RECUENTO CELULAR Y TASA DE CRECIMIENTO EN

CULTIVOS DE Isochrysis galvana y Chaetocerus gracilis

I.

INTRODUCCION

Actualmente las microalgas son utilizadas como alimentos vivos (microalgas y

nauplios de Artemia), por los componentes nutricionales que aportan a la
acuidcultura como por ejemplo: para las dietas de los primeros estadios
larvarios de peneidos.
El nmero de especies de microalgas que se utilizan como alimento vivo para
fines de acuicultura es muy limitado, y Duerr et al. (1998) reportaron que los
gneros usados con mayor frecuencia son las diatomeas Chaetoceros y
Thalassiosira, la haptofita Isochrysis, la eustigmatofita Nannochloropss y la
prasinofita Tetraselmis. Malagrino et al. (1999),
Las cepas de microalgas se mantienen bajo condiciones controladas,
generalmente con iluminacin constante y temperatura controlada con
acondicionadores de aire.
En condiciones de laboratorio se utiliza aeracin constante, frecuentemente
con adicin de CO2, los medios se preparan con reactivos de grado analtico, la
temperatura es controlada (alrededor de 20-22 C) y la iluminacin es
constante con lmparas fluorescentes.
Para un buen manejo de cultivo de microalgas se debe realizar un recuentro
constante de la densidad de la microalgas en el medio de cultivo. Uno de los
mtodos para determinar la densidad celular empleado en muchos laboratorios
es con un Hematocitometro o cmara Neubauer y un microscopio. Una
cmara de conteo celular es un dispositivo en el que se coloca una muestra de
la suspensin a medir, el cual presenta seales que determinan un volumen
conocido, por lo que al contar bajo el microscopio el nmero de partculas
presentes en ese volumen se puede determinar la densidad de partculas en la
suspensin de origen.

II. OBJETIVOS
Objetivo principal
- Realizar el recuento celular en cultivos de isochrysis galvana y
chaetocerus gracilis y determinar su tasa de crecimiento

Objetivos secundarios:
- Reconocer especies de microalgas: Isochrysis galvana y Chaetocerus
gracilis
- Realizar un recuentro celular de cultivos de Isochrysis galvana y
Chaetocerus gracilis.
- Aprender el manejo de la cmara de Neubauer.
- Determinar la concentracin celular (cel/ml) en un medio de cultivo
microalgal y parmetro poblacionales (tasa de crecimiento).
- Elaborar una curva de crecimiento poblacional de un cultivo de
microalgas.

III.

MATERIALES Y METODOS

El ensayo se llevo a cabo en el Laboratorio de Acuicultura de la Facultad de

Ciencias Biolgicas de la Universidad Ricardo Palma.
Para el estudio se utilizaron las microalgas Isochrysis galvana y Chaetoceros
gracilis, provenientes del Centro de Investigaciones Acucolas "Alexander von
Humboldt" del Instituto del Mar del Per (IMARPE).
Se preparo el medio f/2 de Guillard y Ryther (1962) con agua de mar
previamente filtrada en un erlenmyer de 500 ml. Se tomo un inoculo de cada
microalga y se cultivo en el medio Guillard, cada una y tapar con papel platino.
Luego se expusieron a un fotoperiodo de 16 horas diarias de luz, mediante 3
tubos fluorescentes. Los cultivos se agitaron y homogenizaron antes y despus
de cada conteo para, mantener el medio oxigenado, ya que los cultivos no
contaban con un aireador.
El conteo celular se realizo por un periodo de 7 das, empezando un da
despus de haber realizado el cultivo microalgal. El conteo se realiz mediante
una cmara de neubauer con un aumento de 400X , se utiliz un microscopio
marca Nikon. Para el caso de I. galbana, se extrajo una del medio de cultivo y
se aadi lugol, para darle contraste y poder fijar las microalgas ya que son
mviles, tomar una gota de la alcuota y traspasarla a la cmara de neubauer.
En el caso de C. gracilis, se tomo una alcuota del medio algar, y con un gotero
traspaso al cmara de neubauer.
Se utilizo la siguiente formula para obtener la concentracin celular al
momento del conteo celular:
Si se tomo los cuadros de 1mm
C= Nx104xdil
Donde:
C= cel/ml

N=promedio de clulas presentes en 1 mm2

dil= factor de dilucin
104= factor de conversin de 0.1 ul a 1ml.
Si se tomo el cuadro central, considerando solo los cuadros menores:
C= ( N/4x10-6 ). Dil
Donde:
C= cel/ml
N=promedio de clulas entre los 5 cuadrados del cuadro central.
dil= factor de dilucin
4x10-6 = corresponde al volumen de la muestra expresada en ml sobre el area
de los cuadrados pequeos el cual equivale a 0.0004 ul.
La ecuacin de crecimiento o tasa de crecimiento:
2= ( ln(x2/x1) / ln2)/(t2-t1)
Donde:
X= concentracin de la biomasa(cel/ml)
T= tiempo en das.
Las curvas de crecimiento se realiz con el software Simfit.

IV.

