REACCIONES DE PARDEAMIENTO ENZIMATICO

I.

OBJETIVOS

Observar el pardeamiento enzimtico que ocurre en la manzana

MARCO TEORICO

PARDEAMIENTO ENZIMTICO
El pardeamiento enzimtico aparece fundamentalmente en los tejidos vegetales
cuando se daa por ejemplo por un corte, siendo el color parduzco que aparece al
estar al contacto con el aire un pardeamiento enzimtico. El tejido produce esta
coloracin como defensa contra el crecimiento de mohos, pero sin embargo
afectar al aspecto visual del alimento.
Este fenmeno se debe a la accin de unas enzimas, las FENOLASAS. Como
sustrato de estas enzimas estn los compuestos fenlicos por lo que afectan a los
pigmentos con estructura fenlica. La accin de las fenolasas se divide en dos
actividades.
Actividad cresolasa, que provoca la oxidacin de los fenoles dando orto-difenoles.
Actividad catenolasa, que forma ortoquinonas que reaccionan entre ellas
produciendo compuestos que dan color parduzco.
El enzima responsable del pardeamiento enzimtico recibe el nombre de
polifenoloxidasa, fenolasa o tirosinasa, en este ltimo caso especialmente cuando
se hace referencia a animales, ya que en ellos la tirosina es el principal substrato.
Tambin se ha utilizado el trmino cresolasa, aplicado a la enzima de vegetales.
Se descubri primero en los championes, en los que el efecto de pardeamiento
tras un dao mecnico, como el corte, es muy evidente.

En el campo de los alimentos, el pardeamiento enzimtico puede ser un problema

muy serio en frutas, patatas y otros vegetales, e incluso en la industria del vino, al
producir alteraciones en el color que reducen el valor comercial de los productos, o
incluso los hacen inaceptables para el consumidor. Estas prdidas son muy
importantes en el caso de las frutas tropicales, productos trascendentales para la
economa de muchos pases poco desarrollados.
A pesar del nombre genrico de pardeamiento (browning en ingls), los colores
formados son muy variables, marrones, rojizos o negros, dependiendo del
alimento y de las condiciones del proceso. En algn caso, como en las pasas,
otras frutas secas, la sidra, el t o el cacao, el pardeamiento enzimtico contribuye
al desarrollo de los colores caractersticos de estos productos, aunque como se ha
indicado, en otros muchos constituye un problema grave. Adems de la alteracin
del color, los productos formados pueden reaccionar con las protenas,
insolubilizndolas. Por otra parte, puede producirse tambin una prdida
nutricional, ya que aunque la polifenoloxidasa no oxida directamente al cido
ascrbico, esta vitamina puede destruirse al reaccionar con intermedios de la
reaccin.
La reaccin de pardeamiento enzimtico
El pardeamiento enzimtico es un conjunto complejo de reacciones, que se inicia
por la o las reacciones catalizadas de forma enzimtica. La primera de ellas,
cuando el sutrato presente es un monofenol, es su transformacin en difenol. La
segunda, la transformacin del difenol en quinona. En el caso de la tirosina
(monofenol) se forma primeramente la dopa (difenol) y luego la dopaquinona
(quinona).
A partir de la formacin de la quinona, la reaccin progresa de forma espontnea.
Las quinonas se pueden convertir en trifenoles por reaccin con el agua, y
posteriormente oxidarse a hidroxiquinonas. Todas estas sustancias son muy
reactivas, dando lugar a polmeros y reaccionando con otras sustancias presentes

en el alimento, especialmente protenas. Los productos finales, llamados

melaninas, son de color muy oscuro, o negro, e insolubles en agua. Estos
polmeros tienen propiedades antimicrobianas, y podran ser un mecanismo de
defensa de los vegetales contra infecciones.
Substratos
Los sustratos de la reaccin pueden ser monofenoles o difenoles. En los
vegetales, el sustrato ms extendido es probablemente el cido clorognico, en el
que el grupo fenlico se encuentra unido a un resto de azcar, que se encuentra,
entre otros, en manzanas, peras, melocotones, ciruelas, uvas, aguacates y
patatas. En algunos vegetales se encuentran adems DOPA, dopamina, p-cresol,
cido cafeico y otros fenoles.
Las polifenoloxidasas son tambin en muchos casos capaces de oxidar aminas
aromticas para formar o-aminofenoles.
Control de la reaccin de pardeamiento
El

control

natural

de

la

actividad

de

la

polifenoloxidasa

se

produce

fundamentalmente mediante la compartimentalizacin de los sustratos. El enzima

se encuentra en los plstidos y cloroplastos (en los vegetales superiores), y
tambin en el citoplasma celular, mientras que los compuestos fenlicos que
pueden servir de sustratos se acumulan en vesculas. Cuando se rompe la
compartimentalizacin por un dao mecnico, como el triturado, corte o
congelacin y descongelacin, la reaccin de pardeamiento se puede producir.
Tambin se produce la inhibicin del enzima por los productos de la reaccin.
Adems de manteniendo la compartimentalizacin, la reaccin de pardeamiento
se puede frenar actuando sobre diferentes factores:

