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NORMAS E ROTINAS OPERACIONAIS DO

LABORATORIO DE ÁNALISES CLÍNICAS


Setor de Coleta e Recepção
Procedimento Operacionais Padrões (POP)

1. CADASTRO E INFORMAÇÕES
1.1 Identificar o paciente

A chegar à recepção do laboratório, o paciente devera estar portanto requisição


medica com os exames solicitados pelo seu medico, a recepcionista então irá
cadastra-lo, dando ênfase ao nome, idade, sexo, endereço e/ou telefone. O cadastro
do paciente acompanha a identificação numérico controle do laboratório.

1.2 Identificação de amostra


Cada cadastrado possui um numero de identificação, utilizando para etiquetas
os recipientes de coleta.
É importante identificar sempre a parte lateral do frasco, e nunca a tampa,
principalmente em frascos de urina e fezes para evitar trocas de material.

1.3 Identificações dos exames a serem realizados


No laboratório as amostras são registradas em fichas internas de seus
respectivos setores, nestas fichas constam a identificação numérica, o nome e a
idade do paciente; em seguida as amostras e as fichas serão encaminhadas para os
devidos setores.

1.4 Informações ao paciente


Na recepção do laboratório o paciente irá receber as instruções de como deve
proceder para coleta das amostras. Para dosagem bioquímica é o paciente é orientado
sobre o período de jejum, sendo também necessário o conhecimento dos
medicamentos que o paciente possivelmente esteja tomando.
Quando a coleta de sangue, orienta-se o paciente quanto ao esforço fisico, o
paciente deve vir ao laboratório totalmente descansado para evitar qualquer alterações
nos resultados de seus exames.
2 COLETA DE SANGUE
O sangue colhido com o objetivo de estudar as freqüências alterações dos seus
componentes quando o organismo é acometido pôr doenças. No laboratório são
executados exames de vários paciente ao mesmo tempo, torna-se imprescindível que
uma sistematização bem organizada de trabalho seja seguida, evitando-se os erros de
um modo geral, a perda de tempo e, especialmente, a troca dos resultados.
Cuidados técnicos e de assepsia são também necessários a fim de evitar a
contaminação do paciente, do operador e do sangue colhido. A coleta é feita de
preferencia pela manha, com o paciente em jejum.
Muitos são os meios para obtenção do sangue usado para o exame
hematológico, como pôr exemplo, sangue o veneno, capilar, arterial, punção da medula
óssea de ossos como o externo, tíbia, ilíaco e usado na maioria das vezes o venoso e o
capilar.

2.1 Sangue Venoso

A sua obtenção é feita pela função das veias mais acessíveis. As que são mais
facilmente funcionadas localizam-se nas regiões do antebraço (veia mediana, cefálica e
basílica), do pescoço (jugulares internas e externas) e inguinais (femural). Na criança,
também se realiza na região da fontanela frontal (seio longitudinal). A veia é a preferida
nos exames rotineiros, pois apresenta freqüentemente bom calibre e sua função é
pouco dolorosa. Antes da punção, avalia-se a orientação do vaso pela visualização ou
pela palpação digital e fazer a agulha penetrar e aprofundar nessa direção.

2.2 Sangue capilar

É freqüente usado em crianças quando se empregam micrometodos ou em adultos


para alguns exames como estudos de plaquetas, citologia e citoquimica celular. A
coleta se faz após punção da polpa digital dos dedos ou dos grandes artelho, na
criança. Pode-se ainda utilizar a regiões laterais do calcanhar, nos recem nascidos.
3. RECEPÇÃO AO PACIENTE

O paciente é recebido com cortesia e cordialidade; explicando os procedimentos aos


quais ele vai ser submetido, de modo a transmitir-lhe tranqüilidade e segurança.
A coleta chama o paciente para a coleta de sangue, e de acordo com seu cadastro,
confirma o nome, a idade e os exames a sem realizados pelo paciente. A mesma
separa e identifica, na frente do paciente os tubos que serão utilizados para o material.

3.1 Condições para a coleta


•Sala bem iluminada e ventilada;
•Pia;
•Cadeira reta com bracadeira regulável ou maca;
•Garrote;
•Algodão hidrófilo;
•Álcool etílico a 70% ou álcool iodado a 1%;
•Agulhas e lancetas descartáveis;
•Sistemas a vácuo: suporte, tubo e agulhas descartáveis;
•Tubo de ensaio com tampa;
•Etiquetas para identificação de amostras;
•Caneta;
•Caixa descarpack;
•Jaleco e mascara;
•Luvas descartáveis;
•Estantes para tubos.

3.2 Identificação da amostra


Identificam-se os tubos para colocação da amostra. Escreva na etiqueta os dados do
paciente: nome, numero do registro, data da coleta.

3.3 Tecnica para Coleta de Amostra do Sangue Venoso


•Coloca-se a agulha na seringa sem retirar a capa protetora. Não tocando na
parte inferior da agulha;
•Movimenta o embolo e pressione-o para retirar o ar;
•Ajusta o garrote e escolha a veia;
•Faz a anti-sepsia do local da coleta com algodão umedecido em álcool a 70%
ou álcool iodatdo a 1%. Não tocando mais o local desinfetado;
•Retira a capa da agulha e faz a punção;
• Introduz a agulha na veia mediana, basilica ou cefálica, atingida a veia, aspira o
sangue;
• Coleta-se aproximadamente 10 ml de sangue. Em crianças coleta 2 A 5 ML;
• Retira o garote e em seguida a agulha;
• Comprime o local puncionado com algodão embebido em álcool;
• Retira a agulha da seringa e transfere o sangue para os tubos, quando for
transferido para um tubo contendo anticoagulante. Agita suavemente para facilitar a
mistura do sangue como anticoagulante;
• Ao transferir o sangue para um tubo de ensaio sem anticoagulante. Escorrer
delicadamente o sangue pela parede do tubo. Este procedimento evita a hemolise da
amostra. Descarta as agulhas e seringas nas caixas de descarpack;
• Orienta o paciente a pressionar com algodão a parte puncionada, mantendo o
braço estendido, sem dobrá-lo;

3.4Tecnica para coleta de amostra do sangue capilar


Faz assepsia da poupa digital com álcool iodado.
• Deixar secar.
• Puncionar com lanceta ou agulha descartavel, desprezando-se a primeira gota
de sangue e absorvendo-a com papel de filtro ou algodão seco;
• Sangue deve fluir espontaneamente, exercendo-se leve pressão somente
quando necessário;
• Direciona o tubo de capilar na gota para que o sangue flua pós capilaridade;
• Limpar o dedo com algodão e aplicar anti-séptico.
Anticoagulantes.
• O sangue é coletado com a proporção correta de Anticoagulantes utilizados.
• EDTA; 1 a 2 mg para cada ml de sangue.
• Heparina; 1 gota (5.000 U/ml) para cada ml de sangue.
• Oxalato de K; 1 a 2 mg para cada ml de sangue.
• Citrato de sódio; 0,5 ml para 4,5 ml de sangue.

3.6 Biossegurança na coleta


Todo cuidado é pouco na manipulação de materiais biológicos, tais como soro,
sangue, secreções, fluidos orgânicos, tecidos, etc. Redobra-se as precauções, pois
esses materiais são potencialmente infectantes e muitas vezes estão contaminados
com agentes estiologicos diferentes do que se esta pesquisando, ou ainda
desconhecidos.
Usa-se sempre Equipamento de Proteção Individual (EPI): jaleco longo de
mangas compridas e punho retratil, luvas descartáveis evita a formação e dispersões
de aerossóis são micro partículas solidas e liquidas com dimensões aproximadas entre
0,1 e 0,5 micra que podem, no caso de conter microorganismos, permanecer em
suspensão e plenamente viáveis pôr varias horas.
Jamais reencapa-se agulhas. Esse procedimento é uma das principais causas
da contaminação de profissionais de saúde por microorganismos, existentes no sangue
e em outros fluidos orgânicos, como por exemplo, o vírus da Hepatite B e o HIV. Após a
coleta é descartado esse material diretamente em caixas descarpack.
Reduz ao máximo o manuseio de resíduos, em especial os pefurocortantes.
Descarta o rejeito perfurocortante diretamente em caixas descarpack.

4. EMISSAO DOS LAUDOS DOS EXAMES LABORATORIAIS


Os laudos estão disponíveis no prazo acertado com o paciente, se por algum
motivo isto não for possível, há uma justificativa e, sempre que possível, o paciente é
informado no mais curto prazo possível.
Em caso de laudo que possa oferecer perigo iminente à vida do paciente, o
laboratório informa ao médico assistente e/ou ao responsável pelo paciente.
O laudo é datado e assinado por profissional legalmente habilitado com o seu
nome completo e legível, e o número do registro no conselho profissional.

4.1 Exames
•Nome do exame;
•Material utilizado;
•Método;
•Intervalo de referencia com as respectivas unidades e valores de alerta;
•Informações necessárias à interpretação dos resultados, quando indicada;
•Conclusões, quando indicadas.

EXAMES DE SANGUE

Acido urico
Capac. Total de lig. do ferro
Albumina
Cetonemia
Colesterol fracionado:
• HDL
• LDL
• VLDL
Aldolase
Cloretos
Ferro – colher pela amanhã
Amilase
Creatinina
Triglicérides
Bilirrubinas
Eletroforese de proteínas
Uréia
Cálcio
Fosfatase acida
Colesterol ( sem fracionamento)
Fosfatase alcalina
CPK total
Fósforo
CK – MB
Frutosamina
Gama GT
Glicose
Hemoglobina glicosilada
Lipase
Potássio
Magnésio
Sódio
Mucoproteinas
Transaminases: TGO/AST; TGP/ALT
Velocidade de hemossedimentação (VHS)
Hemograma
Curva de fragilidade osmotica
Plaquetas
Tempo de protrombina
Tempo de tromboplastina parcial ativada – PTTa
Reticulocitos
Eletroforese de hemoglobina
Pesquisa de drepanócitos
Alfa 1 Glicoproteína acida
Fator reumatoide
Grupo sangüíneo e fator Rh
VDRL
Proteínas C reativa
Anti HBs
Anticorpos antireoidianos:
- antireoglobulina
- antimicrossomal
Antiestreptolisina O
• - Monoteste
• - Paul Bunnell Davidsohn
• - Epstein Baar (IFI ou ELISA)
• - Anti VCA – IgG e/ou IgM
Fan
HbeAg
Toxoplasmose IgG/IgM - ELISA - IFI – HAI
HbsAg (Antigeno australia)
Chagas (T. Cruzii): - IFI – HAI – ELISA
HAV IgG/ IgM
Anti Hbe
Citomegalovírus IgG/IgM
HIV 1 e 2

EXAMES DE URINA ROTINA


1) Entrega ao paciente um frasco etiquetado com o número de registro do mesmo.
2) Da as seguintes instruções ao paciente:
2.1 - Colher a primeira urina da manhã
2.2 - Antes de colher a urian, fazer um asseio com água e sabão na genitália
externa.
2.3 – Desprezar as primeiras porções da urina e colher o restante no frasco coletor
recebido do Laborátorio.
2.4 - Trazer imediatamente para o Laboratorio dentro do laboratório dentro do
horário previsto para recebimento de material ( 7:30 às 10:00 hs, manhã ).
Obs: Paciente Os sexo feminino não devem colher urina no período menstrual.
3) - Paciente feminino não deve coletar a urina no dia em que fizer Exame de
Conteúdo vaginal, pois a paciente deverá estar sem asseio e para a coleta de urina
terá que assia-se antes.

EXAMES PARASITOLÓGICO FEZES


1) Entrega ao paciente um frasco etiquetado com o numero de registro do
mesmo.
2) Colher o material e trazer para o Laboratorio no horário estipulado
( 7:30 às 10:00 hs).
3) Se houver dificuldade de colher o material pela manha no dia do exame
marcado, pode colher na véspera e colocar na geladeira o frasco coletor.

EXAMES DE SECREÇÃO VAGINAL E SECREÇÃO URETRAL


1) Se a paciente também tiver que realizar exame de URINA, o exame de
Secreção devera ser realizado no outro dia.
2) Para fazer exame de Secreção Vaginal a paciente deve vir ao
Laboratorio sem tomar banho ou sem realizar qualquer tipo de asseio.
3) Não manter relação sexual 24 hs antes da realização do exame,
abstinência sexual de 24 hs.

