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PRCTICA 6: CULTIVO POR LOTE Y LOTE ALIMENTADO

LABORATORIO DE BIORREACTORES
PRCTICA 6: Produccin de proteasa
extracelular a partir B. subtilis utilizando
sustratos crudos en bioreactor Airlift.
Gonzlez Valadez Manuel
Lastra Martos Carlos
Ramrez Amador Fidel
Villagmez Garca David
5BM1
Martes 21 de Abril de 2015

INSTITUTO POLITCNICO NACIONAL

PRCTICA 6: CULTIVO POR LOTE Y LOTE ALIMENTADO

RESUMEN.
Dentro del rea de Bioprocesos pueden darse diferentes tipos de control, como
pueden ser un cultivo por lote (Batch), lote alimentado (Fed-batch) o continuo; segn
corresponda al propsito que se busca cumplir. Es decir, si se busca la generacin
de biomasa primordialmente, o bien la produccin de metabolitos de valor industrial
o productos de alto valor agregado. Las proteasas por ejemplo, han adquirido mayor
inters en las industrias textil y farmacutica principalmente. Por ende y debido a su
valor comercial, se han buscado estrategias para la obtencin de las mismas. En
nuestro caso, se prob con la produccin de proteasas extracelulares a partir de B.
subtilis, utilizando sustratos crudos de camote y soya, operando el proceso en un
biorreactor tipo Air-lift en cultivo por lote alimentado.

INTRODUCIN.
El cultivo por lote alimentado (CLA) tambin llamado Fed-Batch (BA), es una tcnica
de cultivo en biorreactor que consiste en alimentar continuamente un cultivo con
medio nutritivo fresco. El BA es particularmente til en procesos en los que el
crecimiento celular y/o la formacin de producto son sensibles a la concentracin
del sustrato limitante, es decir cuando el rendimiento celular o la productividad de la
biomasa o del metabolito buscado se ven afectados. (Villanueva, J., 1992). Algunas
caractersticas principales de un CLA son:
Permite el control de velocidad especfica de crecimiento de
microorganismos ().
Todos los nutrientes son adicionados antes de la inoculacin.
Medio modificado por metabolismo.
La produccin de microorganismos es limitada por la cantidad de
Carbono/Nitrgeno (C/N) adicionada y por la produccin de compuestos
txicos.
Al inicio de la operacin se aade el medio de cultivo y se inocula, incubando
bajo las ptimas condiciones.
En la Figura 1, se puede observar un esquema general del proceso CLA en dnde:
FIGURA 1. Esquema general
de un cultivo por lote
alimentado (CLA). Donde F(t):
Caudal de alimentacin; Sr(t):
Concentracin de sustrato en
la alimentacin; Vf: Volumen
final de operacin; V0:
Volumen de operacin inicial;
X0: Concentracin inicial de
biomasa.
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Se han establecido diferentes ecuaciones diferenciales para el monitoreo y control


de las diferentes variables involucradas durante el proceso, tal como concentracin
celular (X), concentracin de sustrato (S) y concentracin de producto (P). As como
para la medicin de parmetros cinticos como velocidades especficas para
biomasa, sustrato y producto (qx, qs y qp, respectivamente) y el rendimiento (Yxs).
En la Tabla 1, se establece una comparacin entre los balances realizados para un
cultivo por lote (Batch) y uno por lote alimentado (Fed-Batch).

Adems de los parmetros cinticos mencionados, durante una fermentacin en un


biorreactor es indispensable el control de parmetros fsicos como temperatura,
velocidad de agitacin, potencia, flujo de aireacin, viscosidad del medio, etc.; al
igual que parmetros qumicos como pH, concentracin de oxgeno disuelto (OD),
CO2, potencial redox, etc. Todas estas variables tienen un importante efecto sobre
el rendimiento de la biorreaccin y sobre las reacciones enzimticas. (Garca, 1993).
As mismo, para facilitar el monitoreo de dichas variables, es necesaria la
instrumentacin adecuada, segn el parmetro a controlar (vase Tabla 2.).
Idealmente, estos sensores deben de estar en lnea para medir las propiedades
fsicas del cultivo, al mismo tiempo deben ser esterilizables para asegurar la asepsia
del proceso. (Moreno & Bernal, 1996).

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TABLA 2. Instrumentacin de control segn la variable a controlar.