Evitando el contacto del oxgeno con la superficie de corte

Bajando al temperatura

Reduciendo el pH

Desnaturalizando el enzima

Generalmente estos factores actan de forma combinada. As, el descenso de pH

puede actuar inicialmente reduciendo la actividad del enzima, (su pH ptimo est
entre 5 y 7), pero tambin, si es suficientemente bajo, desnaturalizndola de forma
irreversible.
Los reductores pueden actuar de varias formas, entre ellas revertiendo la reaccin
de quinonas a fenoles. Tambin pueden actuar directamente sobre el centro activo
del enzima, transformando el cobre 2 en cobre 1, que se disocia ms fcilmente.
El sulfito y la cistena, adems de reaccionar con las quinonas reducindolas a
difenoles, inactivan el enzima. Los sulfitos presentan el problema de su toxicidad
diferenciada para algunas personas, un pequeo porcentaje de los asmticos, que
pueden sufrir crisis severas con cantidades incluso inferiores a los lmites legales.
Consecuentemente, existe una tendencia a reducir la utilizacin de sulfitos,
aunque no siempre es posible.
Un inhibidor muy eficiente la actividad de la polifenoloxidasa de los crustceos es
el cido brico, aunque actualmente est prohibido su uso, dados los riesgos de
toxicidad.
Para que se produzca este pardeamiento es necesario, por lo tanto, la presencia
de los tres componentes: enzima, substrato ms el oxgeno. Como nada se puede
hacer o muy poco con el substrato oxidable, los mtodos hoy en uso tienden a
inhibir la enzima o a eliminar el oxgeno y algunas veces se combinan ambos
mtodos.

a) Inactivacin de la enzima mediante calor. Tiene la ventaja de que no se

aplica aditivo alguno, pero presenta el inconveniente de que la aplicacin de calor
en frutas frescas produce cambios en la textura, dando sabor y aspecto a cocido.
Para evitar estos inconvenientes se regula el tiempo de calentamiento,
acortndolo justo al mnimo capaz de inactivar la enzima por un escaldado
inmediato. Se puede controlar la inhibicin enzimtica por la prueba del catecol. La
inhibicin es lenta a 75, pero se hace rpida a 85C.
b) Inactivacin de la enzima mediante inhibidores qumicos:
Anhdrido sulfuroso: Es uno de los ms efectivos y econmicos inhibidores
qumicos hoy usados en la industria alimentara, aunque su olor y sabor
desagradables pueden comunicarse al alimento cuando se emplea en grandes
cantidades. Su uso no es aconsejable en alimentos ricos en tiamina y vitamina C,
pues las destruye. En el caso de la tiamina, el SO 2 es capaz de romper el anillo
tiazlico de la vitamina, separando el anillo de pirimidina, con lo que pierde su
carcter vitamnico.
La polifenoloxidasa es muy sensible al SO 2, pero la reaccin debe realizarse antes
que se formen las quinonas por oxidacin del substrato, pues stas oxidan al SO 2,
por lo que pierde entonces su propiedad de inhibir la enzima.
Acidos: Bajo un pH 2,5 cesa la actividad enzimtica, que es ptima entre 5 y 7.
Aunque luego se vuelva al pH original de la fruta, la enzima no se recupera,
impidindose as el pardeamiento. Entre los cidos ms usados est el mlico,
que se agrega al prensar la fruta: caso de la manzana, de la cual es uno de sus
componentes naturales; tambin se usa, pero en menor proporcin, el cido
ctrico.
Acido ascrbico: Este cido es el ms recomendado para evitar o minimizar el
pardeamiento enzimtico, por su carcter vitamnico inofensivo. El cido ascrbico
por s mismo no es un inhibidor de la enzima: acta sobre el substrato, de modo