5. ENTREGA DE RESULTADO
1) Os exames de paciente particulares e SUS ficam no arquivo colocados
em ordem alfabética.
2) Os exames de paciente atendidos pelo hospital são entregues ao mesmo
colocados no prontuário.
3) Observa-se o nome completo, idade do paciente.
4) Confere se o nome do paciente no exame com o nome que está na
requisição.
5) Retira-se o resultado e entrega ao paciente

6. EXAMES INCOMPLETOS
1) O exame só será liberado quando o paciente trouxer o restante do material para
complementar os tipos de exames que constam da requisição médica.
2) Solicitamos ao paciente que traga no máximo ate 48 hs. Após as analises
efetuadas, o exame é liberado normalmente.
Setor de Lavagem e Esterilização
PROCEDIMENTO OPERACIONAIS PADRÔES (POP)
A importancia de uma boa descontaminação de materiais (ESTERILIZAÇÃO) é peça
imprescindível para um melhor desempenho dos trabalhos a serem executados em um
laboratório de analises clinicas. O processo de esterilização o começo de tudo, sem a
mesma os resultados não serão satisfatorios. Faremos uma descrição dos métodos que
são utilizados para a esetrilização dos materiais do laboratorio.
1 OBJETIVOS
1.1 Gerais
Tomar conhecimento dos cuidados na manipulação de materiais contaminados.
Devemos tambem ter o conhecimeto de lavagem, secagem empacotamento e
esterilização de materiais reaproveitaveis.
1.2 Especificos
Uns dos objetivos mais importantes, é o conhecimento de como se deve usar as
maquinas, como: AUTOCLAVE, ESTUFA DE SECAGEM E ESTERILIZAÇÃO E
TAMBÉM O DEIONIZADOR.

2. EQUIPAMENTO B´SICOS
•Autoclave
•Estufa de secagem
•Estufa de esterilização
•Deionizador
OBS: Há de se destacar também os materiais usados no processo de lavagem. São
estes:
• Sabao
• Hipoclorito 1%

3 METODO PARA ESTERILIZAR MATERIAIS:


1. O 1º passo é colocar o material contaminado (coágulos e urina) são colocados
em frascos plásticos contendo hipoclorito a 1%, pôr duas horas vida média do
hipoclorito.
2. 2º passo os materiais reutilizáveis ex: vidrarias são colocados no hipoclorito a
1% pôr 30 minutos,
3. 3º passo sabão dextran pôr mais 30 minutos,
4. 4º passo lava-se em água corrente pôr 30 minutos,
5. 5º passo mais 30 minutos de molho em água deionizada,
6. 6º passo são colocados na estufa de secagem.

 Matérias da microbiologia
1. Os materiais contaminados são colocados na autoclave pôr 45 minutos à 121ºC
2. Depois que sair do autoclave, devemos seguir os mesmos passos a partir do 3º
descrito acima;
3. Após a secagem, leva o material para o balcão de empacotamento e lá,
definitivamente separado. Ex: plástico, vidro, etc.
4. Depois de separado, o material é colocado na estufa de auto precisão para
esterilização com fita teste. Deve-se salientar que materiais plásticos não devem ir para
a estufa de esterilização, pois a mesma os danificará, devido sua alta temperatura que
gira em torno de 180ºC. O temo que o material deve ficar na estufa de esterilização é
de 2 hs. E com relação ao material plástico este e embalado e colocado na autoclave
de 15 a 20 minutos.

OBS: Para identificarmos um material autoclavado devemos verificar a fita


teste, esta deve estar com listras queimadas. Com todos esses passos, nós faremos
uma boa esterilização, pois a mesma os danificará, devido sua alta temperatura que
girar em torno de 180ºC. O tempo que o material deve ficar na estufa de esterilização é
de 2 hs. E com relação ao material plástico este e embalado e colocado na autoclave
de 15 a 20 minutos.
É importante compreender a importancia da esterilização em todo o processo
de trabalho em Laboratorio, bem como o uso de equipamentos essenciais
(AUTOCLAVE, ESTUFA DE ESTERILIZAÇÃO E SECAGEM E DEIONIZADOR), e
procedimentos de lavagem e descontaminação de materiais.
4. DESCARTE DE MATERIAL CONTAMINADO
Deve haver POP para o descarte de material contaminado gerado no laboratorio, que
são aqueles despejos em estado sólido, semi-solido, liquido ou pastoso, apresentando
características de toxidade e/ou atividade biologica, que podem afetar direta ou
indiretamente os seres vivos ou causar contaminação das aguas, do ar e do solo.
Procedimento para com os materiais.
• Agulhas (e capilares de hematócrito): Uma vez terminada a coleta do
sangue-amostra são desprezadas em caixas descarpack
• Seringas: Após o termino da coleta do material, tambem são descartaveis em
caixas escarpack.
• Algodao, gaze, papeis e material afins: Apos o uso devem ser descartados
em sacos de lixo branco e reforçados para posterior coleta pôr serviço especializados.
• Swabs, especulos, espatulas, abaixadores de lingua, etc.: Proceder da
forma descrita acima.
• Urina: Acrescentar uma parte de solução de hipoclotito de sodio a 1%. Deixa
em contatoo pôr 2 horas descarta no esgoto sanitario. Os frascos devem ser
descaratados em sacos de lixo brancos reforçados para posterior coleta pôr serviços
especializados.
• Fezes: descarta em saco de lixo reforçados.
• Sangue, coagulos e semelhantes: colocar todo o sangue e seus derivados
em um recipiente de plastico resistente. Adicionar solução de hipoclorito de sódio.
Deixar em contato pôr 2 horas. Devido à decomposição do hipoclorito em contato com o
sangue, deve-se adicionar mais hipoclorito, até não haver qualquer formação de
espuma.
• Meios de cultura e despejos e bactriologicos: Dispensa o material o, a
esterilização em autoclave e descartar em lixo especial.
• Lâminas e lamínulas: Não são descartas. Ao recuperá-las são submetidas a
um tratamento hipoclorito de sódio a 1% pôr 30 minutos. Apos o processo, proceder a
lavagem e recuperação.

PROCEDIMENTO DE ROTINA
HEMATOLOGIA MANUAL
HEMATOLOGIA
A hematologia compreende o estudo das celulas sanguineas e coagulação.
Normalmente, os constituintes do sangue (hemacias, leucócitos e plaquetas)
permanecem em equilibrio sempre constante devido ao sistema hematopoiético, com
função de formação hemolítica ou de destruição das células sanguineas. (O. LIMA,
1992)
OBJETIVOS
O estudo no Laboratório de hematologia consiste em analisar células
sanguineas e a coagulação atraves de exames hematológicos, podendo assim
qualificar e diferenciar as células sanguineas.
Esses testes realizados possibiltam um diagnostico mais conclusivo, auxiliando
clínico no tratamento de uma patologia pr deficiencia hematologica.

HEMATÓCRITO
Consiste em determinar em porcentagem a concentração de eritrócitos em
dados volume de sangue não coagula. È a razão entr o voluem deeritrócitos em relação
ao volume do sangue total. (O. LIMA, 1992)

• MATERIAIS E MÉTODOS
- Tubo capilar
- Bico de bunsen
- Centrífuga para microhematócrito
- Tabela para microhematócrito
• O tubo de microhematócrito é preenchido por capilaridade até ¾ da capacidade do
capilar. A extremidade vaziaé vedada pela chama do bico de bunsen. Colocar os
capilares na centrifuga para microhemat´crito, com o cuidado de coloca a parte aberta
contra o apoio de borracha para evitar quebras e extravasamentos. A ponta selada fica
voltada para fora. É recomendável um centrifugação a 3.000 RPM/5 minutos.
Após a centrifugação, o tubo apresenta uma coluna de sangue, incluindo o
plasma e uma coluna de eritrócitos. Devem ser medidos com o auxílio da tabela.

HEMOGLOBINA (Hb)
É o principal componente dos eritrócitos. É um conjugado de proteínas que
serve como transporte de O2 e CO2. (O. LIMA, 1992)

• MATERIAIS E MÉTODOS
- Tubos para centrífuga
- Padrão (HiCN – Cianetohemoglobina)
- Reagente de Drabkin
• Tomar 3 tubos e proceder da seguinte maneira:
B P A
Padrão - 20uL -
Amostra - - 20 uL
Reag. de Drabkin 5.0uL 5.0uL 5.0uL

Hogenizar. Descansar em temperatura ambiente por 5 minutos. Leitura a 540


nm no espectrfotômetro. Zerar com o Branco.

ESFREGAÇO
O exame de esfregaço sangüíneo é uma parte importante da avaliação
hematológica. Para obter esfregaços satisfatório, é indispensável que se tome certas
precauções:
- lâminas devem estar limpas e desengorduradas;
- a gota de sangue não deve ser muito grande. Quanto maior a gota, mais espesso o
esfregaço. O ideal é uma gota de 20uL;
- O esfregaço deve ser feito rapidamente, antes que ocorre a coagulação. (O. LIMA,
1992)
• MATERIAIS E MÉTODOS
- Lâminas limpas e desengorduradas
- Lâminas de extensão (extensora)
• Colocar uma gota de sangue no final de uma lâmina apoiada em uma superfície
plana. Com o polegar e o indicador, segura-se o final da lâmina de extensão contra a
superfície da primeira lâminas. Empurra-se a lâmina de extensão a uma velocidade
moderada para frente até que o sangue tenha sido espelhado em um esfregaço
moderadamente delgado. As lâminas devem ser secas a temperatura ambiente e
depois corada para análise ao microscópio.
È conveniente confeccionar vários esfregaços ao mesmo tempo. Marcar
sempre os esfregaços usando agulha ou lápis dermográfico com o nome do paciente e
a data sobre a superfície do mesmo.

COLORAÇÃO
Os corantes de anilina usados em esfregaços sanguineos são de duas classes
gerais:
- corantes básicos, como o azul de metileno;
- corantes ácidos, como a eosina.
O núcleo das células toma as cores básicas, como o azul de metileno, enquanto
que os corantes básicos agem sobre os elementos citoplasmáticos. Pertencem a este
grupo os corantes de Romanowsky. Os derivados mais usados do corante primitivo de
Romanowsky são: Giemsa. Leishman, Wrigth entre outros. Nesse setor foi usado o
corante Leishman. (O. LIMA, 1992)

• MATERIAL E MÉTODOS
- Suporte para lâminas
- Corante de Leishman
Colocar a lamina sobre o suporte. Verter 20 gotas do corante sobre a lamina ou
o suficiente para cobri-la. O álcool metilico (metanol) da solução corante fixa o
esfregaço.
Deixar corar durante 15-20 minutos. Lavar em água corrente e deixar secar.
Observar ao microscópio com objetiva de imersão.

CONTAGEM GLOBAL
A contagem dos elementos morfológicos do sangue (eritrócitos, leucócitos e
plaquetas deve ser efetuado pala manhã. Consiste em trabalhar com material aferido
com a finalidade de determinar o número dos elementos morfológicos. Para isso, é
necessário diluir volume conhecido de sangue com determinada quantidade de líquido
diluidor. Conta-se as células na área reticulada da câmara destinada para cada tipo de
células (ver Anexos) (O. LIMA, 1992)

• MATERIAL E MÉTODOS
- Câmara de Contagem (Camara de Neubauer)
- Líquidos diluidores (hayem, Turk, Oxalato de Amônia 1%)
- Pipetas graduadas e automáticas
- Lamínulas

Contagem Global de Leucócitos


Valores de Referencia:
5.000 – 10.000 mm3

- 0.38 mL do líquido de Turk


- 20uL sangue
- Diluição = 1/20

• Depois de homogeneizar o líquido de Turk com o sangue, umedecer a câmara de


líquido de Turk com o sangue, baixo da lamínula, inserir com auxílio da pipeta
automática pequena quantidade da solução diluída. Cuidado para evitar presença de
bolhas. Esperar 5 minutos a fim de que os glóbulos se depositem. Observar ao
microscópio primeiramente com a objetiva de menor aumento e em seguida numa
objetiva de 40X. Fazer a contagem nos quadrantes destinados a leucócitos.

Contagem Global de Plaquetas


Valores de Referêncisa:
150.000 – 400.000 mm3

- 0.38 mL oxalato de amôni 1%


- 20uL sangue
- Diluição = 1:20

• Depois de homogeneizar o oxalato de amônia 1% com o sangue, umedecer a


câmara de Neubauer e cobri-la com lamínula. Pôr baixo da lamínula, inserir com o
auxilio da pipeta automática pequena quantidade da solução diluída. Cuidado para
evitar presença de bolhas. Esperar 10 minutos a fim de que as plaquetas se depositem.
Esperar em câmara úmida. Observar ao microscópio primeiramente com a objetiva de
menor aumento e em seguida numa objetiva de 40X. Fazer a contagem nos quadrantes
destinados a plaquetas, que são os mesmo para contagem de eritrócitos.

VELOCIDADE DE HEMOSSEDIMENTAÇÃO (VHS)


É a velocidade com o qual os glóbulos vermelhos vão para o fundo do tubo. Os
glóbulos vermelhos que sedimentam é porque a sua densidade é maior que a do
plasma. A velocidade com que eles sedimentam é porque a sua densidade é maior que
a do plasma. A velocidade com que eles sedimentam varia, direta ou indiretamente com
vários fatores. (O. LIMA, 1992)

• MATERIAIS E MÉTODOS
- Tubo de Westergren
- Estante de westergren
• O método de Westergren modificado produz os mesmos resultados que o método de
Westergren original, mas emprega sangues naõ coagulado com EDTA ao invés de
citrato. Isso permite que o VHS seja realizado com a mesma amostra de sangue que os
outros estudos hematológicos.
 2 mL de sangue com EDTA bem misturados são diluídos em 0.5 mL de cloreto de
sódio a 0.85% ou 0.5 mL de citrato de sódio a 3.8%. Uma pipeta de Westergren é
completada até a marca 0 (zero) e colocada exatamente na vertical na estante à
temperatura ambientem, sem vibrações ou exposição direta à luz solar. Após
exatamente 60 minutos, a distancia do topoo da coluna é registrda em molímetros como
o valor da VHS. Se a demarcação entre o plasma e a coluna de células vermelhas é
distinta, o nível é lido onde a densidade total aparece primeiro.

