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2015
TRABAJO PRACTICO N 3
CRECIMIENTO BACTERIANO Y
EFECTO DE LOS ANTIBITICOS
N/N0 = 2n
Por otro lado, el nmero de generaciones se puede calcular fcilmente teniendo en cuenta el
tiempo transcurrido y conociendo el tiempo medio de generacin (g)
n = (t-t0)/g
Sustituyendo esta expresin en la frmula anterior tenemos:
N/N0 = 2 (t-t0) / g
Aplicando logaritmos neperianos obtenemos que
ln (N/N0)= [(t-t0)/g ] ln2
Ahora bien, como estamos ante un crecimiento balanceado, las dos expresiones matemticas
que hemos deducido, basadas en la masa o en nmero de individuos son equivalentes, por lo
tanto,
ln (M/M0) = ln (N/N0)
= ln (M/M0) / (t-t0) = [(t-t0)/g ln 2] / (t-t0)
Simplificando el trmino (t-t0) en la expresin anterior:
= ln 2 / g = 0.693/g (expresado en h-1 o min-1)
Esta es la expresin matemtica del coeficiente del crecimiento balanceado, en funcin del
tiempo medio de generacin (g) en condiciones de crecimiento exponencial.
En un medio ideal, sin limitacin de nutrientes, este coeficiente es = mx, o sea, el mximo
valor posible del coeficiente para esa cepa en ese medio. Es decir, es un crecimiento
balanceado no restringido.
En un medio donde exista algn nutriente limitante (o sea, cuya concentracin est por debajo
del lmite de eficiencia de las permeasas), el crecimiento balanceado es de tipo restringido, de
modo que el coeficiente real de crecimiento es inferior al mximo, segn la frmula emprica
siguiente:
4
= mx [S]/(KS + [S])
donde [S] es la concentracin del nutriente limitante; K S es la constante de saturacin,
equivalente a la concentracin de nutriente para la que el coeficiente es semimximo.
Como se puede ver, la tasa de crecimiento (medida por ) es una funcin hiperblica de la
concentracin del sustrato (nutriente) limitante. Este sustrato puede ser una fuente de C y/o
de energa, fuente de N, de P, un factor de crecimiento, etc.
En la naturaleza, y en los sistemas de cultivo cerrados que habitualmente se emplean en
laboratorio, tarde o temprano el crecimiento balanceado suele terminar, debido a que se
agotan los nutrientes o se acumulan sustancias de desecho, entonces se establece un sistema
cerrado cuyas caractersticas se describen a continuacin:
Curva de crecimiento en un sistema cerrado en medio lquido
El crecimiento en un sistema cerrado consta de varias fases.
Fase de retardo (fase "lag"): Es el perodo de tiempo durante el que el inculo bacteriano se
adapta a las condiciones del medio fresco sobre el que se ha sembrado. Se trata de un perodo
de ajuste metablico. Su duracin depende de varios factores:
tamao del inculo
estado metablico previo del inculo: si el inculo procede de clulas en fase
estacionaria de un cultivo anterior, la fase lag es larga. Ello se debe a que los contenidos
en coenzimas y otros constituyentes de las clulas son bajos, y las clulas deben
reponerlos en el medio fresco. Si las clulas estn daadas por algn agente, el lag
tambin es largo, ya que necesitan un tiempo para la reparacin de los daos. Si las
clulas del inculo se tomaron de un cultivo previo en fase logartmica, el lag es ms
corto.
medio del que procede el inculo: si el medio es similar al medio fresco, el lag es ms
corto. Si el medio del inculo era un medio rico y el medio fresco es ms pobre, la fase
de retardo se hace ms larga porque las bacterias necesitan un tiempo adicional para
activar la sntesis de las enzimas biosintticas que estaban reprimidas en el medio rico.
