se produc modificari

biochimice discrete ale structurii

externalizarea fosfatidil serinei.

membranei

celulare,

in

special

Etapa umflaturilor citoplasmatice apare simultan cu primele evenimente

nucleare si reprezinta un proces de condensare al citoplasmei care duce la
compactizarea organitelor celulare.

Doar relativa condensare a citoplasmei in absenta modificarilor tipice NU

reprezinta un semn distinctiv al procesului apoptotic, densitatea citoplasmei
variind considerabil de la o celula la alta, in multe tesuturi normale.

Fragmentarea celulei si fagocitoza

Celulele se fragmenteaza si formeaza corpi apoptotici, delimitati de

membrane care contin material nuclear, organite intacte si citoplasma
condensata.
Inainte de descrierea amanuntita a modificarilor morfologice care au loc in
timpul procesului apoptotic, aparitia unor inmugururi citoplasmatice in
culturile celulare de celule leucemice era descrisa in lucrarile de specialitate
ca posibilitatea existentei unor inmultiri prin inmugurire.

Cei mai multi corpi apoptotici sunt fagocitati rapid de catre macrofagele
rezidente sau de catre alte celule din vecinatate cum ar fi celulele epiteliale si
celulele musculare netede vasculare. In interiorul fagozomilor corpii
apoptotici sufera modificari degenerative si in final sunt degradati de catre
enzimele lizozomale (foto).

Fagocitoza este o componenta normala a procesului de APPT, celulele

apoptotice exprimand pe suprafata lor markeri care determina captarealiganzi pentru receporii macrofagelor (ex. fosfatidil serina pentru receptorii
fosfatidil serinei, trombospondina pentru receptorii trombospondinei si lanturi
glucidice pentru lectine).

Celulele viabile exprima CD47 pe suprafata membranei, care se leaga de

receptorul SIRP- al macrofagelor pentru a preveni fagocitoza. Celulele
apoptotice nu mai exprima CD47 si prezinta calreticulina, care va fi
recunoscuta de adiponectina macrofagelor, urmand a se initia adeziunea si
fagocitoza.

Genele apoptozei

Cunostintele actuale au fost obtinute prin studii pe un nematod transparent,

Caenorhabditis elaegans, la care au fost identificate 3 gene care codifica
proteine implicate in initierea si desfasurarea APPT: ced-3, ced-4, ced-9.
Caenorhabditis ele

Mamifere

Functie

Cunostintele
actuale
au
fost
obtinute prin studii pe un nematod
transparent,
Caenorhabditis
elaegans, la care au fost identificate
3 gene care codifica proteine
implicate in initierea si desfasurarea
APPT: ced-3, ced-4, ced-9.
gans
Ced-3

Enzima de
interleukinei
caspaza 1

conversie a
1
(ICE),

Ced-4

Factorul de activare
proteazei
implicate
apoptoza (Apaf 1)

Ced-9

Bcl-2, Bcl-XL

al
in

Efector al APPT

Activarea caspazei
(CPP32, apopaina)

Antiapoptotica,
antioxidanta

Activarea caspazelor in timpul apoptozei

Apoptoza in patogeneza si tratamentul cancerului

APPT reprezinta o metoda eficienta de prevenire a transformarilor maligne
deoarece elimina celulele cu leziuni genetice.
APPT defectuoasa poate promova aparitia malignitatii permitand acumularea
de celule capabile sa se divida si obstructionand excluderea variantelor
genetice cu potential malign crescut.

ADN-ul oncogenelor virale sta la baza unui numar foarte redus de neoplasme
umane. Pentru restul bolilor maligne, oncogenele celulare nevirale si
netransmisibile stau la baza aparitiei mutatiilor in genele celulor normale.
Carcinogenii chimici sau radiatiile ionizante pot produce mutatii ale
protooncogenelor.
p53
Lezarea ADN determina o blocare a celulei in faza G1 a ciclului celular
mediata de p53, gena apoptotica, in cazul in care leziunea nu poate fi
reparata .
Supresia mortii celulare prin p53 mutante poate duce la cancer. Proteina p53
mutanta nu mai are capactatea de a se lega de nucleu si de a bloca celulele
in G1 in cazul aparitiei de ADN lezat si permite replicarea ADN-ului cu leziuni.