Valores de Referência:
Homens: 3-15 mm
Mulheres: 3-20 mm
Crianças: 3-12 mm
CÉLULAS LE (Lupus Eritematoso)
Um anticorpo presente na fração globulina gama do soro dos pacientes de LES,
o chamado fator “LE”, reage com a nucleoproteína dos núcleos dos leucócitos. O
núcleo do fagócito acha-se comprimido na periferia da célula. A maior parte da região
protoplasmática é ocupada pela massa nuclear transformada. O citoplasma reduz-se à
estreita faixa na periferia do leucócitos. Na células “LE”, a estrutura da cromatina é
substituída pôr massa arredondada, homogênea, de coloração púrpura, de tamanho
variável, mas usualmente maior que a hemácia. O fagócito pode englobar mais de
núcleo. (O. LIMA, 1992)

MATERIAL E MÉTODOS
- Banho Maria a 37ºC
- Toma-se o sangue sem anticoagulante e coloca-se em Banho Maria a 37ºC/2hs.
Depois realiza-se o esfregaço e observa-se ao microscopio. Deve-se sempre
realizar o exame FAN junto com o exame de células LE.
CONTAGEM DE RETICULÓCITOS
Os reticulócitos são células vermelhas imaturas não nucleadas que contêm
RNA e continuam a sintetizar hemoglobina após a perda do núcleo. O sangue incubado
rapidamente em uma solução de azul cresil brilhante ou azul metileno. No RNA é
precipitado como um complexo corante ribonucleoproteínas. O complexo aparece
microscopicamente como uma rede azul escura ou grânulos azuis escuros que
permitem a identificação e contagem de reticulócitos. (O. LIMA, 1992)

MATERAIS E MÉTODOS
- Esfregaço sangüíneo
• Conta-se o número de reticulócitos em 10 campos diferentes. O esfregaço é feito a
partir de 100uL de sangue + 1 gota de azul cresil brilhante.

Valores de Referências:
0.5 - 2.0%
10 campos = total / 10 = número %

COAGULOGRAMA
Tempo de Sangria (TS)
É o tempo necessario para a cessação da hemorragia, ocasionando por
pequena incisão, de dimensão padronizada, praticada artificialmente. (O. LIMA, 1992)

• MATERIAL E MÉTODOS
- Equipamento para punção digital
- Papel de filtro
- Cronômetro
• Faz-se a assepsia da polpa digital ou do lóbulo da orelha com a lanceta, fazer a
incisão e deixar o sangue fluir espontaneamente. Marcar no cronometro o início no
momento do aparecimento da primeira gota. Com o papel de filtro absorver de 30
em 30 segundos a gota de sangue formada sem tocar a incisão. Quando cessar o
fluxo de sangue, parar o cronômetro. Quando cessar o fluxo de sangue, parar
cronômetro. O intervalo decorrido entre o aparecimento da primeira e da ultima gota
representa do tempo de sangria.

Valores de referência:
1 – 6 minutos

Tempo de Protrombina Ativada (TAP)


É a prova de escolha para investigação do sistema extrínseco da coagulação
sangüínea. É uma prova de grande valor na demonstração de deficiência dos fatores de
coagulação I, II, V, VII, X. (O. LIMA, 1992)

• MATERIAL E MÉTODOS
- Plasma citratado do paciente
- Solução de tromboplastina
- Banho Maria a 37°C
- Tubos de ensaio
- Solução de cloreto de cálcio a 0.025M

• Coloca-se 100uL do plasma citratado do paciente + 100uL da suspensão de


tromboplastina no tubo de ensaio. Homogeneiza, adicionar rapidamente 100uL da
solução de cloreto de cálcio. Neste instante, acionar o cronômetro. Retirar o tubo do
BM e agitá-lo suavemente, de 2 em 2 segundos, até o aparecimento do coágulo,
parando simultaneamente o cronômetro. O tempo consumido em segundos constitui
o TAP.

Valores de Referência:
11 – 13 segundos

Tempo de Tromboplastina Parcial Ativada (TTPA)


É a melhor prova para investigar as alterações do mecanismo da coagulação
sangüínea. Fatores que participam do sistema intrínseco estão envolvidos, com
exceção das plaquetas e do fator XIII, bem como do fator VII, do sistema extrínseco. (O.
LIMA, 1992)

• MATERIAL E MÉTODOS
- Plasma citratado do paciente
- Solução de tromboplastina parcial
- Banho Maria a 37°C
- Cronômetro
- Tubos de ensaio
- Solução de cloreto de cálcio a 0.025 M
• Coloca-se 100uL de cefalina + 100uL plasma citratado do paciente. Homogeneiza e
encuba em Banho Maria a 37°C/3 min. Após esse tempo, adicionar rapidamente
100uL da solução de cloreto de cálcio. Neste instante, acionar o cronômetro. Agitá-
lo suavemente, de 5 em 5 segundos. Ao fim de 30 segundos, retirar o tubo do BM e
agitá-lo suavemente, observando o aparecimento do coágulo, parando
simultaneamente o cronômetro. O tempo consumido em segundos constitui o TTPA.

Valores de Referência:
35 – 45 segundos

CONTAGEM DIFERENCIAL DE LEUCÓCITOS


Consiste em determinar a proporção existente entre as distintas variedades de
leucócitos. A contagem diferencial de leucócitos é dos mais valiosos métodos entre os
exames citológicos do sangue. (O. LIMA, 1992)

• MATERIAL E MÉTODOS
- Esfregaços corados
• Deve-se observar a lâmina próximo à cauda o esfegaço onde quase não se
encontra “roleaux” e facilita a contagem. Total de 100 células.
FIBRINOGÊNIO
• MATERIAIS E MÉTODOS
- Tubo capilar
- Plasma
- Microcentrífuga
- Tabela de Hct
- Banho Maria a 56°
• Aspira-se o plasma no tubo capilar e encuba-se em Banho Maria a 56ºC/15 minutos.
Leva-se à centrífuga para microhematócrito por 5 minutos / 3000 RPM. Faz-se a leitura
na tabela para Hct e multiplica o resultado por 92.

Valores de Referência:
200 – 400 mg/dL

INDÍCES HEMATIMÉTRICOS
VCM = Hct / Hem x 100 u3
HCM = Hb/ Hem x 100 pg
CHCM = Hb / 100%
PROCEDIMENTO DE ROTINA SOROLOGIA
MANUAL
SOROLOGIA
O melhor diagnóstico de um processo infeccioso é a demonstração do
patógeno ou de seus produtos nos tecidos ou fluidos biológicos do hospedeiro. Nem
sempre é possivel essa prática pela ausência do agente infeccioso ou pela pocua
sensibilidade dos métodos ou por longos períodos exigidos para uma resposta
laboratorial.
Métodos parasitológicos ou microbiológicos são deficientes para diagnóstico de
algumas patologias. São utilizados métodos imunológicos, sorológicos ou
imunoensaios. São técnicas para a detecção e quantificação de Ag ou Ac, podendo
utiliza-se de reagentes marcados ou não. Comumente são utilizados marcadores
radiotaivos, enzimpaticos, fluorescentes e quimioluminescentes.
Os testes sorológicos são feitos através de pesquisas de anticorpos pu
antígenos, sendo a reação Ag – Ac, visualizada pôr alguns métodos como aglutinação,
precipitação, floculação e outros. Esses testes de pesquisa de Ag – Ac desempenham
uma importante função de diagnóstico laboratorial clínico como complemento de outros
testes e provas, desde que sejam respeitadas suas indicações e limitações.

OBJETIVO
No setor de sorologia, o principal é demonstrar aos estagiários os princípios das
técnicas mais usadas nos testes sorológicos, assim sua importância e identificação.
A alta sensibilidade dos testes utilizados garante um importancia no setor de
triagem sorológica para seleção de pacientes que podem vir a ser doadores e recptores
de orgãos, evitando transtornos pós-transfusionais.
A Ciência Sorologia tem como principal objetivo pesquisar anticorpos
específicos auxiliando, assim, no diagnóstico individual de determinadas patologias com
também diferenciando as fases da doença.
 Imunodifusão Radial Simples
- Príncipio – Antígeno ou Anticorpo permanecem fixados ao suporte e o outro se
difunde, até haver um halo de precipitação formado pôr reação de Ag com o Ac ao
redor da inoculação.
- Materiais e Métodos – Toma-se uma placa com gel (ágar misturado com a diluição
apropriada de Ag específico para Ac determinado) contendo orifícios onde, com ajuda
da micropipeta, será adicionado 5uL do soro. Fecha a placa e guarda em forma
invertida em câmara úmida, para que mantenha o meio úmida, pôr 48h a 72h.

Valores de Referência:
IgG: 710 – 1520 mg/dL
IgM: 90 – 310 mg/dL

AGLUTINAÇÃO
A reação de aglutinação é caracterizada pela formação de agregados visíveis
como resultado da interação de anticorpos específicos e partículas insolúveis que
contêm determinantes antigênicos em sua superfície.
A aglutinação pode ocorrer tanto com particulas que apresentam determinadas
antigênicos naturais em sua superfície (hemácias, bactérias, protozoários, etc.) como
com partículas inertes (látex, poliestireno, etc.), ou mesmo com células antigenicamente
não relacionadas (hemácias, bactérias) às quais se absorvem ou se fixam antígenos
solúveis.
As reações podem ser de aglutinação direta ou indireta.

A) TESTE DA AGLUTINAÇÃO DIRETA


- Princípio – Aglutinação de partículas antigênicas insolúveis, em sua forma íntegra
ou fragmentada, na detecção de anticorpos específicos. Teste bastante utilizado para
classificação sanguinea, mononucleose infecciosa e brucelose.
- Materiais e Métodos –
 Bruceloso (Antígeno Rosa Bengala): é uma suspensão de bacilozs em
coloração rosa, mistura o bacilo com amostras de pacientes e complexo Ag – Ac se
aglutina.
 Mononucleose: Toma-se uma placa de vidro e mistura-se uma gota do soro do
paciente com o reagente que contém hemácias de cavalo (ag para mononucleose mais
Ac heterófilos).
Observa-se a presença de aglutinação. Como os anticorpos heterófilos, que
não são específicos para o vírus Epstein-Barr, podem aglutinar as hemácias de cavalo,
para o teste positivo realiza-se uma Segunda etapa. Nesta, mistura o soro com células
renais de cobaia, as quais removam quase todos os anticorpos heterófilos da
mononucleose infecciosa.

B) TESTE DA AGLUTINAÇÃO INDIRETA


- Princípio – As hemácias e as partículas inertes podem ser sensibilizadas por
adsorsão passiva, devida aos contatos direto com os Ag solúveis. São utilizados como
suportes na adsorção de proteína solúvel e Ag polissacarídeos, funcionando como
sistema indicador da reação Ag-Ac.

AGLUTINAÇÃO DO LÁTEX
 PCR (Proteína C Reativa): reação de aglutinação em lâminas, a qual particulas
de latex sensibilizadas com Ac anti-PCR estabilizadas são aglutinadas em presença da
Proteína C Reativa.
- Materiais e Métodos -
a) Determinação Qualitativa: Numa lâmina de vidro, com àreas para diferentes
testes, depositar sucessivamente em 3 subdivisões, 1 gota de soro positivo, 1 gota de
soro negativo e 1 soro do soro a testar. Adicionar a cada uma delas 1 gota do reativo
látex anti-PCR. Homogeneizar. Fazer movimentos suaves de rotação procedendo a
leitura após cinco minutos.
b) Determinação Semi-Quantitativa: Em casode amostra positiva, realizar
sucessivas diluição do soro até que se encontre a maior diluição que ainda fornece
aglutinação. O procedimento da análise é o mesmo do teste qualitativo, porém, utiliza-
se as amostras diluídas. Sendo a sensibilidade do teste de 7UI/mL, o cálculo semi
quantitativo é realizado da seguinte forma:
[ ] = 7 x (maior diluição positiva)

 FR (Fator Reumatóide)
- Materiais e Métodos –
a) Determinação Qualitativa: Pipetar 1 gota do soro do paciente em uma área da
lâmina e , sobre ela, 1 gota da suspensão de látex sensibilizado com IgG humana
altamente purificada e estabilizada e suspensa em tampão glicina. Proceder da mesma
forma com os soros controle positivo e negativo. Fazer movimentos suaves de rotação,
sob uma boa fonte de luz, durante 2 minutos. Observar a formação de aglutinação.
b) Determinação Semi-Quantitativa: Em caso de amostra positiva, realizar
sucessivas diluições do soro até que se encontre a maior diluição positiva. O cálculo
semi quantitativo é realizado da seguinte forma:
[ ] = 25 x (maior diluição positiva)

 ASLO (Anti-Estreptolisina O): Reação de aglutinação em lâminas, a qual


partículas de látex sensibiladade com estreptolisina “O” estabilizada são aglutinadas em
presença de anti-estreptolisina. O reativo é padronizado pôr comparação com o padrão
da OMS.
- Materiais e Métodos-
a) Determinação Qualitativa: Numa lâmina de vidro, com áreas para diferentes
testes, depositar sucessivamente em 3 subdivisões, 1 gota de controle positivo, 1 gota
de controle negativo e1 gota do soro a testar. Adicionar a cada uma delas 1 gota do
latex sensibilidade com ASO. Homogeneizar. Fazer movimentos suaves de rotação.
Proceder a leitura em exatamente 2 minutos.
b) Determinação Semi-Quantitativa: Em caso de amostra positiva, a partir da
diluição 1/20, realizar sucessivas diluições de razão 2 a té 2560 em tampão glicocola. O
procedimento da análise diluídas. O título de Ac ASO é calculado da seguinte forma:
UI/mL = inverso da última diluição positiva x 10.