Pero an cuando la inoculacin se hace desde un cultivo previo en fase logartmica,
cuyo medio sea idntico al medio fresco, se observa siempre una fase lag. Por qu?:
necesidad de neutralizar sustancias txicas en el medio fresco;
diferencia en la temperatura de los medios
porque puede producirse dilucin de metabolitos intracelulares
Fase de crecimiento exponencial (fase logartmica). En el comienzo de este perodo, cada
clula entra en crecimiento exponencial con un cierto desfasaje respecto de sus compaeras.
Ello demuestra que las clulas del inculo no estn todas en las mismas condiciones
fisiolgicas.
Durante la fase logartmica se da un crecimiento balanceado no restringido durante unas pocas
generaciones (normalmente menos de 10). El tiempo de generacin (g) es caracterstico para
cada especie o cepa, en cada medio concreto:
El valor del tiempo de generacin (g) depende de:
composicin del medio
5
temperatura
pH
osmolaridad (tonicidad), etc.
Los microorganismos hetertrofos suelen crecer ms rpidamente en los medios complejos,
ricos, que en los medios sintticos, y dentro de estos ltimos, mejor con glucosa que con otras
fuentes de carbono.
Fase estacionaria: Esta fase se caracteriza porque el coeficiente neto de crecimiento se hace
nulo ( = 0), pero an existe crecimiento. Lo que ocurre es que el crecimiento neto se
equilibra con las muertes celulares.
En este perodo se agotan determinados nutrientes y se acumulan sustancias de desecho.
Incluso el pH del medio empieza a hacerse inadecuado para el crecimiento celular.
Si la bacteria crece en un medio complejo, la transicin entre las fases exponencial y
estacionaria (de aceleracin negativa) puede ser relativamente larga, debido a que va
recurriendo a fuentes alternativas (por ejemplo, puede recurrir a metabolizar aminocidos
como fuente de carbono una vez agotados los azcares).
En la fase estacionaria an existen reacciones metablicas, pero el metabolismo general de
la bacteria es sustancialmente diferente al de la fase logartmica:
las clulas son ms pequeas, debido a que existe divisin celular despus de que se
haya detenido el incremento de masa;
el citoplasma se condensa;
en las bacterias Gram-negativas aumenta el volumen relativo del periplasma;
el nucleoide se condensa, por sustitucin de ciertas protenas que se unen a ADN;
la membrana citoplsmica se hace menos fluida;
suelen ser ms resistentes a agentes fsicos (temperatura, estrs osmtico) y qumicos;
existe un cambio en el patrn de expresin gentica: disminuye la expresin de cientos
de genes que haban estado expresndose durante la fase exponencial, mientras que se
activan unos 50-100 genes que antes estaban reprimidos (genes de fase estacionaria);
estos genes se transcriben mediante la holoenzima de la ARN-polimerasa dotada del
factor sigma S caracterstico de esta fase de crecimiento.
existe reciclado de ciertos materiales intracelulares;
baja el contenido en ARN.
Fase de muerte: Se da muerte y lisis masiva del cultivo. Se debe al agotamiento de reservas
de energa y la imposibilidad de llevar a cabo las reacciones bsicas para el mantenimiento de
la clula. Algunas veces las clulas aparecen grandes, hinchadas, distorsionadas (formas
"fantasmas", "ghost"). Dependiendo de la especie y el cultivo utilizado, la fase de muerte
puede presentar una cintica exponencial, caracterizada por un de muerte, que en este caso
ser negativo. La pendiente de esta curva tambin vara segn la especie (por ejemplo, en
bacterias entricas es suave, mientras que en Bacillus es ms acentuada).
10
Mecanismo de accin: Se une a varios sitios de la subunidad 50S, entre los cuales el ms
importante es la protena L16, que forma parte del centro peptidil-transferasa, cerca del sitio
del ribosoma donde encaja el extremo aminoacil del ARNt, en el sitio A.
El cloranfenicol ha sido muy til en el estudio de los ribosomas, ya que estabiliza los
polisomas rpidamente.