Pierderea functiei p53 apare in 70% din cancerele colo-rectale, in 50% din
cancerele pulmonare si in 40% din cancerele de san.Aparitia proteinelor p53
mutante in aproximativ 50% din totalitatea neoplasmelor umane reprezinta
una din cele mai comune caracteristici ale malignitatii.

Incapacitatea celulelor cu p53 mutant de a intra in APPT, ca raspuns la

lezarea ADN, explica rezistenta la agentii chimioterapici sau la radiatii
ionizante a celulelor tumorale cu p53 mutant, nivelul acestuia constituind un
criteriu in aprecierea raspunsului la chimioterapie.

Calea p53: intr-o celula normala, p53 este inactivata de catre mdm2. Dupa
lezarea ADN sau alte agresiuni, diferite cai vor conduce la disocierea
complexului p53 si mdm2. Odata activat, p53 va bloca ciclul celular pentru a
permite fie repararea si supravietuirea celulei sau apoptoza pentru a elimina
celula lezata. Nu se cunoaste in prezent cum p53 face alegerea.
p73
Gena este localizata in regiunea cromozomiala implicata in patogeneza
neuroblastoamelor. Ea mimeaza o serie de activitati ale p53 de promovare a
procesului apoptotic.
Bcl-2

Asociata membranei mitocondriale inhiba APPT la cel putin 3 nivele:

- controlul potentialului de membrana prin tiolii mitocondriali
- reglarea permeabilitatii de membrana pentru moleculele mici
pro apoptotice
proapoptotice

ancorarea

de

membrana

mitocondriala

proteinelor

Proteina bcl-2 a fost izolata in 70% din cancerele umane de san, 30-60% din
cele de prostata si 90% din cele colo rectale. Este asociata cu prognostic
prost in leucemii, cancer prostatic, cancer de colon si neuroblastom.

Exprimarea in exces a bcl-2 in unele linii tumorale confera celulelor rezistenta

la agentii chimioterapici cum ar fi citozinarabinoza, metotrexat, vincristina si
cisplatin.
c-myc

Codifica o proteina cu viata scurta (aproximativ 20 de minute) care se leaga

specific de ADN. Proteina c-myc este un factor de transcriptie care
supreseaza blocarea cresterii si promoveaza proliferarea prin modularea unor
gene tinta. In cazul existentei unui nivel scazut de factor de crestere sau al
leziunilor genomului, proteina c-myc este un inductor potent al APPT. Pare a fi
activata in toate tumorile.
FAS/Apo-1

Este o proteina de membrana care apartine familiei de receptori TNF/NGF.

Gena FAS/Apo-1 poate fi considerata o gena supresoare a tumorilor datorita
rolului ei pozitiv in inducerea APPT si de asemenea FAS/Apo-1 nefunctionala
reprezinta un promotor al oncogenezei datorita incapacitatii de inducere a
procesului apoptotic.
FASL

Proteina care se leaga de receptorul FAS si joaca un rol important in scaparea

de sub controlul sistemului imun al tumorilor maligne. FASL este exprimata in
unele si leucemii limfocitare T si in cancerele de colon. Potentialul agresiv si
metastatic al unor tumori solide precum cancerul de colon poate fi datorat
faptului ca exprimarea FASL de catre celula maligna duce la semnalizarea
APPT in celulele T activate infiltrate.Celula tumorala nu exprima receptori FAS
si exprimarea FASL marcheaza celula maligna ca tinta pentru distrugere prin
activarea unui raspuns inflamator.
DAP-kinaza (death associated protein)