HEMAGLUTINAÇÃO INDIRETA

Hemácias estão entre os melhores suportes de Ag para os testes de


aglutinação, pois uma serie de Ag que pode ser ligada à sua superfície para fornecer
um sistema indicador sensível na detecção de Ac, porém, sua superfície é complexa,
facilitando a ligação de muitos Ag e, frequentemente, acarreta a presença de Ac
heterófilos que devem ser removidos antes da execução do teste.

 CHAGAS
- Princípio – Eritrócitos de aves estabilizados, sensibilizados com compontes
antigênicos Trypanossoma cruzi altamente purificados, mostram aglutinação quando
reagem com Ac contra esses antígenos presentes no soro do paciente.
- Materiais e Métodos –
a) Determinação Qualitativa: Colocar a placa sobre um pano úmido para
neutralizar as forças eletrostáticas. Usar 1 cavidade da placa pôr amostra, incluindo
sempre os controles positivo e negativo. Usar diluição do soro 1/32 com a solução
diluente com os controles positivo e negativo. Transferir 25uL da suspensão
homogênea de hemácias placa. Adicionar 25uL da suspensão homogênea de hemácias
em cada cavidade. Agitar a placa pôr vibração mecânica pôr 4 minutos. Deixar em
repouso por 1 a 2 horas à temperatura ambiente, em locar livre de vibrações. Fazer a
leitura. Reação positiva como um tapete e reação negativa quando se depositam no
fundo da cavidade formando um botão.
b) Determinação Quantitativa: Em caso de amostra positiva, deve-se realizar
sucessivas diluições (titulação) a partir da diluição do soro de 1/32. Pipetar 25uL da
solução diluente com 2-Mercaptoetanol, a partir da Segunda cavidade da placa, até a
diluição que se pretende estudar. Titular sempre deixando 25uL da diluição, desprezar
os últimos 25uL. Pipetar 25uL da suspensão homogênea de hemácias em todas as
cavidades. Agitar a placa pôr vibração mecânica por 4 minutos. Deixar em repouso pôr
1 a 2 horas à temperatura ambiente, em local livre de vibrações. Fazer a leitura.
 TOXOPLAMOSE
- Princípio – Eritrócitos de aves estabilizados, sensibilizados com componentes
antigênicos do Soxoplasma gonddi altamente purificados, mostram aglutinação quando
reagem com Ac contra esses antígenos presentes no soro do paciente.

- Materiais e Métodos –
a) Determinação Qualitativa: Colocar a placa sobre um pano úmido para
neutralizar as forças eletrostáticas. Usar cavidade da placa por amostra, incluindo
sempre os controles positivo e negativo. Usar diluição do soro 1/16 com a solução
diluente com 2-Mercaptonol. Fazer o mesmo com os controles positivo e negativo.
Transferir 25uL da diluição 1/16 de cada amostra e controles para as respectivas
cavidades da placa. Adicionar 25uL da suspensão homogênea de hemácias em cada
cavidade. Agitar a placa pôr vibração mecânica pôr 4 minutos. Deixar em repouso por 1
a 2 horas à temperatura ambiente, em local livre de vibrações. Fazer a leitura. Reação
positiva quando as hemácias de depositam no fundo da cavidade como um tapete e
reação negativa quando se depositam no fundo da cavidade formando um botão.
b) Determinação Quantitativa: Em caso de amostra positiva, deve-se realizar
sucessivas diluições (titulação) a partir da diluição do soro de 1/32. Pipetar 25uL da
solução diluente com 2-Mercaptoetanol, a partir da Segunda cavidade da placa, até a
diluição que se pretende estudar. Titular sempre deixando 25uL da diluição, desprezar
os últimos 25uL. Pipetar 25uL da suspensão homogênea de hemácias em todas as
cavidades. Agitar a placa por vibrações mecânicas pôr 4 minutos. Deixar em repouso
pôr 1 a 2 horas à temperatura ambiente, em local livre de vibrações. Fazer a leitura.

 FLOCULAÇÃO (VDRL)
O teste de VDRL (Veneral Disease Research Laboratory) emprega cristais de
colesterol que são sensibilizados com cardiolipina para a pesquisa de Ac na sífilis. É
classificado como um teste não treponêmico, usado como triagem ou controle da cura.
- Princípio – Reação imunológica de floculação utilizando antígeno de
cardiopina, lecitina e colesterol em solução alcoólica, onde as partículas de Ag floculam
ao entrar em contato com o soro ou plasma (reagina).
- Materiais e Métodos –
a) Determinação Qualitativa: Tem como objetivo a triagem e eliminação dos soros
não reagentes. Para isso, toma-se uma placa de Kline com suas cavidades
devidamente identificadas para cada reação. Pipetar 50uL da amostra a ser analisada e
dos soros controle positivo e negativo. Adicionar-se 25uL da suspensão antigênica à
cada cavidade, que irá reagir com os Ac presentes. Colocar lâmina em agitador
mecânico pôr 4 minutos. Fazer leitura em microscópio com objetiva de 10x.
b) Determinação Semi - Quantitativa: Tem como objetivo reduzir a pequenos
intervalos a quantidade de Ac presentes na amostra. Para tanto, deverá ser feita
diluição da amostra em solução salina. Proceder cada diluição do mesmo modo como
no teste qualitativo. O título da amostra será o da última diluição onde ainda se visualiza
a presença de agregados.

UROANÁLISE
Com a análise da urina, iniciou-se a medicina laboratorial. Foram encontrados
hieróglifos egípcios com desenhos de médicos examinado frascos de urina em forma
de bexiga. Muitas vezes, esses médicos nunca viam o paciente, apenas sua urina.
Embora não contasse com os sofisticados métodos atuais, eram capazes de obter
informações diagnósticas a partir de observações básicas como cor, turvação, odor,
volume, viscosidade e até mesmo presença de açúcar, ao observarem que certas
amostras atraíam formigas. É interessante notar que essas mesmas características
urinárias ainda são relacionadas pêlos laboratórios hoje em dia. Contudo os modernos
métodos de uroanálise ampliam seu campo de ação, abrangendo não só o exame físico
mas também a análise bioquímica e o exame microscópico do sedimento urinário.
(STRASINGER, 1998)
Analisaremos também o LCR (Líquido Cefalorraquidiano). Trata-se de um
sistema fisiológico destinado a distribuir nutrientes pelo tecido nervoso, retirar resíduos
metabólicos e servir de barreira mecânica para amortecimento dos traumatismos que
porventura atinjam o encéfalo e a medula espinhal. (STRASINGER, 1998).
Por fim, faremos também uma análise do líquido seminal. Com exceção da urina,
é o líquido recebido com mais freqüência em laboratórios de análises clínicas. As duas
principais razões para sua analise são avaliações de casos de infertilidade e do estado
pós-vasectomia. (STRASINGER, 1998)

MATERIAIS E MÉTODOS
• COLETA (STRASINGER, 1998)
URINA – A amostra deve ser colhida em recipiente limpo e seco.
Recomenda-se o uso de recipientes descartáveis por serem econômicos e pôr
eliminarem a possibilidade de contaminação decorrente de lavagem incorreta.
O recipiente de amostra deve ser devidamente etiquetado, contendo data e
nome do paciente. As etiquetas devem ser postas sobre o recipiente e não sobre a
tampa.
A amostra deve ser entregue imediatamente ao laboratório e analisada
dentro de uma hora. A amostra que não puder ser entregue ou analisada dentro desse
tempo devera ser refrigerada ou receber conservante químico apropriado.
LCR – O LCR é normalmente colhido por punção lombar entre L3 e L4 ou
entre L4 e L5. As amostras geralmente são colhidas em tubos estéreis, marcados 1,2 e
3, na ordem em que são obtidos. O tubo 1 é usado par análises bioquímicas e
sorológicas, o tubo 2 destina-se á contagem celular e o tubo 3 em geral é usado par a
microbiologia, por ser o que menos probabilidade tem de conter células introduzidas
acidentalmente pelo procedimento de punção espinhal.
SÊMEN - Como a composição das frações do sêmen é variável, sua coleta
deve ser bem feita para que a avaliação da fertilidade masculina seja precisa. Para
isso, os pacientes devem ser bem orientados. As amostras devem ser colhidas em
recipientes estéreis após três dias de abstinência sexual. Não é recomendável o uso de
preservativos o uso de preservativos na coleta de amostras para os exames de
fertilidade, pois podem conter substancias espermaticidas. Sempre que possível, a
amostra deve ser colhida em laboratório, mas se isso não for viável, deverá ser mantida
em temperatura ambiente e entregue em até uma hora ao laboratório. Deverá ser
anotada a hora da coleta e não do recebimento.

• CONSERVAÇÃO (STRASINGER, 1998)


URINA - O método de conservação mais utilizado é a refrigeração, capaz de
evitar a decomposição bacteriana da urina pelo período de uma noite. É preciso deixar
que a amostra volte à temperatura ambiente antes da análise química com fitas
reativas. Existem várias conservantes químicos que podem ser utilizados, portanto é
impossível escolher aquele que se ajuste melhor às necessidades da análise solicitada.
LCR - Amostras destinadas a outras análises bioquímicas e sorológicas devem
ser congeladas. O líquor da seção de hematologia deverá ser refrigerado se não for
possível fazer contagem celular do mesmo em uma hora; o da microbiologia mantido à
temperatura ambiente e analisado o mais depressa possível.

• URINA TIPO I (STRASINGER, 1998)


TÉCNICA
- Num tubo uroanálise, colocar 10 mL de urina.
- Passar a fita reativa e anotar os resultados. Onde for positivo, colocar a
alteração.
- Calibrar o tubo e centrifugar a 2500 RPM por 5 minutos.
- Inverter o tubo no container até que reste 1 ml.
- Contar na câmara de Neubauer.

EXAME FÍSICO E FITA REATIVA


Analisa-se macroscopicamente alguns aspectos da urina. Mergulha-se a fita na
urina e através de uma reação de cor analisada-se os seguintes itens:
- Cor: Varia de amarelo claro a âmbar.
- Aspecto: Varia de levemente turvo a fortemente turvo.
- pH: Embora um indivíduo sadio geralmente produza a primeira urina da
manhã com pH ligeiramente ácido, entre 5.0 e 6.0, o pH normal das outras amostras do
dia podem varias de 4.5 a 8.0.
- Densidade: É uma medida da densidade das substâncias químicas dissolvidas
na amostra. Geralmente é medida na fita reativa ou pelo refratômetro. A densidade
normal da urina varia de 1.010 a 1.030.
- Proteínas: A constatação de proteínas nem sempre significa doença renal,
mas sua presença realmente exige a realização de outras análises para verificar a
normalidade ou anormalidade do quadro.
- Glicose: devido à sua utilidade na detecção e no controle do Diabetes melito, o
teste de glicosúria é a análise bioquímica realizada com maior freqüência na urina.
- Corpos cetônicos: Normalmente não aparecem em quantidades mensuráveis
na urina, pois toda gordura metabolizada é completamente degradada e convertida em
dióxido de carbono e água.
- Sangue: Pode estar presente na forma de hemácias íntegras ou de
hemoglobina. Se encontrar Hemoglobina e mioglobina na câmara, terá que aparecer na
fita. Daí pesquisa-se sangue oculto.
- Bilirrubina: Sua presença pode ser a primeira indicação de hepatopatia, e
muitas vezes é detectada bem antes do desenvolvimento de icterícia.
- Urobilinogênio: É um pigmento biliar resultante da degradação da
hemoglobina. Aparece na urina porque, ao circular no sangue a caminho do fígado,
pode passar pelos rins e ser filtrado pêlos glomérulos.
- Nitrito: É um método rápido de detectar infecções do trato urinário.