11
TRABAJO PRCTICO N 3
CRECIMIENTO BACTERIANO Y EFECTO DE LOS ANTIBITICOS
3. Cintica de crecimiento
a) Inocular un erlenmeyer con 80 ml de medio LB lquido con un cultivo saturado de E.
coli, de manera de lograr una DO inicial de 0.1. Incubar a 37 C con agitacin.
b) Cuando el cultivo haya alcanzado una DO aproximada de 0.3 dividir en 4 alcuotas de
15 ml cada una:
Cuestionario Gua
1. Qu tcnicas pueden utilizarse para medir el crecimiento bacteriano? Cules son las
ventajas y desventajas de cada una de ellas?
2. Puede usarse la produccin de un metabolito secundario para evaluar el crecimiento de un
cultivo?
3. Que fenmenos ocurren durante la fase lag de crecimiento? Qu factores afectan la
duracin del perodo lag?
4. Qu factores influyen sobre la velocidad de crecimiento?
5. Cmo se calcula la velocidad mxima de crecimiento en un cultivo cerrado? y el tiempo de
generacin?
6. Cmo se puede mantener un microorganismo en fase exponencial de crecimiento por un
perodo continuado de tiempo?
7. Cmo se calcula el rendimiento celular?
8. Si luego de 2 das de cultivo no se obtiene desarrollo de un dado microorganismo ni a 10C
ni a 45C, puede concluir que ese microorganismo no crece a esas temperaturas?
9. Por qu deben realizarse diluciones para realizar el recuento de clulas viables?
10. Cuando se realiza un recuento de clulas viables, qu es lo que se cuenta y qu es lo que
se asume?
11. Cmo diferencia un agente bactericida de un bacteriosttico?
12. Cul es el blanco de los antibiticos betalactmicos? Cul es su mecanismo de accin?
13. Para qu realizara un antibiograma en un diagnstico clnico?
14. Cmo se podra determinar si los microorganismos contenidos dentro una zona de
inhibicin del crecimiento estn muertos o solo inhibidos?
15. Explique la importancia de incluir controles positivos y negativos en un ensayo de CIM
14
Problemas
1. Se desean estudiar las caractersticas de crecimiento de dos especies bacterianas Q.O.T. aisladas
a partir de una muestra de suelo. Las especies en cuestin, denominadas cepa A y cepa B, fueron
caracterizadas nutricionalmente hallndose que la cepa A posee una auxotrofa para el aminocido
(L)-leucina y mientras que la cepa B es prottrofa para este aminocido y es productora de al menos
una sustancia con actividad antibitica, sintetizada desde el comienzo de la fase exponencial tarda
de crecimiento. Luego de cultivarse por separado las cepas A y B en medio sinttico mnimo, se
obtuvieron los resultados dados a continuacin.
Tiempo (h)
ln D.O.
Cepa A
Cepa B
0.095
0.182
0.139
0.182
0.530
0.405
0.910
0.693
1.609
1.029
2.300
1.386
2.990
1.568
3.400
1.609
3.690
1.705
3.800
1.705
10
3.850
1.723
11
3.850
1.740
12
3.850
1.723
a) Calcule la mxima de crecimiento y el tiempo de generacin (g) para cada cepa bacteriana.
b) Confeccione un medio de cultivo sinttico mnimo apto para el crecimiento de cada cepa bacteriana
por separado.
A continuacin los microorganismos A y B son crecidos juntos en el mismo medio de cultivo
sinttico mnimo obtenindose los datos siguientes:
ln (N cl. viables / ml)
Cepa A
Cepa B
0
11.51
11.61
1
11.61
11.61
2
12.07
11.95
3
12.30
12.30
4
12.90
12.64
5
13.59
13.00
6
14.28
13.33
7
14.40
14.15
8
14.00
15.42
9
13.59
16.70
10
13.22
17.97
11
12.21
19.24
12
9.21
20.51
c) Confeccione un medio de cultivo sinttico mnimo para el crecimiento conjunto de las cepas A y B.