Este o kinaza Ca/ calmodulin dependenta care fosforileaza resturi de serina si

treonina din proteine. Initial a fost descrisa ca mediator pozitiv al procesului
apoptitic indus de interferonul . Absenta exprimarii DAP-kinazei suprima
procesul apoptotic si promoveaza formarea metastazelor. Exprimarea ei este
frecvent pierduta in carcinoamele umane si in leucemia cu celule B.
Exprimarea DAP este absenta la celulele cu potential de metastazare ridicat
si prezenta la celelalte.

Caspazele
Cercetarile efectuate aupra inhibitorilor caspazelor au aratat ca inhibitorii
specifici ambelor cai de activare ale caspazelor (prin participarea

mitocondriilor sau prin calea de semnalizare a receptorilor tanatogeni) sunt

exprimati in exces in tesuturile tumorale.
Exprimarea in exces a proteinei FLIP, inhibitor al caspazelor, care blocheaza
transmiterea proceselor apoptotice de la receptorii Fas si TNFR a fost
demonstrata in melanoamele maligne.
Deoarece inhibitia caspazelor poate fi generala in transformarea neoplazica
si/sau progresia tumorilor este tentanta speculatia conform careia genele
caspazelor ca si gena p53 ar putea functiona ca supresori tumorali si prin
mutatii somatice sau pe linia germinala sa confere tumorilor rezistenta la
APPT.
Aplicatii clinice potentiale

Genele Bcl-2 si p53 sunt doua tinte potentiale ale terapiei moleculare in
cancer. S-au studiat metode de crestere a exprimarii genelor care induc APPT
(p53) si de blocare a efectelor genelor antiapoptotice (Bcl-2). Downreglarea
Bcl-2 prin nucleotide antisens a dus la cresterea susceptibilitatii celulelor la
efectele citotoxice ale 1-3-d-arabinofuranozilcitozinei (Ara C) - citarabina.

Acidul all-trans retinoic (ATRA) creste sensibilitatea blastilor din leucemiile

acute mieloide (AML) la efectele citotoxice ale Ara C si daunorubicinei. ATRA
face parte dintr-un grup de compusi cunoscuti sub numele de retinoizi care
au efect antiproliferativ si sunt capabili sa induca diferentierea in linia
celulara promielocitara HL-60.
O parte a acestui efect se datoreaza down reglarii bcl-2 si este de asemenea
responsabila pt cresterea chimiosensibilitatii dupa tratamentul cu ATRA.
Studiile indica prezenta bcl-2 in mitocondriile promielocitelor leucemice si
este absenta in mitocondriile celulelor care s-au diferentiat in urma
tratamentului cu ATRA.
Aceste rezultate sugereaza ca ATRA poate reduce exprimarea bcl-2 in celulele
blastice din AML in vivo si creste sensibilitatea celulelor la APPT indusa de
medicamentele citostatice.

 Inducerea mortii celulelor canceroase prin fosforilarea proteinei bcl-2 produsa

de medicamentele care afecteaza integritatea microtubulilor ofera
posibilitatea unei scheme terapeutice tintite.
Antigenul de suprafata al celulelor B, CD-20 este o tinta eficace pentru
imunoterapia bolilor maligne cu celule B deoarece legarea in vivo a
anticorpilor anti CD-20 in prezenta celulelor care exprima receptori Fc duce la
cresterea Ca si la APPT celulelor maligne.
O directie posibila in lupta impotriva cancerului se bazeaza pe inducerea
procesului apoptotic prin inlocuirea genelor afectate sau absente. Inducerea
p53 in celulele tumorale p53 negative inhiba proliferarea prin blocarea
ciclului celular in G1 si in viitor tratamentul cancerului hepatic ar putea fi
posibil prin injectarea locala a unui virus inofensiv cu rol de vector a genei
p53 intacte.