EXAME QUÍMICO E SEDIMENTOSCOPIA


Na câmara de Neubauer, conta-se os 4 quadrantes laterais (eritrócitos) e multiplica por
250 ou conta 1 quadrante e multiplica por 1000. Este último é mais utilizado. Faz-se
isso para contagem de hemácias e leucócitos. Procura-se por:
- Hemácias
- Leucócitos
- Células
- Cilindros: Pode ocorrer em exercícios físicos intensos. Conta-se os 4
quadrantes e multiplica por 110. Os mais encontrados são os epiteliais e os hialinos. Se
tem cilindros, tem proteínas.
- Bactérias: Podem apresentar bactérias nitrificantes e não nitrificantes. Se tem
bactérias, tem leucócitos.
- Leveduras: Ocorre quase sempre em glicosúria e conta-se em cruzes de 1a 4.
- Muco
- Cristais: Caso encontrados, soltar resultados em cruzes de 1 a 4. Em RN é
comum encontrar cristais de urato.
- Outros - Parasitas, espermatozóides, cálculos, artefatos, etc.

TESTES BIOQUÍMICOS
- Proteinuria
2 mL de Ac. Sulfossalicílico a 3%
0,5 mL de urina
Homogeneizar.
 Resultado: +
Formação de turvação

- Proteína de 24 hs (Quantitativo)
Homogeneizar a amostra e medir o volume com precisão.
Branco Amostra
Ácido Sulfossalicílico - 2.0 mL
Água destiliada 2.0 mL -
Amostra 0.5 mL 0.5 mL

Homogeneizar, aguardar 10 minutos em TA e verificar a Abs. em 560 nm.


 Resultado:
Ptn 24 hs: volume 24 hs x Fator (1.74) x Abs. A
V.R.: até 150 mg/dL

- Proteína Ortostática ou Postural


Ocorre em paciente que permanece, longos períodos sentados ou em pé, onde
os rins são comprimidos pelos órgãos superiores - diminuição da reabsorção de
proteína - proteinuria.
Coleta-se um amostra após o paciente ter permanecido um período sentado (2
hs) - RESULTADO POSITIVO.
Para confirmação, coleta-se uma outra amostra, a primeira da manhã -
RESULTADO NEGATIVO - Ptn Ortostática ou Postural.

- Proteína de Bence Jones


Mieloma múltiplo - Proliferação dos plasmócitos - Liberação de microglobulinas
(Bence Jones) - Baixo peso molecular - Proteinuria.
Levar cerca de 5 mL de urina ao BM 50 - 60ºC e levar ao BM 100º por 5
minutos. Se ficar límpida, confirma-se Proteínas de Bence Jones. Se continuar turvo,
pode ser qualquer outro tipo de proteína.
Característica: Desnatura aos 50-60º C e torna-se límpida aos 100º C. Se der
positivo, confirmar com eletroforese ou contraimunoeletroforese.

- Glicosúria
2 mL de Reativo de Benedict
4 gotas de urina
Homogeneíza. Coloca em banho fervente por 5 minutos.
+ Resultado:
Marron Tijolo: ++++
Verde com sedimento amarelo: +++
Verde sem sedimento amarelo: ++
Verde claro: +
Azul: Negativo

- Corpo Cetônicos
1 mL de urina
6 gotas de Reativo de Imbert
Homogeneizar
Acrescentar 1 mL de hidróxido de Amônia vagarosamente pelas bordas do
tubo.
 Resultado
Formação de halo roxo entre duas fases.

• URINA TIPO II (STRASINGER, 1998)


Faz-se a análise tipo II geralmente em casos de cirrose, hepatopatias, anemia
hemolítica. Pesquisa-se:

• PESQUISA DE HCG (STRASINGER, 1998)


- Gravidez com resultado negativo
Estágio inicial
Gravidez ectópica
Trimestre final da gravidez

- Ausência de gravidez com resultado positivo (raro)


Menopausa - gonadotrofina hipofisária
Endocrinopatias - LH

-Resultado positivo com taxa elevada de HCH


• Doenças trofoblásticas:
Mola hidatiforme
Coriocarcinoma

• Reação de aglutinação em látex


• Imunocromatocráfico (Ac monoclonal)

Observações:
- Esse hormônio aparece primeiramente no soro e, depois da sobrecarga
sanguínea, é excretado na urina.
- No trimestre final pode ocorrer HCG negativo em caso de aborto, com a placenta
inativa.
- Doenças trofoblásticas liberam grande concentração de HCG.
- Pesquisa de HCG em homens: suspeita de CA de testículo.

- Urobilinogênio
2,5 mL de urina
0,5 mL reativo de Erlich
Positivo se forma coloração vermelha. Caso de positivo, realizar diluição
sucessivas, começando com 1,0 mL de urina + 9,0 mL de água destilada. Diluição de
1/10, 1/20, 1/40, 1/80, 1/160.
Adiciona 1,0 mL de reativo de Erlich.
 Resultado:
Urobilinogênio: 1/? EU (Unidade Erlich)

- Pigmentos Biliares
1,0 mL ácido nítrico
1,0 mL de urina, pelas bordas do tubo, vagarosamente.
Positivo se formar um halo verde.

- Pesquisa de Sangue Oculto


Centrifugar 10 mL de urina a 2000 RPM pôr 5 minutos.
Desprezar todo o sobrenadante
Acrescentar 6 gotas do Reativo de Benzidina
Positivo se formar um coloração de azul a verde.

Reativo de Benzidina:
Uma porçãode Benzina
1,0 mL H2O2
1,0 mL de ácida acético 50%
Homogeneizar
 Preparar o reativo somente na hora do uso.
• HCG de 24 horas
Sucessivas diluição a começar de 1 / 2.
 Resultado:
Volume de 24 hs x ultima diluição positiva x 2,5 = ? UI/24 horas
• LÍQUIDO CORPORAIS (STRASINGER, 1998)
- ANÁLISES DO LCR
A) Exame físico
Aspecto:
Antes de centrifugar: vermelho / turvo
Depois de centrifugar: deve diferenciar o LCR

 Para diferenciar Punção Traumática de hemorragia Intracraniana.


1) Após centrifugação
PT: forma sedimento (botão de hemácias e sobrenadante límpido)
HI: não forma sedimento.

2) Distribuição desigual de sangue nos tubos


PT: a quantidade de sangue vai diminuindo nos tubos.
HI: Os três tubos permanecem vermelho por igual.

3) Formação de coágulo
PT: não forma coágulo
HI: forma coágulo

B) Exames microscópico
a) Contagem Global
- Leucócitos:--- mm³
- Hemácias: 0-5 / mm³; RN.: até 100/mm³
Homogeneizar o material e preencher a câmara de Fuchs Rosenthal.
Contar todos os quadrantes e dividir o número de células contadas por 3.

b) Contagem Diferencial
Concentrar o material e fazer esfregaço com a câmara de Suta.
Corar com Leishman, Wright ou Giemsa.
Contar 100 Células:
- neutrófilos (Meningite bacteriana)
- linfócitos (Menegite viral)
- eosinofilos (Neurocisticercose)
- monócitos (Meningite turbelosa e fúngida)

C) Exame químico
Glicose (60% glicose plasmática)
Proteína: 15 - 40 mg/dL

- ESPERMOGRAMA
A) Fases
1ª fase: Liquefação primária ou virtual
2ª fase: Coagulação (duração até 30 minutos)
3ª fase: Liquefação secundaria. Ausência dessa fase → INFERTILIDADE

B) Contagem Global
Homogeneizar a amostra e diluir em 1/40 (3.9 mL solvente fisiológico + 100uL
de esperma).
Preencher a câmara de Neubauer.
Contar SPTZ em objetiva de 40 X nos quadrantes laterais e central, multiplicar o
número o contado por 80.000.
Se a quantidade de SPTZ for muito elevado, contar apenas o quadrante central
e multiplicar por 400.000.
Resultados expressos em mL. V.R.: 60 milhões/mL
C) Viabilidade
Em um tubo, colocar uma gota de esperma e acrescentar 2 gotas de eosina +
2gotas de nigrosina.
Confeccionar esfregaço e secar rapidamente.
Verificar a quantidade de SPTZ vivos (brancos) e mortos (vermelhos) - Objetiva
de imersão.
Vivos: mais do que 70%
Mortos: menos do que 30%
PROCEDIMENTO DE ROTINA
PARASITOLOGIA
EXAME PARASITOLOGIA DE FEZES

O exame é utilizado no diagnóstico das parasitoses intestinais e tem como


objetivo o encontro de trofozoítas e cistos de protozoários e ovos ou larvas de
helmintos. Um resultado parasitológico negativo não exclui a possibilidade de infecção
por parasitas, levando em consideração a idade da infecção e as "fases negativas" de
determinados parasitas, como a Giárdia lamblia, por exemplo. Os ovos de Taenia sp.
(solitária) e Enterobius vermicularis (oxiúrus) raramente são encontrados nas fezes,
sendo mais comumente encontrados na região perianal.
Os seguintes parasitas intestinais são patogênicos e devem ser erradicados:
- Ascaris lumbricoides
- Capillaria hepática
- Clonorchis sinensis
- Blastocystis hominis
- Cyclospora
- Cryptosporidium (quando em imunodeprimidos)
- Dientamoeba fragilis
- Dipylidium caninum
- Diphyllobotrium latum
- Entamoeba hispolytica
- Enterobius vermiculares
- Giárdia lamblia
- Hymenolepis diminuta
- Hymenolepis nana
- Isospora belli
- Isospora spp.
- Microsporídia
- Progonimus westermani
- Strongyloides stercoralis
- Trichuris trihiura
- Schistosoma mansoni
- Ancilostomideos

Não é necessária medição quando são encontrados os seguintes parasitas não


patogênicos:
- Chilomastix mesnili
- Cryptosporidium (quando em imunocompetendes)
- Endolinax nana
- Entamoeba coli
- Entamoeba hartmani
- Iodanoeba bütschlii

MATERIAL / AMOSTRA
A amostra fecal deve ser colhida diretamente no frasco ou em um urinol, ou
ainda em jornal ou papel limpo, e transferidas diretamente para o frasco coletor. O
frasco coletor deve estar livre de anti-sépticos, agentes germicidas, de gotas de óleo e
de urina, para evitar a destruição de formas vegetativas dos parasitas. Fezes obtidas de
vasos sanitários não podem ser utilizadas.
Cada amostra deverá apresentar no mínimo, as seguintes informações: nome
do paciente, número de identificação, nome do médico, data e horário da colheita, e
deverá vir acompanhada do pedido médico indicando qual o procedimento laboratorial a
ser seguido.
Os recipientes com amostras fecais recebidos de pacientes com AIDS deverão
ser protegidos por um invólucro de plástico e identificados com etiquetas vermelha ou
HIV positivo.
O ideal para a certeza diagnóstica é a realização de exames em três amostras
obtidas em dias alternados.
O uso de laxantes só é indicado caso haja uma série de exames negativos em
pacientes com suspeita clínica. Nestes casos administrar laxantes salinos. Óleos
minerais (nujol etc.) e compostos de bismuto e magnésio não devem ser empregados
por interferirem no resultado dos exames. As fezes obtidas por uso de laxantes devem
ser levadas imediatamente ao laboratório.
O tempo de colheita da amostra fecal influência diretamente na identificação
dos parasitas. Por essa razão amostra fecais diarréicas e pastosas devem ser levadas
ao laboratório após no máximo, 30 minutos após a evacuação. As amostras fecais
sólidas devem ser entregues no laboratório até 2 horas sem refrigerar e no máximo até
14 horas se mantidas sob refrigeração (não congelar!).
Quanto ao uso de medicamentos, o ideal é não ter usado anti-parasitários e
antibióticos nas últimas 3 semanas e antidiarréicos e antiinflamatórios nas 72 horas que
antecedem a coleta.

METODOS
- Técnicas de concentração: métodos de Faust (centrifugação-flutuação em solução
saturada de sulfato de zinco) e método de Lutz ou Hoffman, Pons Er Janes)
sedimentação espontânea em água)
- Exame direto à fresco: realizado se a amostra for diarréica ou se apresentar muco,
pus ou sangue.
- Exame quantitativo para contagem de ovos de helmintos nas fezes: métodos de Kato-
Katz.
- Técnica de isolamento de larvas de nematódeos: métodos de Rgai.

PESQUISA DE SANGUE OCULTO NAS FEZES


O teste é realizado no auxilio ao diagnóstico de lesões sangrantes da mucosa
de porções baixas do trato digestório (especialmente lesões dos cólons) e como
métodos de triagem no diagnostico precoce do câncer dos cólons em indivíduos acima
dos 40 anos.
A pesquisa de sangue oculto nas fezes deve ser precedida de dieta rigorosa por
quatro dias, da qual se excluem as carnes, os vegetais verdes (clorofila) e os
medicamentos à base de ferro; e deve ser feita em amostra fecal recentemente emitida.

MÉTODO DE EXAME DIRETO À FRESCO


Um procedimento simples e eficiente para o estudo das fezes, permitindo
observar as formas trofozoítas vivas dos protozoários. Os esfregaços com fezes frescas
e não fixadas são preparados com soluções salina fisiológica a 0,85% e de Iodo de
Lugol, separadamente. Os esfregaço deverão ser sistemáticos e completamente
examinados através de objetiva de microccópio de pequeno aumento (10x) e com
pequena intensidade de luz. A confirmação dos parasitas deve ser realizada com
objetiva de grande aumento (40 x).