Tiempo (h)
15
TIEMPO (minutos)
S y R con antibitico.
S sin antibitico
S sin antibitico
S con antibitico
0
30
60
90
120
150
180
210
240
270
300
330
360
390
Osmolaridad del medio
1.0 x 103
1.0 x 103
1.5 x 103
4.0 x 104
4.0 x 105
4.0 x 106
4.2 x 107
3.7 x 108
4.3 x 108
5.0 x 108
5.1 x 108
5.2 x 108
5.2 x 108
5.2 x 108
ISOSMOTICO
1.1 x 103
1.2 x 103
1.3 x 103
4.2 x 104
4.1 x 105
3.9 x 106
4.1 x 107
3.6 x 108
4.2 x 108
4.9 x 108
5.0 x 108
5.1 x 108
5.2 x 108
5.2 x 108
HIPOSMOTICO
1.1 x 103
1.2 x 103
1.2 x 103
4.1 x 104
4.0 x 105
3.8 x 106
4.0 x 106
9.0 x 105
2.0 x 105
8.0 x 104
4.0 x 104
2.1 x 104
1.0 x 104
5.0 x 103
HIPOSMTICO
mismo a distintas alcuotas de un cultivo de Abs=0,6 y se midi la Abs final alcanzada luego
de 1 hora de adicionado el antibitico.
CONCENTRACIN (g/ml)
10
50
100
200
c.
Para analizar cul era el metabolismo afectado se ensay el antibitico en cuestin y otros
de actividad conocida sobre una cepa sensible en presencia de precursores marcados
radiactivamente, y se midi su incorporacin a distintas biomolculas. Los valores
informados (en cuentas por minuto totales) fueron:
ANTIBIOTICO
[35S] metionina
[3H] timidina
[3H] uracilo
ATB
14900
14000
14900
[14C] UDP
NAcGluc
17000
Cloranfenicol
3100
16300
16100
111000
Actinomicina
14000
2500
15500
120000
Rifampicina
13900
16000
170
115000
Vancomicina
14800
16500
16000
20000
Sin antibitico
15000
17000
16500
120000
d. Con el fin de localizar el sitio de accin del antibitico se realiz un experimento en el cual
se utilizaron precursores radioactivos de la sntesis de murena, midindose la
incorporacin de los mismos a la pared celular en un medio isosmtico, luego de 2 horas de
cultivo, en presencia de 200 g/ml del antibitico.
PRECURSOR
S sin antibitico
S con antibitico
R con antibitico
N-AcGlucosamina
20000
1500
18000
D-Alanina
23000
1300
17900
19000
1600
19000
0.80
40
0.81
17
20
0.72
10
0.74
0.71
Cultivo 1
D.O.
ln D.O
148
5
149
5
181
5.2
330
5.8
600
6.4
1097
7
2000
7.6
3640
8.2
5400
8.6
5430
8.6
D.O.
148
149
181
330
600
600
600
600
600
600
Cultivo 2
ln D.O
5
5
5.2
5.8
6.4
6.4
6.4
6.4
6.4
6.4
D.O.
148
149
181
330
600
600
600
600
600
600
Cultivo 3
ln D.O
5
5
5.2
5.8
6.4
6.4
6.4
6.4
6.4
6.4
Cultivo 2
Nv
Cultivo 3
ln Nv
Nv
ln Nv
18
0
60
90
120
150
180
210
240
300
360
2.7
2.7
3.3
6.0
11
11
11
11
11
11
19.4
19.4
19.6
20.2
20.8
20.8
20.8
20.8
20.8
20.8
2.7
2.7
3.3
6.0
6.0
5.8
3.2
2.5
2.0
1.8
Dilucin
Vol. de siembra (ml)
10-2
0.1
0
-3
10
0.1
10-2
0.2
1
-3
10
0.2
10-2
0.1
2
-3
10
0.1
10-3
0.1
4
-4
10
0.1
-6
10
0.2
6
10-7
0.2
-5
10
0.1
7
10-6
0.1
-6
10
0.1
8
10-7
0.1
-7
10
0.2
9
10-8
0.2
Tabla 2. El antibitico X fue agregado a T = 4 hs.