RESULTADOS

El conteo celular realizado en cultivos de Isochrysis galbana y en el cultivo de

Chaetoceros gracilis
se obtuvieron los siguientes resultados: Isochrysis
galabana, con una concentracin celular de: 5.97 x 10 5; 1.27 x106 ; 2.93x 106 ;
2.82 x 106; 2.70 x 106 ; 2.07 x 106 ; 2.03x 106 cel/ ml, en el 1,2,3,4,5,6 y 7 das
correspondiente. Chaetoceros gracilis, se obtuvo: 2.42 x 105 ; 4.65 x 105 ; 3.83
x 105 ; 2.55 x 105 ; 1.27 x 105 ; 1.50 x 105 ; 1.40 x 105 cel/ml, en el 1,2,3,4,5,6 y
7 das correspondiente. (tabla 1) Estos resultados se ilustran en las graficas 1
y 3 para cada microalga.
Grafica 1: Concentracin celular de Isochrysis galbana
celular de Chaetoceros gracilis

Grafica 2: Concentracin

La densidad de individuos en el cultivo de Isochrysis galabana y Chaetocerus

gracilis present una tasa de crecimiento (tabla 2) diferente entre ambas
demostrndose en las curvas de crecimiento de I. galvana (grafica 3) y C.
gracilis (grafica 4).

Grafica 3. Curva de Crecimiento de I. galvana

La curva de crecimiento de I. galvana, presento un crecimiento poblacional en

S (sigmoideo o logistico). La curva representa que densidad poblacional
aumentaba hasta el 4to d (fase exponencial); entre los 3 dias restantes se
observa el crecimiento celular se detiene (fase estacionaria).
Grafica 4. Curva de Crecimiento C. gracilis

La curva de crecimiento de C. gracilis, present una curva de crecimiento

poblacional anmalo, interpretndose en l una fase de muerte. Durante los
dos primeros das se mantuvo la densidad celular estable pero en los das
restantes se noto una considerable reduccin poblacional, mostrando una fase
de muerte.

V. DISCUSIONES
El cultivo de Isochrysis galbana presento un crecimiento poblacional en S,
sigmoideo, quedndose en la fase exponencial. Esto se debe ante la presencia
de factores limitantes para su crecimiento poblacional. Estos factores pueden
ser por agotamiento de recursos alimenticios en el medio por la densidad
poblacional.
En cambio en Chaetoceros gracilis no se observ esta caracterstica,
posiblemente por que encontramos protozoarios, al tercer da de conteo, los
cuales estaban produciendo un stress por la obtencin de nutrientes, por la
competencia realizada a las microalgas. Segn la curva de crecimiento (grafico
4) esta poblacin celular se encuentra en fase de muerte.
En
C. gracilis la densidad celular fue baja comparada con los trabajo
conseguidos por Gonzales B. y col (1999) que obtuvieron una densidad de 2.9
106 clml-1. Con respecto a Isochrysis galbana, su densidad celular mxima
estuvo entre los estndares que realizo Lpez E. y col (2004) donde obtuvieron
1.0 a 2.0 x 106 clml-1.
Tambin hubo una notable diferencia entre las densidades mximas y las tasas
de crecimiento entre I. galbana y C. gracilis, esto se debe posiblemente a la

competencia realizada por los protozoarios encontrados en el medio de

Chaetoceros gracilis.
VI.

CONCLUSIONES

VII.

La densidad celular mxima de Isochrysis galvana se obtiene al tercer

da de empezar el ensayo.
La densidad celular mxima de Chaetoceros gracilis se obtiene al
segundo da de empezar el ensayo.
L a baja en el crecimiento celular de Chaetoceros gracilis, se debe a la
competencia realizada por los protozoarios encontrados en el medio.

RECOMENDACIONES

Una de las dificultades encontradas para el presente estudio, es la falta de un

ambiente con mejores niveles de asepsia, para realizar el cultivo, pues el
laboratorio carece de algunos instrumentos para el caso (cmara de flujo
laminar).
Es recomendable poner ms nfasis en la asepsia al momento de realizar el
cultivo y posteriormente los conteos celulares, adems de implementar un
sistema de aireacin en los medios de cultivo.

VIII.

REFERENCIA BIBLIOGRAFICA

Gonzlez, B. y col (1999) Evaluacin de medios nutritivos para el

crecimiento de tres microalgas marinas de uso comn en acuicultura.
Fonacit. Venezuela pp 75-84
Lpez E. y col (2004) Produccin y Composicin De Microalgas En
Laboratorios Comerciales del Noroeste De Mxico Universidad de
sonora. Mexico pp 6.

ANEXOS:
TABLA 1. Concentracin celular de Isochrysis galvana y Chaetoceros
gracilis
Conteo celular (cel/ml)
Dia 1 Dia 2 Dia 3
Dia 4

Dia 5

Dia 6

Dia 7

Isochrysis
galbana
Chaetoceros
gracillis

5.97E+
05
2.42E+
05

1.27E+
06
4.65E+
05

2.93E+
06
3.83E+
05

2.82E+
06
2.55E+
05

2.70E+
06
1.27E+
05

2.07E+
06
1.50E+
05

2.03E+
06
1.40E+
05

TABLA 2: Tasa de crecimiento de I. galbana y C. gracilis

Tasa de Crecimiento ( 2)
I. galbana
C. gracillis

A
-1.09
-0.94

B
-1.21
0.028

C
0.06
0.59

D
0.06
1

E
0.38
-0.24

F
0.03
0.1

A, B,C,D,E,F son los intervalos de tiempo dentro de los 7 das recuentro celular.