SOLUÇÃO SALINA FISIOLÓGICA A 0,85%


Cloreto de sódio (NaCI) ---------------------------------------------------------------------------- 8,5 g
Água destilada-deionizada ----------------------------------------------------------------------1000 ml

MÉTODO DE CENTRÍFUGO-FLUTUAÇÃO EM SOLUÇÃO DE SULFATO DE ZINCO


(MÉTODO DE FAUST et al., 1938)
Procedimento utilizado para diagnostico de cistos de protozoários e ovos de larvas de
helmintos, ovos grandes de trematódeos, de cestódeos e inférteis de Ascaris
lumbricoides não são concentrados por este método, devido à sua densidade ser maior
do que a da solução ser sulfato de zinco utilizada, não permitindo sua flutuação. É um
método impróprio para fazer contendo grande quantidade de gordura.
 Colocar 1 ou 2 g de fezes coletadas de várias partes do boldo fecal em frasco
contendo 10 mL de água corrente.
 Homogeneizar e filtrar a suspensão através de gaze dobrada quatro vezes, e
receber o filtrado em um tubo cônico de centrífuga de 15 mL.
 Adicionar água corrente até completar 2/3 da capacidade do tubo. Centrifugar a
2.500 r.p.m por 60'.
 Desprezar o sobrenadante e adicionar 1 a 2 mL de água corrente ao sedimento,
antes de ressuspendê-lo. Completar com água corrente 2/3 do volume do tubo,
agitar e centrifugar.
 Repetir a etapa anterior até que o sobrenadante apresente-se relativamente
claro.
 Depois que o último sobrenadante é descartado, adicionar a 1 a 2 mL de solução
de sulfato de zinco (d= 1,18 g/mL) e ressuspender o sedimento. Completar com
o mesmo reagente até 0,5 cm da borda do tubo e centrifugar.
 Cuidadosamente, remover o tubo da centrifuga e, sem agitação, colocá-lo em
uma estante em posição vertical.
 Com uma alça de arame (diâmetro de 5 e 7 mm) tocar o centro da membrana
formada na superfície, transferindo varias alçadas para uma lâmina de
microscópica.
 Colocar 1 gota de Lugol e lamínula. Examinar no microscópio óptico em aumento
de 100x.

SOLUÇÃO DE SULFATO DE ZINCO (d= 1,18 g/mL)


- sulfato de zinco (ZnSo4) ------------------------------------------------------------------------- 330 g
- água destilada-deionizada --------------------------------------------------------------------- 670 mL
Ajustar a densidade da solução com densitômetro pela adição de sal ou água e filtrar
em papel-filtro.

MÉTODO DE SEDIMENTAÇÃO ESPONTÂNEA EM AGUA


(MÉTODO DE LUZTZ, 1919; HOFFMAN, PONS E JANER, 1934)
Método é indicado para pesquisa de ovos e larvas de helmintos e cistos de
protozoários. Fundamenta-se na sedimentação espontânea em água, havendo uma
necessidade mínima de vidrarias e sendo dispensável o uso de reagentes e
centrifugação.

- Colocar cerca de 5g de fezes, coletados de várias partes do bolo fecal, em um corpo


graduado ou em bequer de 250 mL. Completar o volume de 50 a 60 mL com água
corrente e homogeneizar.
- Preparar a suspensão adicionando 100 mL de água corrente.
- Filtrar essa suspensão de gaze dobrada quatro vezes, recolhendo-se em cálices de
sedimentação com capacidade de 125 mL.
- Se necessária adicionar água corrente até completar aproximadamente 3/4 do volume
do cálice cônico. Deixar a suspensão em repouso durante 1 a 2 horas.
- Com uma longa pipeta capilar ou em canudo plástico, colher uma pequena porção do
sedimento e depositar sobre uma lâmina de microscópica. Se o sedimento estiver muito
espesso, diluir com uma gota de solução salina a 0,85% ou água corrente.
- Colocar 1 gota de Lugol e cobrir com lamínula. Examinar no microscópio óptico em
aumento de 100 x.

OBS: A amostra pode ser sedimentada por um tempo maior, a fim de aumentar a
concentração de cistos de protozoários e ovos leves de helmintos no sedimento.

MÉTODO MODIFICADO DE KATO-KATZ


(KATO, 1960; KATZ, CHAVES & PELLEGRINO, 1972)
É um método de esfregaço espesso em celofane, amplamente utilizado na
rotina para determinar quantitativamente o número de ovos por grama de fezes (OPG).
- Colocar a amostra fecal sobre papel absorvente.
- Comprimir a tela metálica (60 ou 80 malhas) ou de náilon (105 malhas) sobre as
fezes, fazendo com que parte passe através das malhas.
- Remover as fezes que passam através das malhas e transferi-las para o orifício de um
cartão retangular (3 cm x 4 cm x 1,37 mm, com orifício central de 6 mm de diâmetro),
colocado sobre uma lâmina de microscópica.
- Depois de preencher o orifício do cartão com a amostra, removê-lo com cuidado,
deixando as fezes na lâmina.
- Cobrir as fezes com uma lamínula de celofane, invertendo e pressionando a lâmina
sobre o papel absorvente.
- Deixar a preparação em repouso para clarificação da amostra durante 30 minutos a 34
- 40ºC ou à temperatura ambiente por 1 a 2 horas.
- Examinar a preparação no microscópio óptico em aumento de 100 x.
- Contar o número de ovos.
- O número de ovos presentes na preparação multiplicado pelo fator 23 dará o número
de ovos por grama (OPG) de fezes.

SOLUÇÃO AQUOSA GLICERINADA DE VERDE MALAQUITA


- solução aquosa de verde malaquita a 3% (m/v) ------------------------------------------- 1 mL
- solução aquosa de fenol a 6% (m/v) -------------------------------------------------------- 100 mL
- glicerina -------------------------------------------------------------------------------------------- 100 mL

MÉTODO PARA ISOLAMENTO DE LARVAS DE NEMATÓIDEOS


(MÉTODO DE RUGAI, MATTOS & BRISOLA, 1954)
Este método fundamenta-se no termo e hidrotropismo positivo das larvas de
nematódeos, indicado para pesquisa de larvas de Strongyloides stercoralis.

- Estender, sobre a abertura de um recipiente contendo fezes, gaze dobrada quatro


vezes, e repuxar as extremidades para trás.
- Encher, com aproximadamente 70 a 100 mL de água corrente aquecida a 40 - 50 ºC,
um cálice cônico de sedimentação (capacidade 125 mL).
- Transferir o recipiente com as fezes para o interior do cálice de sedimentação, de
modo que o líquido alcance toda a extensão da abertura do recipiente, cuidando para
não haver formação de bolhas de ar.
- Deixar em repouso durante 60 minutos.
- Colher o sedimento entre lâmina e lamínula no menor aumento do microscópio óptico,
ou em um vidro de relógio, com auxilio de uma lupa.

COPROTEST
- Princípio: Centrífugo-sedimentação.
- Finalidade: Pesquisa de ovos, cistos e larvas.
• Abra o frasco cuidado cuidadosamente para não derramar o conteúdo;
• Colher a amostra e colocar na cavidade do coletor;
• Agite o frasco vigorosamente por mais ou menos 2 minutos;
• Em um tubo graduado, colher 7 mL da amostra, acrescentando 1 gota de
detergente e 3 ml de acetato de etila comercial;
• Tampe o tubo, agite e centrifugue a 1.500 RPM/ 2 minutos;
• Despreze o sobrenadante com cuidado;
• Acrescente 1 gota de lugol e 1 gota de solução fisiológica ao sedimento;
• Ressuspenda o sedimento, colha 1 gota na lâmina e cubra com lamínula;
• Observar ao microscópio com aumentos de 10X e 40X.
PROCEDIMENTO DE ROTINA
MICROBIOLOGICA
MICROBIOLOGIA

Nos últimos 30 anos, a Microbiologia e Imunologia evoluíram


extraordinariamente como ciência multidisciplinares, em relação estreita com a Biologia
Molecular.
No campo da Microbiologia Geral, enormes progressos foram realizados com
referência à anatomia química e morfológica da célula bacteriana, à biossíntese da
macromolécula e à genética de m. o. Tudo isso contribui fundamentalmente à Genética
Moderna. (BIER, 1990).

OBJETIVOS

O objetivo dos estudos no setor de Microbiologia é demonstrar aos alunos


estagiários uma visão ampla das principais técnicas e métodos dentro de um
laboratório, com fins diagnósticos. Observa-se também uma padronização e
simplificação da metodologia utilizada na identificação desses microorganismos.

MEIOS DE CULTURA
Para o cultivo de bactérias podem ser utilizados meios líquidos, sólidos ou
semi-sólidos. Meios líquidos permitem o crescimento indiferenciado de todas as
bactérias contidas na amostra promovendo turvação do meio. Meios sólidos
possibilitam crescimento de amostras de bactérias puras. Sua consistência sólida é
devido à adição de ágar e o simi-sólido contém menor quantidade ágar e é utilizado
geralmente para verificar a motibilidade das bactérias.
• Meio sólido – 1.5% de agar
• Meio semi-sólido – 0.4% de agar

Classificação
- Meio Diferencial – Permitem a distinção entre 2 ou mais tipos de bactérias pela
simples observação das características apresentadas pelas colônias que nele se
desenvolvem. Ex: Ágar Sangue; Meio de MacConkey.
- Meio Seletivo – Meios que contêm substancia capazes de inibir o crescimento de
determinados grupos de bactérias sem restringir o crescimento de outras. Ex: Ágar
Sangue; Meio de MacConkey.
- Meio de Enriquecimento – Rico em nutrientes que proporcionam o aumento do
número de bactérias.

Preparo de Meios

Forma preparados meios de cultura, para utilização durante o estagio, seguindo


a formula indicada pelo fabricante de cada meio.

Técnicas de Semeadura

- Esgotamento – Consiste em espalhar o material biológico com auxilio da alça, fazendo


estrias próximos até o esgotamento do material, para que haja um bom isolamento das
bactérias.
- Atapetamento – Geralmente utilizado para contagem de bactérias de amostra urinaria,
onde utiliza-se a alça da Dirigalsky.
- Espalhamento – Utilizado para espalhar todo o material biológico por toda a placa,
com auxílio da alça de platina em, pelo menos, 3 sentidos.
- Semeadura em tubos – Podem apresentar-se em forma de ágar inclinado, líquidos ou
semi-sólidos. Para a inoculação, usa-se a alça bacteriológica e na transferência de
cultura pura e placas para tubos usa-se agulha bacteriológica.

Coloração de GRAM

A maioria das amostras colhidas, quando se suspeita de infecção bacteriana,


deve se aplacada a lâminas de vidro, coradas pelo Gram e examinadas ao microscópio.
- A lâmina é fixada e tratada com solução de cristal violeta 1 a 2 minutos;
- Lavar com água e escorrer;
- Descorar rapidamente pelo álcool a 95%;
- Lavar com água e escorrer;
- Cobrir com solução de fucsina, durante 30 segundos para contra – corar;
- Lavar com água, secar com papel de filtro, observar na objetiva de imersão (100x).

Diferenciação de Bactérias
Para bactérias Gram positivas faz-se a prova da catalase, onde reação positiva
indentifica Staphylococcus e a reação negativa identifica Streptococcus.

1) Identificação de Bacterias

- PROVA DA CATALASE – Os staphylococcus produzem a enzima catalase


(peroxidase) que é capaz de decompor o peróxido de hidrogênio (H2O2) em O2O.
Execução: preparar um suspensão do crescimento bacteriano em H 2O destilada
na superfície da lâmina e adicionar 1 a 2 gotas de H2O2 a 3%. O aparecimento de
bolhas indica reação positiva. O aparecimento de bolhas indica reação positiva.
Para a diferenciação entre as espécies de Staphylococcus, é necessário
proceder às provas bioquímicas, a partir de amostra isolada.
- PROCA DA COAGULASE – A coagulase ligada esta localizada na superfície da
parede células e reage com caldeias α e β do fibrinogênio plasmático, provocando a
formação de coágulo visível, resultando em uma reação positiva.
Coagulase + - S. aureus
Coagulase - - S. epidemeridis ou S. saprophyticus

- PROVA DA DNASE – Determina a atividade da enzima desoxirribonuclease produzida


por amostras de S. aureus.
Execução: Semeadura da amostra em ágar DNAase. Incubar a placa a 35 –
37ºC / 18-24 hs. Cobrir a placa com solução de ácido clorídrico a 1N. Resultado positivo
se dá pela formação de um halo ao redor da colônias e resultado negativo evidencia
truvação uniforme em toda superfície do meio.

- TESTE DE SENSIBILIDADE À NOVOBIOCINA – Diferencia os staphylococcus


coagulase negativos de importância médica.

Execução: Semeia-se o microorganismo em ágar sangue e aplica-se disco de


Novobiocina. Incuubar a placa a 35 – 37º C / 18-24 hs. Formando-se um halo de
sensibilidade caracteriza-se presença de S. epidermidis.