Tiempo (hs)
5
Dilucin
10-4
10-5
UFC
30
1
61
3
60
8
410
38
49
4
922
145
290
25
58
1
UFC
54
5
19
10-3
10-4
10-3
10-4
7
9
0.1
0.1
0.2
0.2
630
55
1200
108
UFC
108
9
120
24
54
2
Dilucin
10-4
10-5
10-3
10-4
10-3
10-4
a. Calcule UFC/ml del cultivo para cada tiempo, en ausencia y presencia de los antibiticos X e Y.
b. Grafique ln Nv/ml vs tiempo en ausencia y presencia de los antibiticos.
c. Calcule mx y g.
d. Puede, en base a los datos de Nv, indicar el efecto de los antibiticos X e y sobre E. coli?
(bacteriosttico, bactericida propiamente dicho o bacterioltico). En caso negativo, indique qu otros
datos necesitara para determinarlo.
6. Se quiere determinar el sitio de accin de un antibitico, para lo cual se utiliza la bacteria Gram (+)
Bacillus subtilis. Alcuotas de esta bacteria son incubadas con el agregado de precursores
radioactivos en presencia o en ausencia del antibitico. Luego se van tomando muestras a distintos
tiempos y se determina la incorporacin de radioactividad en cada caso, obtenindose los siguientes
grficos:
a) Incubacin realizada en presencia de UDP ( 14C) Glc-Nac
% d e r a d io a c t iv id a d
e n la p a re d c e lu la r
3
T ie m p o ( H s .)
S in a n t ib i tic o
C o n a n tib i tic o
20
% d e r a d io a c t iv id a d
e n la p a re d c e lu la r
T ie m p o ( H s .)
S in a n t ib i t ic o
C o n a n tib i tic o
% d e r a d io a c t iv id a d
e n la fr a c c i n d e
m e m b ra n a
T ie m p o ( H s .)
S in a n t ib i t ic o
C o n a n tib i tic o
Indique los posibles sitios de accin de este antibitico. Grafique D.O. en funcin del tiempo
para un cultivo al que se le agrega este antibitico. Justifique sus respuestas.
7. Se estudi el mecanismo y lugar de accin de un antibitico activo contra bacterias Gram (+), para
ello se realizaron los siguientes ensayos:
Ensayos de biosntesis de macromolculas: se cultiv la bacteria Staphylococcus aureus en
presencia de distintos precursores de macromolculas marcadas radioactivamente, en presencia de
distintos antibiticos conocidos y del nuevo antibitico X. Luego se prepararon los extractos celulares
segn la macromolcula que se quera estudiar y se determin la cantidad de radioactividad de cada
una segn la siguiente tabla:
21
DNA
RNA
Murena
92
Cloranfenicol
85
Actinomicina
91
15
Rifampicina
92
Vancomicina
84
Precursor radioactivo
Antibitico (/ml)
UDP-GlcNac
UDP-MurNac-pentapptido
Sin agregado
X
D-cicloserina
Ristocetina
Sin agregado
X
D-cicloserina
Ristocetina
Radiactividad
(incorporada en
murena)
20000
200
250
400
5000
4500
4250
500
% Inhibicin
99
98.5
98
5
7.5
90
TIEMPO (hs)
Ln PESO SECO
4.5
1.50
5.0
1.61
6.3
1.84
10
12.5
2.53
14
25.0
3.22
18
40
3.70
22
Por encima de las 20 hs. no se observa aumento apreciable del peso seco.
Paralelamente se determina la concentracin de tetraciclina (Tc) producida por esta especie
bacteriana en el sobrenadante del medio de cultivo. (Figura 1)
Figura 1.