En cuanto al producto de inters, las proteasas, estas son endopeptidasas que


actan sobre las protenas hidrolizando enlaces peptdicos. Las proteasas pueden
ser: metaloproteasas que trabajan a pH ptimo de 7,0; estearasas, enzimas con alta
actividad esteroltica y baja actividad proteoltica; o bien serin-proteasas.
La alcalin-serin-proteasa producida por Bacillus subtilis, tambin llamada subtilissin, es una de las enzimas ms estudiadas, de ah que sus genes han sido clonados
repetidas veces. De estos estudios se ha podido determinar que subtilis-sin no se
trata de una enzima esencial y que su ausencia no afecta ni el crecimiento ni la
especulacin de Bacillus, y se puede decir que esto se cumple para todas las
proteasas producidas por Bacillus. (Devlin, T., 1999).
Debido a su capacidad qumica de hidrolizar enlaces peptdicos, las proteasas han
sido empleadas en diferentes industrias tales como la industria textil y farmacutica
entre otras.

OBJETIVO.
Operar el biorreactor tipo Airlift para la produccin de proteasas a partir de B. subtilis
con sustratos crudos, en base a un cultivo por lote y lote alimentado.
Objetivos especficos:
Monitorear crecimiento celular, sustrato residual y actividad enzimtica por
distintos mtodos reportados.
Mantener condiciones estriles en todo momento.
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Llevar a cabo los medios de cultivo necesarios para propagacin de la cepa,


preinculos y medio de fermentacin.

MATERIALES Y METODOLOGA.
Material:
I.
Cajas Petri.
II. Matraces
Erlenmeyer
de
250mL, 1000mL y 2500mL.
III. Vasos de precipitado de 250mL
y 500mL.
IV. Esptulas.
V. Tubos Falcon.
VI. Tubos Eppendorf.
VII. Celdas para espectrofotmetro.
VIII. Micropipetas 100-1000L.
Medios y reactivos:
I.
Cepa de B. subtilis.
II. Almidn.
III. Peptona.
IV. NaCl.
V. Agar bacteriolgico.
VI. Agar papa-dextrosa.
VII. Agar nutritivo.
VIII. Harina de soya.
IX.
Salgado de trigo.
X.
Polvo de camote.
Equipos:
I.
Biorreactor tipo Air-Lift de 3L
marca Applikon.
II. Consola con software para
obtencin de datos.
III. Sensor de oxgeno marca
Applisense.
IV. Sensor de temperatura.
V. Sistema de calentamiento.

IX.
X.
XI.
XII.
XIII.
XIV.
XV.
XVI.
XVII.

XI.
XII.
XIII.
XIV.
XV.
XVI.
XVII.
XVIII.
XIX.

VI.
VII.
VIII.
IX.
X.
XI.
XII.

Micropipetas 20-200 L.
Cajas puntas azules.
Cajas puntas amarillas.
Probetas 100mL.
Frasco mbar.
Papel filtro.
Bolsas de polipapel.
Gasas.
Cinta testigo.

NaOH.
cido 3,5-dinitrosaliclico.
Tartrato
Sodio-Potasio
tetrahidratado.
Fenol.
Sulfito de Sodio.
Na2PO4.
KH2PO4.
Albmina.
cido actico.

Bscula analtica.
Autoclave.
Vrtex.
Espectrofotmetro UV-VIS.
Compresor de aire de 25L
marca Pretul.
Incubadora.
Refrigerador.

La metodologa del proceso realizado se subdivide conforme a las acciones


realizadas cada da, desde el inicio hasta el final de la prctica.

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MARTES 17/03
Preparacin de reactivo DNS (vase Anexo 1) y realizacin de curva de
calibracin para azcares reductores (Mtodo de Miller).
Preparacin de dos medios de cultivo papa dextrosa y agar nutritivo para
propagacin, los cuales se esterilizaron y posteriormente se inocularon con
B. subtillis, incubndolos a 30C.
MIRCOLES 18/03
Preparacin de medios:
Medio Slido (1L): 20g de Almidn; 10g de peptona; 5g de NaCl y 20g de
Agar bacteriolgico.
Medio nutritivo (100mL): 0.8g de agar nutritivo.
Medio Lquido (150mL): 7.5g de camote seco (cortado, deshidratado y
pulverizado); 7.5g de harina de soya; 2.5g de salvado de trigo; 1g de Na2PO4
y 0.75g KH2PO4
Medio Lquido de operacin (2L): 140g de camote seco (cortado,
deshidratado y pulverizado); 70g s de salvado de trigo; 50g de harina de
soya; 8 g Na2PO4 y 0.6 g KH2PO4.
Se esterilizaron en autoclave. Se perdieron durante la esterilizacin 400mL
de medio de operacin. Posteriormente los medios nutritivo y lquido de
100mL y 150mL respectivamente se inocularon con B. subtillis a partir de los
medios preparados el da anterior. Se incubaron a 30C.
Se verti el medio de cultivo slido en 40 cajas de Petri utilizando la campana
de flujo laminar.
JUEVES 19/03
Se esteriliz el biorreactor en 3 autoclaves diferentes, aislando con aluminio
toda abertura que pudiera contaminarse utilizando bolsas de poli papel y
papel aluminio.
Se inocul el medio de operacin con los medios que se incubaron.
Se instal el biorreactor.
Se calibr el compresor a 1.5L/min y se conect a vlvula de inyeccin de
aire.
Se aliment el biorreactor con 1.5L de medio, quedando sedimento de sobra.
Durante cada dos horas se tom muestra, siendo la primera a las 12:30pm y
la ltima a las 20:30pm (6 muestras en total), donde de cada una se sigui
una metodologa para determinar sustrato, producto y biomasa.
Las muestras se almacenaron en refrigerador a 4C.
Durante la noche se disminuy el flujo de aire a 0.5L/min para prevenir el
derrame de espuma.