ESQUEMA:
Catalase + - Staphylococcus
Catalase - - Staphylococcus

S. aureus S. epidermidis S. saprophyticus


Coagulase + - -
DNAase + - -
Sensibilidade à Sensível Sensível Resistente
Novobiocina
2) Identificação de Streptococcus
A designação mais utilizada tem por base os tipos de hemólise em placas de
ágar sangue:
- Hemólise total - β -hemolítico
- Hemólise parcial – α –hemolítico
- Ausência de hemólise – Y – hemolítico

As colônias podem ser repicadas para caldo HBI por 6 a 8 horas ou retiradas do
crescimento inicial em ágar sangue para realização das provas de identificação.

- TESTE CAMP – Principio dado pela atividade hemolítica do staphylococcus


produtor de beta lisina em eritrócito é fundamentada por um fator extracelular, de
constituição protéica, produzida pelo estrephytococcus de grupo “B”, chamado fator
CAMP. Uma reação beta-hemolítica é acentuada quando estes m.o. reagem
sinergicamente, em placas de ágar sangue.
Execução: Semeia-se uma estria de Staphylococcus aureus produtor de beta
lisina no centro de uma placa de ágar sangue feita com sangue de carneiro. Estria,
perpendicularmente, o strephytococcus a ser identificado, de modo que as estrias não
se toquem. Incubar a placa a 37ºC/ 24hs. Um alargamento da zona do lise no ponto de
interseção entre as duas estrias, que toma a forma de ponta de lança, evidencia-se
prova positiva para S. agalactiae, strephytococcus β – Hemolítico do grupo “B”.

- PROVA DA BILE ESCULINA – Os strephylococcus do grupo “D” em meio com


bile na concentração de 4%, hidrolisam a esculina, originando a esculitina a qual reage
com citrato férrico contido no meio, provocando o escurecimento do meio em torno das
colônias.
Execução: Semeia-se 2 a 3 colônias, da placa de ágar sangue, em tubo com
ágar bile esculina esculinado. Incubar a placa a 37º C/24hs. O escurecimento em torno
do crescimento evidencia-se prova positiva.
- PROVA DE TOLERÂNCIA A 6.5% DE NACL – Os strephytococcus do grupo
“D” em meio contendo 6.5% de NaCl e modificam sua coloração são classificados como
“enterococos” , os negativos são os “não enterococos”.
Execução: Inocula-se 2 a 3 colonias suspeitas em caldo HBI contendo 6.5% de
NaCl, 1% de glicose e um sistema indicador de pH. Incubar a placa a 37ºC/24hs. O
crescimento com conseqüente mudança de coloração do meio indica se tratar de
amostras E. faecalis.

- TETE BA BACITRACINA – Em concentração de 0.04 mg, a bacitracina age


seletivamente sobre os strephytococcus β – hemolítico do grupo “A” de Lacenfield
inibindo a síntese do peptidoglicano e alterando a seletividade da membrana celular.
Com isso, impedindo que as bactérias se desenvolvam na região do meio de cultivo
onde houve a difusão do sal, acarretando a formação de um halo de inibição.
Execução: Inocular na superfície de uma placa de ágar sangue colônias
suspeitas, vindas do caldo HBI ou da placa incial. Após secagem, aplica-se o disco de
bacitracina no centro da área semeada, pressionando levemente para conferiir
aderência. Incubar a placa a 37ºC/24hs. Resultado positivo para S. pyogens do grupo
“A” é conferido com o aparecimento de um halo de inibição.
- TESTE DA OPTOQUINA – A optoquina (cloridrato de estilhidrocupreína) altera
seletivamente a membrana celular do S. pneuminiae, servindo como os
estrephytococcus ao grupo “viridans”.
Execução: Semear de 2 a 3 colonias da bactérias suspeita em plac de ágar
sangue. Após secagem, aplica-se o disco de optoquina, na concentração de mg no
centro da área semeada, pressionando levemente para conferir aderência. Incubar a
placa a 37º C/24Hs, em jarra com vela. Crescimento de halo de inibição de 14 a 18 mm
indica sensibildade caracterisitca de S. pneumoniae. Em caso de resitencia à optoquina
com bile sculina negativa, trata-se de S. viridans.

Enterobacteias (bastonetes Gram negativos)


Os bastonetes Gram negativos encontrados em laboratórios são classificados
em 2 grupos:
- Produção de ácidos a partir da oxidação da glicose.
Principais gêneros: Pseudomonas, Alcaligenes e Acinetobacter.
- Produção de ácidos a partir da fermentação da glicose.
Principais genereos: família enterobacteriaceae (oxidase negativos) e os não
pertencentes a essa família (oxidase positivos).

PROVAS BIOQUÍMICAS
- URÉIA
Determina a capacidade de um m. o. em degradar enzimaticamente moléculas
de uréia do meio, formando carbonato de amônia. A hidrólise é catalisada de forma
especifica pela uréase produzindo 2 moléculas de amônia. O vermelho de fenol que
funciona como indicador, torna o meio rosa-avermelhado quando a reação for positiva.

- MILI
a) LISINA – Baseia-se na produção de lisina descarboxilase e liberação de gás
sulfídrico. A reação positiva é favorecida com o aparecimento de cor púrpura, que
coincide com a cor inicial do meio. Reação negativa é caracterizada por uma coloração
amarelada. A produção de H2S é evidenciada pelo aparecimento de um precipitado
negro.
b) MOTILIDADE – Caracterizada pelo aparecimento de turvação uniforme em
toda extensão do meio. Bactérias imóveis crescem apenas no local da inoculação.
c) INDOL – É evidenciado após degradação do aminoácido triptofano pelas
triptofanases. A positividade é conferida pela adição do Reativo de Kovacs, onde se
forma um anel vermelho na camada superficial do meio.

- CITRATO
Baseia-se na utilização do citrato como única fonte de carbono. Utiliza-se o
bromotimol como indicador de pH, que oferece coloração amarela em meio ácido e azul
em meio alcalino.
- TSI
Determina a habilidade de um m. o. em utilizar carboidratos específicos
existentes no meio básico com ou sem produção de gás ou H2S.
a) FERMENTAÇÃO DA GLICOSE – Observa-se no fundo do tubo a
degradação protéica que é insuficiente para reverter o pH ácido estabelecido, mantendo
o meio amarelo.
b) FERMENTAÇÃO DA LACTOSE E SACAROSE – o tubo permanece amarelo
no ápice do meio devido a alta concentração de ácidos produzidos.
c) PRODUÇÃO DE GÁS – Evidencia-se o aparecimento de bolhas ou
rachaduras no meio.
d) PRODUÇÃO DE H2S- Reação com sulfato ferroso contido no meio,
resultando em um precipitado negro.

- FENILALANINA
Para se fazer a leitura, deve-se adicionar 4 gotas de cloreto férrico que reage
com o ácido fenilpirúvico. Se positivo, promove coloração verde. Se negativo, promove
coloração amarela.

- VM
Para se fazer a leitura, acrescenta-se 5 gotas de vermelho de metila, eu por ser
um indicador ácido, indica o grau de acidez por modificação de cor. Reação positiva
dada por cor vermelha (pH = 4.5) e negativa com cor amarela (pH= 6.0).

- VP
Evidencia a capacidade da bactéria em produzir compostos neutros, a partir da
fermentação da glicose.

UROCULTURA
- Coleta – Faz-se assepsia no local antes da coleta. Coleta-se o segundo jato
usando frasco estéril.
- Conservação – Manter o material na geladeira pra inibir o crescimento
bacteriano.

• Meios de Cultura
a) CLED – Meio não seletivo, diferencial para fermentação da lactose, formando
colônias azuis quando lactose negativa.
Utiliza-se como técnica de semeadura o método da alça calibrada de 0.01uL ou
0.001 uL, para que se possa fazer a contagem das colonias e posteriormente
diagnosticar se há infecção ou não.
- abaixo de 10.000 ufc/mL – contaminação
- entre 10.000 e 100.000 ufc/mL – suspeita
- acima 100.000 ufc/mL – infecção

TESTE DE SENSIBILIDADE À ANTIMICROBIANOS


I – Preparo do Inoculo
Com o auxilio da alça, toca-se em uma colônia tranferindo-as pra um tubo de
solução salina ou em caldo BHI para novo crescimento e depois em solução salina.
Posteriormente compara essa turvação com a escala 0.5 de Mac Farland.

II – Semeadura
Umedecer o “swab” estéril no inoculo aferido e aplicá-loo em varias direções na
placa com meio Mueller – Hinton, obtendo cresciemnto uniforme.

III – Técnica
Colocar os discos, com o auxilio de uma pinça, pressioná-los levemente contra
a superfície do meio, mantendo uma distancia de 20 mm da boda e de 30 mm entre
eles. Incubar a placa em posição invertida a 37ºC/ 18hs. A leitura deve ser feita com
halômetro ou régua através do fundo da placa.
CULTURA DE SECREÇÃO VAGINAL E URETRAL
A coleta da secreção vaginal e da uretral é feita no laboratório, se utilizado de
cureta (para a vaginal) ou alça de platina (para a uretral).
Uma parte do material é colocado em 1 mL de solução salina estéril, e outra
parte é olocada na forma de esfregaço na região central de uma lamina para
microscópio. Este material, em lâmina, é observado em microscópio óptico ao aumento
de 1000 vezes com óleo de imersão e descrito:
• bactéria (morfologia e Gram);
• leveduras;
• parasitas;
• muco;
• células epiteliais;
• flora aplobionte.

Para essa observação utiliza-se a Coloração de Gram, que é realizada nesse


esfregaço após o mesmo ter sido fixado passando-se lâmina 3 vezes por sobre a
chama do bico de busen. Feito isso, em um suporte próprio, cobre-se a lâmina com
uma camada de corante cristal violeta por aproximadamente 1 minuto; após, recobre-se
a lâmina com uma nova camada de lugol a 5% por mais 1 minuto. Em seguida
despreza-se o material que esta sobre a lâmina e recobre-se a lâmina com álcool
acetona, formando uma camada por sobre a lâmina, por 1 minuto. Após, enxaguar em
água corrente. Em seguida, recobre-se, novamente, a lâmina com fucsina para a
Coloração de Gram por mais 1 minuto. A seguir, lavar em água corrente, colocar em
suporte próprio para escorrer e secar.
Após feita a observação e determinados os parâmetros, seguir o esquema
descrito abaixo:

ESTREPTOCOCOS – NÃO BETAHEMOLITICO

Caldo
glicosado

gram
Calatase (-)

estreptococo
(+)
estafilococo Alfa ou gama
Verificar registro de
hemólise no ág ar- hemolitico
sangue primario

Verificar origem do
material para originar
provas

(R) à optoquina
bile-esculina (-)
Streptococcus sp

(S) à optoquina bile – Bile-escilina (+)


solúvel antibiograma
S. pneumoniase grupo D (S. faecalis e outros)

(R) a 6,5% NaCI (S) a 6,5% NaCI


CULTURA DE FEZES (COPROCULTURA)
(R) à penicilia (S) à penicilia

Para a realização desse exame, as fezes são recolhias em recipiente próprio e


estéril e entregues ao laboratório num período Maximo de 2 horas após a coleta.
No setor, com uma alça de platina, é coletado uma porção das fezes e colocada
em caldo selenito, que vai à estufa a 37º C por um período de 24 horas. Após este
período, com uma alça de platina, recolhe-se parte desse caldo e semeia-se em estufas
a 37ºC por 24 horas. Havendo crescimento, faz-se o Gram e as provas bioquímicas
pertinentes conforme o esquema abaixo:

FEZES

CALDO SELENITO

BEM SS

GRAM

COCCOS BACILOS

NEG POS NEG POS

Tubo Rugai Sem importancia Tubo Rugai Calase


clínica,
TSI provavelmente TSI VM, VP
Mili contaminação Mili Plasmaco
Halo de
Citrto Citrato hemólise
Indol Indol Nitrito
TSI

• Citrato + = meio torna-se azul


• TSI – H2 S + = meio torna-se negro;
- Gás ++ aparecimento de bolhas no meio;
- Lactose += A/A ou A/K K= alcalina=vermelho
(+)= K/K A= ácido=amarelo

• Mili – motilidade ++ observa-se o caminho da bactéria no local da picada;


- lisina += o meio torna-se amarelo;
- indol += o reativo de Kovacs torna-se vermelho
CULTURA DE ESCARRO

Para a cultura do escarro, podemos encontrar apenas solicitações de


bacterioscopia como, por exemplo, pesquisa de BK; mas quando a solicitação for de
cultura de escarro, devemos proceder como na cultura de secreções (exceto a coleta);
Nas pesquisa de BK fazemos um esfregaço, na região central de uma lâmina,
de porção do escarro rica em material sanguinolento (hemoptíase). Após secar esse
esfregaço com a lâmina por sobre o a chama do bico de bunsen por 3 vezes,
realizamos a coloração de ziehl – Neelsen que se rezume em: cobrir o esfregaço com
uma camada de corante fucsina de ziehl e aquecer 5 minutos esta lâmina em chama
do bico de bunsen sem deixar ferver o corante )retirar frequentemente da chama. Após
isso, cobre-se a lâmina com álcool ácido por aproximadamente 1 minuto; enxaguar em
água corrente e, depois, cobrir a lâmina com azul de metileno por aproximadamente 1
minuto. Lavar, novamente, em água corrente. Observar em microscópio óptico em
aumento de 1000 vezes, utilizando óleo de imersão.