C c de Tc
p r o d u c id a
15
10
20
25
30
T ie m p o ( h s )
L o g D O (5 9 0 n m )
S . f a e c a li s (A )
S . f a e c a li s (B )
S . f a e c a li s (C )
8
T ie m p o ( H s .)
23
b) Actividad biolgica de la Tetraciclina recuperada del sobrenadante (esterilizado por filtracin) donde
se desarrollaron las cepas (B) y (C) (Fig. 2).
El sobrenadante de un cultivo de S. faecalis (B) y (C), al que se cultiv ON en presencia de
Tetraciclina (100 g/ml), fue recuperado y utilizado para ensayar su capacidad inhibitoria remanente a
distintas concentraciones, sobre una suspensin de bacterias (A). El crecimiento fue observado y
medido a las 15 hs de la adicin del sobrenadante. El control se realiz incorporando en un tubo
cantidades variables de Tetraciclina fresca.
Figura 2.
L o g D O (5 9 0 n m )
/16
/8
/4
T e tr a c ic lin a ( g /m l)
/2
D ilu c io n e s d e l
s o b re n a d a n te
C e p a (A ) + d is t in t a s d ilu c io n e s d e l s o b r e n a d a n te d e ( B )
C e p a (A ) + d is t in t a s d ilu c io n e s d e l s o b r e n a d a n te d e ( C )
C e p a (A ) + c a n t id a d e s v a r ia b le s d e T e t r a c ic lin a
50
S . f a e c a lis (C )
10
15
20
25
T e tr a c ic lin a ( g /m l)
24
C epa A
Cepa B
Cepa C
100
100
100
75
75
75
50
50
50
25
25
25
10
15
20
10
15
20
10
15
20
T ie m p o (m in )
S . fa e c a lis (A ) e n p re s e n c ia d e g lu c o s a
S . f a e c a lis (A ) e n a u s e n c ia d e g lu c o s a
S . fa e c a lis (B ) e n p re s e n c ia d e g lu c o s a
S . f a e c a lis (B ) e n a u s e n c ia d e g lu c o s a
S . fa e c a lis (C ) e n p re s e n c ia d e g lu c o s a
S . f a e c a lis (C ) e n a u s e n c ia d e g lu c o s a
Establezca qu tipo de mecanismo sera el que impide que estos mutantes sean afectados por
la Tetraciclina.
10.
Indique cmo se comportar un cultivo de la bacteria Gram (-) E. coli K12, ante el agregado
de los siguientes antibiticos, por separado, en los momentos indicados por las flechas, ya sea
en un medio hipotnico (caldo peptonado) o isotnico (caldo peptonado + sacarosa).
1- Penicilina G
2- Estreptomicina
3- Polimixina
4- cido Nalidxico
D .O .
D .O .
1, 3, 4
1, 3, 4
3, 4
1, 2, 3
1, 2, 3
3, 2
T ie m p o
M E D IO IS O T N IC O
T ie m p o
M E D IO H IP O T N IC O
25
11. Hasta el presente se han descripto distintos mecanismos de resistencia bacteriana a tetraciclinas.
Para estudiar uno de estos mecanismos de resistencia mediado por la protena Tet (0) en una cepa
de E. coli denominada JM107 productora de esta protena, se realizaron los siguientes ensayos:
a.
Captacin de 3H-tetraciclina: se cultivaron las cepas JM107 y HB101 (cepa de E. coli resistente
a tetraciclina mediante un proceso de expulsin activo de la droga) hasta la fase exponencial de
crecimiento, se lavaron y resuspendieron en medio de cultivo fresco con el agregado de 3Htetraciclina. A distintos tiempos se tomaron alcuotas y se determin la radioactividad presente en
las bacterias.
C a p ta c i n
d e (3H )-T c
JM 107
8
6
4
HB 101
15
30
45
60
75
90
T ie m p o ( m in )
b.
14
dems completo. A los 60 minutos se precipita la polifenilalanina con cido tricloroactico al 10%
y se mide la radioactividad incorporada en el precipitado. En la figura 2 se grafica el porcentaje
de inhibicin alcanzado.