que puede adicionarse despus de haberse formado las quinonas; Tiene la

propiedad de oxidarse a cido dehi-hidroascrbico, reduciendo la quinona a fenol.
Esto lo hace el cido ascrbico hasta que se haya transformado totalmente en
dehidroascrbico que ya no puede reducir las quinonas, de manera que stas
continan, entonces, su oxidacin hasta la formacin de melanoides. El cido
dehidroascrbico an puede ser perjudicial al formar, en la esterilizacin posterior,
melanoides con los aminocidos presentes; por eso la adicin de cido
ascrbico no es eficaz en cerezas, ciruelas y frutillas. Sin embargo, si se agrega a
otras frutas exceso de cido ascrbico para inactivas totalmente la enzima, se
logra prevenir el pardeamiento en forma efectiva y permanente.
Productos especialmente propensos a empardecer por oxidacin qumica, cmo
manzanas, peras, duraznos, damascos, ciruelas y pltanos entre las frutas, y
papas,

esprragos,

zanahorias

entre

las

hortalizas,

deben

mantenerse,

inmediatamente despus de cortadas o peladas, en agua adicionada de 0,1-0,2 %

de cido ascrbico y de 0,2% de cido ctrico.
Adems, para evitar alteraciones de color por oxidacin qumica en las conservas
enlatadas, es conveniente agregar por cada litro de lquido de relleno 0,5-1 g de
cido ascrbico (y 0,25-0,50 g de cido ctrico, segn lo admita el producto en
cuanto al sabor). Para mantener el color de conservas de championes y otros
hongos es conveniente una adicin de 0,15-0,20 g por litro y para el choucroute se
agrega a la salmuera 1-2 g/kg de cido ascrbico, poco antes del envase.
Otros inhibidores qumicos: Entre las sales propuestas para controlar el
pardeamiento la ms usada es NaCl, cuya accin impide la actividad de la
polifenol-oxidasa frente al cido clorognico. Una sumersin en solucin acuosa
diluida de NaCl (0,3%) se usa mucho cuando se quiere evitar por corto tiempo el
obscurecimiento de frutas peladas, como rodajas de manzanas, antes de ser
sometidas al procesamiento; Su contenido en cido ascrbico s mantiene,
entonces, constante durante varias horas.

Se aplica el bloqueo de los hidrxilos fenlicos por adicin de complejantes con el

cobre

de

la

enzima,

como

el

cido

ctrico

(0,2%)

boratos

(0,2% + 0,01% SO2). Tambin la cistena y otros dadores de SH se unen a los

fenoles, dando complejos incoloros, previa reduccin de las quinonas.
El uso de jugos de pia o de limn para evitar el pardeamiento en preparaciones
caseras, se basa en el contenido de compuestos sulfhidrlicos del primero y en
cidos ctrico y ascrbico del segundo.
c) Eliminacin del oxgeno: La exclusin o limitacin de la influencia del O 2 del
aire al trabajar y envasar rpidamente el material y en caso necesario con ayuda
del vacio o en atmsfera inerte representan medidas satisfactorias para mantener
ciertas frutas al estado lo ms natural posible, especialmente en lo que se refiere a
textura y sabor. Para frutas destinadas a la congelacin, se usa tambin azcar y
jarabe para cubrir la superficie, retardando as la entrada del oxigeno atmosfrico.
Los agentes quelantes, capaces de eliminar los tomos de cobre del centro activo
del enzima, y consecuentemente inactivarla, son inhibidores muy eficientes.
Pueden utilizarse el EDTA, pirofosfato, y especialmente el cido ctrico, que
combina el efecto de la acidez con la capacidad secuestrante de metales.
Algunas otras sustancias, como el cido benzoico y otros compuestos aromticos,
actan reduciendo la actividad del enzima al competir con los sustratos. Y, por
supuesto, la desnaturalizacin trmica, por ejemplo mediante escaldado con
vapor, es un sistema muy eficaz, cuando puede utilizarse.

II.

PARTE EXPERIMENTAL

Tratamiento de los tejidos de manzana y su efecto en reaccin de

pardeamiento
1) Utilizar cuarta parte de una manzana y cortarla en dos trozos. Desmenuza
uno de los trozos y ponerlo en un vidrio de reloj junto al trozo entero.
Comparar el pardeamiento que se produce en las dos muestras.

2) Cuando el trozo entero est marrn, dividirlo en tres partes mediante rotura
y por corte. Observar el color del interior del trozo de manzana y hallar cual
pardea ms rpidamente, s la superficie rota o cortada.