PESQUISA DE FUNGOS

Após coletar parte do material através de descamação com o bisturi ou coletar


através de biópsia parte do material obtido, colocar em uma lâmina, cobrir KOH a 10%
e sobre-por uma lamínula . Deixar por 10 minutos e observar ao microscópio óptico no
aumento de 100 a 400 vezes:
• Hifas;
• Micélio reprodutor;
• Micélio vegetativo.
Em seguida, semia-se em ágar sabouraud por 48 a72 horas e, após o
crescimentom observam-se morfologia, textura da colônia e fungos. Após isso,
para a identificação, realização, realiza-se o auxograma e o zimograma conforme
o esquema abaixo:

OUTROS MATERIAIS: SECREÇÃO DE LESÕES, LÍQUIDOS SINOVIAIS E


PLEURAIS

Para estes casos a coleta é feita pelo médico que encainha os materiais sólidos
em saliva e os líquidos em recipiente estéril. Com a chegada da matéria, faz-se uma
lâmina para Gram e segue-se o esquema para secreções vaginal e uretral.
Em todos os exames acima descritos (exceto as pesquisas de fungos e as
bacteroscopias), devemos realizar o antibiograma feito em uma placa grande ágar
Nueller Hinton com 11 discos de antimicrobianos, padronizados a critério do diretor
clínico do hospital. Estes discos devem estar dispostos na placa de forma a
apresentarem uma distância maior que 2 cm entre os seus centros e distarem 1 cm da
borda de vidro da placa de petri. Efetuar a leitura dos balos de inibição de crescimento
utilizando um halômetro e tabela própria do fabricante dos discos, observando as faixas
de I (intermediária), S (sensível) e R (resistente).

PREPARO DA SUSPENSÃO DE HEMÁCIAS LAVADAS (5%)

1. Coloque em um tubo de ensaio (12 x 75) previamente identificado 0,5 mL de


sangue total
2. Encha o tubo com solução salina (0,9%) até 1 cm da borda do tubo.
3. Centrifugue durante 30 seg/3400 RPM.
4. Esvazie o tubo por inversão, homogenize o sedimento de hemácias, e repita
conforme os itens 2 e 3 por mais duas vezes
5. Após a terceira lavagem, retire completamente o sobrenadante
6. Em outro tubo de ensaio coloque 3 ml de solução salina (0,9%) e adicione 0,15
ml do concentrado de hemácias lavadas.
CLASSIFICAÇÃO DO GRUPO SANGUINEO ABO

A tipagem ABO dever ser realizado obrigatoriamente através de dois testes:


classificação direta e classificação reversa.
1. Classificação direta (TUBO): Identificação de aglutinógeos presentes na
membrana das hemácias, através de soros contendo anticorpos específicos:
Anti-A, ANTI-B e ANTI-AB;

TECNICA:
1.1 Prepare um suspensão de hemacias lavadas (5%) do sangue a ser classificado.
1.2 Identifique 3 tubos de ensaio: A, B e AB.
1.3 Coloque nos tubos, 1 gota dos soros reagentes: Anti-A, Anti_B e Anti-AB,
respectivamente;
1.4 Adicione a cada tubo, 1 gota da suspensão de hemácias lavadas (5%) a
classificar;
1.5 Homogenize e centrifugue 15 seg/3400 RPM
1.6 Proceda a leitura ressuspendendo o botão de hemácias delicadamente, sobre
um fundo iluminado (aglutinoscopio);

2. Classificação reversa (tubo): identificação de anticorpos presentes na amostra de


soro a ser testado, através da utilização de duas suspensões de hemácias
conhecidas: hemácias A1 e Hemácias B;

TECNICA:
2.1 Identifique 2 tubos de ensaio: HÁ e HB;
2.2 Coloque em cada tubo 2 gotas do soro a testar;
2.3 Adicione ao tubo HÁ, 1 gota de hemácias A1 e ao tubo HB, 1 gota de hemácias
B;
2.4 Homogenize e centrifugue 15 seg./3400 RPM;
2.5 Proceda leitura ressuspendendo o botão de hemácias delicadamente;

INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS DA CLASSIFICAÇÃO ABO

DIRETA REVERSA
ANTI A ANTI-B ANTI-AB ANTI-A1 H A1 HB HO GRUPO
0 0 0 0 +4 +4 0 O
+4 0 +4 + 0 +4 0 A1
0 +4 +4 0 +4 0 0 B
+4 +4 +4 + 0 0 0 AB

DISCREPÂNCIA
DIRETA REVERSA

ANTI A ANTI-B ANTI-AB ANTI-A1 H A1 HB HO GRUPO


+4 0 +4 0 0\+ +4 0 A*
+4 0 +4 + + +4 + A**
+4 +4 +4 0 0\+ 0 0 AB**
+4 +4 +4 + + + + AB**

A*\AB** PROVAVEL SUBGRUPO DE A


A**\AB** PROVAVEL ANTI-CORPO FRIO

NOTAS:
1. Nas determinações ABO de recém nascido não se realiza prova reversa;
2. Podem ocorrer discrepâncias entre as provas e reversa, neste caso deve-se
considerar a ocorrência de anticorpos frios, subgrupos ou erro técnico;
DETERMINAÇÃO DO FATOR Rh (D)

Na determinação Rh são utilizados os reagentes: soro reagente Anti-D e


controle e de Rh;
1. Prepare uma suspensão de hemácias lavadas (5%), do sangue a ser
classificado;
2. Identifique 2 tubos de ensaio: D e CTL;
3. Coloque em cada um dos tubos 2 gotas dos soros: Anti_D e controle de Rh;
4. Adicione a cada tubo, 1 gota de suspensão de hemácias lavadas (5%), a
classificar;
5. Homogenize e centrifugues 15 seg. 3400 RPM;
6. Proceda a leitura ressuspendendo o botão de hemácias delicadamente, sobre
um fundo iluminado (aglutinoscópio).

INTERPRETAÇÃO DO RESULTADO DA DETERMINAÇÃO Rh:

ANTI A CONTROLE Rh RESULTADO


+ 0 Rh POSITIVO
0 0 Rh NEGATIVO
+ + ***

*** Não deve ser considerado Rh positivo, provável sensibilização das hemácias por
auto-anticorpo. Realizar o teste com Anti-D Salino conforme recomendações técnica do
fabricante.
NOTAS:
1. Os resultados Rh negativos devem ser submetidos à pesquisa do antígeno “D” fraco.
Deve-se pesquisar em paralelo a presença dos antígenos: E e C, utilizando-se o soro
Anti- CDE.
PESQUISA DOS ANTIGENOS: “D” FRACO

1. Repita os procedimentos: 1.A 5. Da determinação do fator Rh.


2. Leve ao banho maria à 37º C\30 minutos;
3. Centrifugues durante 15 seg\3400 RPM;
4. Proceda leitura, ressuspendendo o botão de hemácias delicadamente, sobre
aglutinoscópio;
5. Encha o tubo de ensaio com solução salina (0,9%) ate 1 cm da borda do tubo;
6. Centrifugues durante 30 seg\3400 RPM;
7. Esvazie o tubo por inversão, e repita a operação conforme itens 5 e 6 por mais 2
vezes, escorrendo o sobrenadante em um pano;
8. Adicione a cada tubo, 2 gotas de soro reagente anti-globulina humana
poliespecifica;
9. Centrifugue durante 15 seg\ 3400 RPM
10. Proceda leitura, ressuspendendo o botão de hemácias delicadamente, sobre
aglutinoscópio.
PESQUISA DE ANTICORPOS IRREGULARES (P.A.I)
(COOMBS INDIRETO)

A pesquisa de anticorpos irregulares, demonstra anticorpos antieritrocitários


irregulares, livres no soro ou plasma de doadores e pacientes, que possam provocar
reações pós-transfusionais. Deve ser realizada também no soro de gestantes, como
forma de prevenção da doença hemolítica do recém nascido.
A pesquisa deve ser realizada com soro fresco (não inativo).
São utilizadas suspensões de hemácias de triagem do grupo sanguíneo “O”,
previamente fenotipadas e que apresentam a maioria dos antígenos de importância na
clínica transfusional.

INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS DA P.A.I

1. A positividade em qualquer tubo, em qualquer fase do teste indica provável


presença de anticorpo (s) irregulares (es);
2. Sempre que a pesquisa de anticorpos apresentar positividade, o (s) anticorpo )s)
deve (m) ser identificados (s), atraves da utilização de um painel de hemácias
fenotipadas.
TESTE DE COMPATIBILIDADE
(Prova cruzada maior)

A prova cruzada maior tem a finalidade de prevenir reações transfusionais e


garantir o aproveitamento máximo das transfusões de concentrados de hemácias, por
demonstrar a presença de anticorpos capazes de destruir as hemácias do doador
proposto.
O teste é realizado in vitro, colocando-se soro do receptor em contato com uma
suspensão de hemácias do doador, proporcionando condições adequadas de
reatividade para todos os anticorpos clinicamente significantes.
Deve-se utilizar amostra de soro fresco (não inativo), tendo a amostra validade
de 48 horas a contar do horário da coleta.
Vencido o prazo de validade, esta amostra não deve ser mais utilizada nos
testes de compatibilidade, porem armazena-se a amostra pelo prazo de sete dias.
TESTE DE COMPATIBILIDADE (PROVA CRUZADA MAIOR )
TECNICA: ALBUMINA BOVINA 22%

1ª FASE
1. Prepare suspensões de hemácias lavadas (5%): do concentrado de hemacais a
ser transfundido e do paciente (recepto);
2. Identifique 2 tubos: Prova cruzada e AC (Auto controle);
3. Coloque em cada tubo 2 gotas do soro do paciente (receptor);
4. Adicione 1 gota da suspensão de hemácias do concentrado a ser transfundido
ao tubo de prova cruzada e 1 gota da suspensão de hemácias do paciente ao
tubo AC;
5. Homogenize e centrifugue durante 15 seg\3400 RPM;
6. Proceda a leitura, ressuspendendo o botão de hemácias delicadamente sobre
aglutinoscópio e anote os resultados.
2º FASE

1. Adicione a cada tubo 2 gotas de albumina bovina 22%;


2. Homogenize e centrifugue 15 seg\3400 RPM;
3. Proceda leitura e anote os resultados.

3º FASE

1. Incube os tubos: prova cruzada e AC, em banho maria 37ºC\30 min;


2. Após incubação, centrifugue os tubos 15 seg.\3400 RPM;
3. Proceda leitura e anote os resultados.

4º FASE

1. Encha os tubos com solução salina (0,9%) ate 1 cm da borda;


2. Centrifuge os tubos durante 30 seg\3400 RPM;
3. Esvazie os tubos por inversão e repita as operações dos itens da 4º fase (1 e 2)
por mais 2 vezes, escorrendo o sobrenadante em um pano;
4. Adicione a cada tubo 2 gotas do soro reagente antiglobulina humana
poliespecifica.
5. Homogenize e centrifugue 15 seg.\3400 RPM;
6. Proceda a leitura e anote os resultados;
7. Adicione 1 gota de suspensão de hemácias – controle de COOMBS, centrifugue
e proceda leitura.
INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS DO TESTE DE COMPATIBILIDADE

1. A positividade apenas no tubo de prova cruzada em qualquer fase do teste indica


presença de anticorpos (s) irregular (es);
2. A positividade no tubo AC (Auto controle) indica provável presença de auto
anticorpo.
3. Sempre que a prova cruzada apresentar incompatibilidade, ou seja, apresentar
positividade, o (s) anticorpo (s) deve (m) ser identificado (s);
4. Suspensão de hemácias – controle de COOMBS deve apresentar aglutinação,
caso contrario a prova de compatibilidade deve ser invalidada.

OBS: Não confundir a positividade do teste controle de COOMBS, com a última fase
da prova de comaptibilidade.
TESTE DE COOMBS DIRETO

O teste de COOMBS direto demonstra hemácias sensibilizadas por anticorpos


ou complemento, é utilizado no estudo de:
• Anemia hemolítica auto-imune, doenças hemolítica do recém nascido e reação
hemolítica transfusional.

Procedimento técnico:
1. Prepare uma suspensão de hemácias lavadas (5%), do sangue a ser testado;
2. identifique um tubo de hemólise CD;
3. Coloque no tubo 1 gota da suspensão de hemácias (5%);
4. Adicione a este tubo 2 gotas dos soro reagente anti-globulina humana
poliespecifica;
5. Centrifugue o tubo durante 15 seg\3400 RPM;
6. Proceda leitura, ressuspendendo o botão de hemácias do fundo do tubo
delicadamente, anote os resultados.

INTERPRETAÇÃO

A ocorrência de aglutinação, determina a positividade do teste.