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VIERNES 20/03
Preparacin de 100mL de antiespumante Tween 80 al 1%. Se Adicion al
biorreactor 10mL.
Se hicieron 3 alimentaciones cada dos horas, tomando muestras cada hora,
finalizando la toma de muestras a las 13:30pm
A cada una de las muestras (incluyendo las del da anterior) se les hizo
diluciones hasta alcanzar el orden de 10-7, pero solo se plaquearon (con
200L) la de 10-5 y 10-7 en cajas Petri con medio slido. Se dejaron a
temperatura ambiente durante el fin de semana.
Las muestras se guardaron en refrigerador a 4C.
Se limpi el biorreactor y se desarm.
LUNES 23/03
Se realizaron metodologas para la cuantificacin de consumo de sustrato
(vase Anexo 2), generacin de producto (vase Anexo 3) y biomasa. Este
ltimo consisti en tcnica de conteo de colonias a partir de diluciones 10 -5 y
10-7.
DESCRIPCIN DEL SISTEMA.

1.
1.

6.
2.
2.
6.

7.
7.
3.

8.
8.
4.
5.

FIGURA 2. Componentes principales del sistema utilizado para cultivo por


lote alimentado.

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A. Biorreactor tipo Air-Lift de 3L marca Applikon.


1. Sensor de Oxgeno Applisense.
2. Ventanilla de observacin.
3. Sensor de Temperatura.
4. Vlvula de toma de muestra/Inyeccin de aire.
5. Filtro de aire de membrana.
B. Software de obtencin de parmetros para biorreactor Air-Lift marca Applikon.
6. Pantalla para recoleccin de datos (pH, temperatura de operacin,
concentracin de oxgeno disuelto (OD)).
7. Rotmetros (L/min).
8. Bombas peristlticas para soluciones cidas, alcalinas o antiespumantes.

RESULTADOS Y DISCUSIN.
En un inicio, el proceso se llev a cabo como un cultivo por lote (Batch) durante 22
horas (vase Fig. 3); durante las cuales, se tomaron muestras cada hora por las
primeras 8 horas. Despus de este tiempo, se dej al reactor operando toda la
noche (14 horas aproximadamente), disminuyendo a su vez el flujo de aireacin a
0.5L/min como se menciona en la metodologa, para evitar posibles derrames de
espuma. Posteriormente, se realiz la primera alimentacin con 200 mL de medio
nutritivo con sustrato crudo (camote, soya, trigo). Se aliment nuevamente este
volumen a las 24 y 25 horas. Las muestras se diluyeron hasta factores de 10 -5 y 107 en 1 mL. Con un volumen de operacin de 2.05 L se establecieron valores de
biomasa para cada muestra.

Biomasa vs Tiempo
4.00E+14
3.50E+14
3.00E+14

UFC

2.50E+14
2.00E+14
1.50E+14
1.00E+14
5.00E+13
0.00E+00
0

10

12

14

16

18

20

22

24

26

28

Tiempo (Horas)