3) Utilizando zumo de manzana: Poner 10mL en un tubo de ensayo y otros

10mL en una placa petri.
En cul de las dos muestras se encontrar mayor grado de pardeamiento?
La alteracin de la estructura celular de la manzana no alcanza ms all del
substrato, la reaccin de los compuestos fenlicos se activa por contacto con
oxigeno atmosfrico.
El efecto del calor en la reaccin
Obtener zumo de manzana de la manera que se ha descrito. Poner
aproximadamente 10mL de zumo en cada uno de los tubos de ensayo A, B, C y D.
Tubo A.- Calentarlo a la llama del mechero y dejar que su contenido hierva durante
un minuto.
Tubo B.- Ponerlo en un bao de agua a 50C.
Tubo C.- Ponerlo en un bao de agua a 100C.
Tubo D.- Mantenerlo a la temperatura de la habitacin.

Dar las razones por las que afirma que pardeamiento del zumo de manzana es
una reaccin enzimtico.
Poner a hervir un trozo de manzana durante un minuto, dejndolo despus
expuesto al aire.

Cul es la diferencia si se compara con una muestra que no ha sufrido la accin

del calor?
El efecto del pH
Utilizando trozos de manzana. Poner 5 trozos de manzana sobre vidrio de reloj y
empaparlos de una de las siguientes disoluciones:
A

cido ctrico al 1%

cido ctrico al 0.5%

zumo de limn

agua

solucin de carbonato de cido de sodio al 1%

Dejarlos varias horas y comparar el pardeamiento que haya tenido lugar.

(El grado de reaccion alcanza su maximo con valores de pH entre 6 y 8. Con pH
menor que 3 se inhibe casi completamente la reaccin)
El efecto de cido ascrbico
El cido ascrbico es antioxidante natural, razn por lo cual inhibe el
pardeamiento, pero llega un momento en que el mismo llega a oxidarse y de esta
manera se inutiliza su accin. Por esto, si se aade cido ascrbico hay un retraso
en la aparicin del pardeamiento. El retraso es an mayor, consiguiendo una
concentracin alta de cido ascrbico en la tecnologa de alimentos.
Poner 5 trozos de manzana sobre vidrios de reloj y tratar cada uno, con una de las
cinco soluciones siguientes:
A

cido ascrbico al 5%

cido ascrbico al 2.5%

cido ascrbico al 1%

agua

cido clorhdrico 2M

Anotar el tiempo en que cualquier trozo llega a ponerse marrn que el trozo E.

Este acta como testigo cuyo pardeamiento es imposible por la adicin de cido
clorhdrico 2M.
Por qu no se puede utilizar el cido clorhdrico 2M para inhibir el pardeamiento
de las frutas?
i.

RESULTADOS Y OBSERVACIONES
Tratamiento de los tejidos de manzana y su efecto en reaccin de
pardeamiento
En cul de las dos muestras se encontrar mayor grado de pardeamiento?
Al romper parte de la manzana y cortar la otra parte con un cuchillo, se pudo
observar que la primera de estas comenz a cambiar a un color marrn mas
rpido q la segunda.
El efecto del calor en la reaccin

Cul es la diferencia si se compara con una muestra que no ha sufrido la accin

del calor?
A medida que vamos incrementando la temperatura el pardeamiento es mas lento
con respecto a un trozo de manzana dejado a temperatura ambiente.

El efecto de cido ascrbico

A medida que incrementamos la concentracin de cido ascrbico el

pardeamiento disminuye con respecto al tiempo.

Por qu no se puede utilizar el cido clorhdrico 2M para inhibir el pardeamiento

de las frutas?
Porque el cido clorhdrico degrada la materia orgnica y tambin es perjudicial
para el consumo humano.
ii.

CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES

El pardeamiento enzimtico se puede evitar impidiendo el contacto con el

oxgeno. Esto se hace sumergiendo en el agua y escaldando los productos
para inactivar las fenolasas. La adicin de cidos (ctricos o mlicos por
ejemplo) har que la encima no se encuentre en su pH ptimo de actuacin.

Se pueden usar agentes secuestrantes ya que la enzimas tiene cobre en su

estructura por lo que s lo queremos evitamos la accin de la fenolasa
aunque esta medida no la podemos utilizar en muchos casos.

El cido ascrbico acta de varias formas; por un lado gasta el oxgeno

porque se oxida la vitamina C al ser reductor, eliminando el oxgeno del
medio. Por otro lado reacciona con las ortoquinonas y desplaza la reaccin
hacia la formacin de orto-difenoles.

Procurar que las muestras de manzana no se oxiden rpidamente antes de

haber efectuado la experiencia ya que si esto sucede no podremos observar
los resultados.

BIBLIOGRAFA

Dona B. Ott. Manual de laboratorio d los Alimentos.

http://milksci.unizar.es/bioquimica/temas/enzimas/tirosinasa.html

www.arrakis.es/~lluengo/pproteinas.html