% de
100
In h ib ic i n
80
H B 101
60
40
JM 107
20
25
c.
50
75
100
125
150
[T c ] M
26
( H )-T c
u n id a 2 .0
H B101
1 .5
1 .0
JM 107
0 .5
20
40
60
80
100
125
1 5 0 [T c ] M
En base a los datos mostrados, indique el posible mecanismo de resistencia de la cepa JM107.
Justifique su respuesta analizando en cada caso los datos mostrados.
a. Una cepa de E. coli fue cultivada en medio sinttico hasta D.O. 0,1. En ese momento se
fraccion el cultivo en 4 partes, y a los 60 minutos a cada fraccin se le adicion un
compuesto diferente (Fig. 1).
FIGURA 2
A b s (5 9 0 n m )
ln N C lu la s
0 ,8
0 ,6
20
15
A g re g a d o
d e d ro g a
0 ,4
10
0 ,2
50
A g re g a d o
d e d ro g a
100
150
200
T ie m p o (m in )
50
100
150
200
T ie m p o (m in )
C o n t r o l s in d r o g a
C o n t r o l s in d r o g a
C lo r a n f e n ic o l
1 0 0 g D if ic id in a
D if ic id in a
2 0 0 g D if ic id in a
P e n ic ilin a
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En base a estos dos experimentos, qu conclusiones extrae sobre el efecto de Dificidina sobre
el crecimiento de E. coli? Fundamente su respuesta.
A continuacin es realizada una serie de experimentos para determinar el proceso metablico
primario inhibido por Dificidina (ejemplo: sntesis de murena, de protenas, de ARN, de ADN). En
todos los casos E. coli se cultiv en medio M9 en presencia de algn precursor radioactivo como se
indica en cada caso, y se determin la radioactividad (cpm) incorporada por las clulas (Figuras 3-6).
In c o r p o ra c i n d e
[3H ] A m in o c id o s
In c o rp o r a c i n d e
[ 3H ] U r a c ilo
CPM
CPM
1
7
2
2 y 5
T ie m p o
T ie m p o
Figura 3
Figura 4
In c o r p o ra c i n d e
[3H ] D A P
In c o r p o r a c i n d e
[ 3H ] T im id in a
CPM
1
6
2
CPM
1
3
5
2
3
4
T ie m p o
T ie m p o
Figura 5
Figura 6
1) sin agregado
5) Estreptomicina
2) Dificidina
6) Rifampicina
3) Ac. Nalidxico
7) Cloranfenicol
4) Cicloserina
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Qu conclusin extrae de estos ltimos experimentos acerca del o de los posibles blancos de accin
de la Dificidina? Explique su respuesta.
13. Se quiere caracterizar un nuevo antibiotico llamado BQ14. Para ello se realizan los siguientes
experimentos utilizando una cepa sensible al mismo:
Se cultiva la cepa sensible en medio de cultivo LB hasta DO= 0.3. En este momento el cultivo
se divide en 2: A la mitad se le adiciona BQ14 100 g/mL y a la otra se la deja sin tratamiento
(Control). Se obtienen el siguiente resultado:
Muestra
T1
T2
Volumen
sembrado
0.1
0.2
0.2
0.2
0.1
0.1
Dilucin
10-4
10-5
10-6
10-3
10-4
10-5
Colonias
1000
230
18
150
6
0
+ BQ14
Sin antibitico
[35S] metionina
14900
15000
[3H] timidina
1100
17000
[3H] uracilo
15900
16500
[14C] DAP
110000
120000
generacin.
Describa brevemente los pasos a seguir para hacer un recuento de clulas viables.
Calcule UFC/mL en los tiempos T1 y T2 para el cultivo tratado con BQ14.
Clasifique a BQ14 segn su actividad sobre la cepa estudiada. Justifique
Qu procesos metablicos se ven afectados en presencia de BQ14? Justifique
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