FIGURA 3. Curva de Biomasa (UFC) vs Tiempo (Horas). El espacio entre 8-22


horas corresponde al periodo noctuno. Las lneas verticales representan las
alimentaciones realizadas durante el cultivo por lote alimentado.
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Es posible observar una disminucin entre la biomasa inicial en el reactor y las


muestras consiguientes. Se considera que esto es debido al cambio drstico que
sufre el microorganismo (B. subtilis) en cuanto a su fuente de Carbono, al pasar de
un caldo nutritivo a el medio de operacin compuesto por sustratos crudos de
camote, soya y trigo. Esto mismo lo menciona Espinosa (2005), cuando estudia la
regulacin de fermentacin de B. subtilis en medios mnimos y complejos con
glucosa y cido pirvico, donde observ una fase de adaptacin larga de 7 horas.
Por tanto, dicha lnea de adaptacin se interpreta como la fase lag.
Una vez iniciado el cultivo por lote alimentado puede observarse un incremento
inicial considerable, con respecto a la biomasa cuantificada a las 8 horas. No
obstante se obtuvo tambin una cada pronunciada luego de la segunda y tercera
alimentacin. En relacin a esto, cabe mencionar que debido a una constante
generacin de espuma al inicio del proceso, fue necesario reajustar el flujo de
aireacin en numerosas ocasiones. Igualmente, se disminuy el flujo de 1.2 LPM de
aire a 0.5 LPM durante la noche. Esto pudo causar una disminucin considerable
de la concentracin de oxgeno disuelto en el medio que, aunado al crecimiento de
B. subtilis, pudo llegar a valores crticos. Tambin, al agregar el antiespumante
Tween 80 al sistema, pudo aumentar la resistencia a la transferencia de oxgeno en
el medio. Esto ya que los antiespumantes generalmente afectan el rea de
transferencia en las burbujas de aire. (Doran, 1998). Espinosa (2005), reporta
tambin una concentracin de saturacin de oxgeno en agua a 37C y 1 atm de
hasta 220M. Para B. subtilis, Moes et al., (1985) reportan concentraciones
limitantes de oxgeno disuelto de 3.13 M, en las cuales es aun capaz de generar
productos metablicos como acetoina y butaneidol, ms no serin-proteasas.
A partir de los datos de biomasa anteriores, se procedi a la estimacin de la
velocidad especfica de crecimiento (vase Fig. 4). Para determinar la velocidad
mxima (mx) se desarroll una forma linealizada para la ecuacin de crecimiento
celular (Ecuacin 1), de igual modo, al observar con detalle la Fig. 3 puede
interpretarse un incremento entre las horas 7 y 8, por lo que puede considerarse
como un inicio en la fase transitoria entre la fase lag y la de crecimiento
exponencial. (Universidad de Granada, 2005).Por ende, es posible considerar
mx.

= 0
() = + ()

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(1)

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vs Tiempo
Velocidad especfica de crecimiento (1/h)

2
1.8
1.6
1.4
1.2
1
0.8

0.6
0.4
0.2
0
0

Tiempo (Horas)

FIGURA 4. Velocidades especficas de crecimiento () para diferentes


instantes de tiempo (horas).
De manera grfica, puede establecerse mx como un promedio entre los puntos de
variacin en la Fig. 4; de esta forma 0.9 mx 0.6 aproximadamente. Sin embargo,
al linealizar conforme a la Ecuacin 1 se obtiene una pendiente m = mx = 0.6368
h-1. En base a la velocidad especfica de crecimiento mxima, se calcul el tiempo
de duplicacin de B. subtilis en el sistema con la Ecuacin 2.
=

()

= .

(2)

Aun cuando este valor difiere totalmente del reportado por Stainer (2002) de 0.43 h,
este autor hace referencia nicamente a una temperatura ptima de 55C, mientras
que la temperatura de control utilizado en este caso fue de 35C; igualmente, Stainer
considera un crecimiento igualmente ptimo en un medio nutritivo, a diferencia del
medio complejo ya mencionado en otras ocasiones.
En lo que a generacin de producto se refiere, la actividad enzimtica se realiz
conforme a lo mencionado por Salcedo (2003) en cmo la actividad enzimtica
puede ser cuantificada tomando la pendiente (de una base lineal previa) de la curva
de Absorbancia vs Tiempo; tal como l lo hizo en su experimento para la
determinacin de polifenoloxidas en el pardeamiento del banano.

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Dicho esto, se cuantific la actividad de proteasas (vase Fig. 5) por un mtodo


reportado como anlogo al Mtodo de Kunitz (vase Anexo 3). (Belmn et al., s/a).
La actividad proteoltica se determin con la ecuacin:
280
=
()

Donde:
UP = Unidad de actividad proteoltica.
t = tiempo de ensayo de actividad (10 min).
V = vol. de sol. Enzimtica (2mL).
F = Factor de dilucin (1).
(Priolo et al., 1991).

Unidades de actividad proteoltica (UP)

Unidades de Actividad Proteoltica


0.045
0.04
0.035
0.03

0.025
0.02
0.015
0.01
0.005
0
0

10

12

14

16

18

20

22

24

26

28

Tiempo (horas)

FIGURA 5. Unidades de actividad proteoltica por unidad de tiempo (horas).


En la Figura 6, se muestra la curva obtenida por Belmn et al. (s/a), obtenida luego
de monitorear la actividad proteoltica generada por cepa mexicana de B. subtilis
durante 74 horas. Se asemeja parcialmente a la obtenida, en cuanto a picos
considerables en lapsos cortos de tiempo y comportamiento constante luego de un
largo tiempo.

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FIGURA 6. Curva obtenida por Belmn para actividad proteoltica de cepa


mexicana de B. subtilis.
Es coherente la aparicin de actividad enzimtica desde una etapa temprana,
debido a que la curva fue iniciada luego de agregar un preinculo para asegurar una
induccin del sustrato. De igual manera, el descenso en la actividad observado en
la hora 4 indica una posible inactivacin parcial del complejo enzimtico; esto como
una respuesta fisiolgica al inicio del desarrollo en un medio complejo, como el que
se estuvo operando durante el proceso. As mismo se ha demostrado anteriormente
una alta especificidad de diferentes sustratos proteicos naturales y modificados,
donde las proteasas exhiben una alta afinidad por la casena. (Mrquez et al., 2007).
Ahora bien, en cuanto al consumo de sustrato, no fue posible la cuantificacin por
azcares reductores debido a numerosos factores, entre los cuales el ms
considerable se cree que es una incorrecta preparacin del reactivo DNS. En base
a esto, Siempre que se utilice la tcnica de DNS debe respetarse la composicin
del reactivo DNS, es importante recordar que siempre que se haga una modificacin
debemos comprobar que no se afecte la linealidad del mtodo. De lo contrario se
obtendrn resultados dudosos, o errneos. Segn el manual del IPN (2011), se
preparan 20mL de una solucin de NaOH al 2 N con NaOH slido en un Erlenmeyer
de 200mL y llevar a agitacin hasta obtener una solucin homognea. A esta
solucin se le adicionan 30 gramos de Tartrato de Sodio y Potasio y se completa el
volumen a 100mL. Para la adicin del DNS, se debe tener en cuenta, que este en
solucin es reactiva a la luz; por lo tanto es necesario utilizar un recipiente mbar o
en su defecto cubrir el Erlenmeyer con papel aluminio.

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Por ltimo a esta solucin se le aade 1 gramo de DNS (cido 3 5 dinitrosaliclico).


Para la manipulacin de este reactivo es necesario utilizar tapabocas y guantes
debido a su alto poder cancergeno.
Es importante recalcar que, para poder disolver el cido dini-trosalicilico, el hidrxido
de sodio deber estar completamente disuelto. Una vez preparado, el reactivo
deber almacenarse en un recipiente color mbar, a temperatura ambiente. Este
reactivo dura aproximadamente un mes antes de presentar precipitaciones de los
reactivos o vestigios de descomposicin. Debido a lo anterior, se recomienda hacer
los clculos adecuados para preparar slo la cantidad requerida de reactivo y evitar
el desperdicio. En cuanto a la curva de calibracin, Segn la ley de Lambert y Beer,
la absorbancia es directamente proporcional a la concentracin del material que
absorbe la luz, al que generalmente conocemos como analito (Rubinson y
Rubinson, 2000). Siempre que se utiliza un mtodo espectrofotomtrico para
cuantificar la concentracin de analito presente en una muestra problema, es
necesario relacionar la concentracin de dicho analito con la cantidad de luz que
absorbe del haz que le incide. Es recomendable preparar una solucin estandar,
con una concentracin conocida de analito, y realizar diluciones a partir de esa
muestra. Para poder representarla numericamente se utiliza la ecuacin de la recta
(Y= Absorbancia, X= Concentracin de analito).
Debido a lo reportado en la literatura, y comparando el procedimiento que se sigue
en la experimentacin podemos llegar a las siguientes observaciones y puntos de
discusin.
El protocolo de preparacin del reactivo se sigui segn lo estipulado.
Se realizaron las diluciones pertinentes para la lectura en el
espectrofotmetro.
El medio era demasiado turbio, con concentraciones muy altas de protenas
y azucares, lo que hizo incierto la medicin en el espectrofotmetro.
El clculo para el reactivo de DNS pudo ser errneo, debido a que se tom
la relacin de un protocolo ya propuesto en una experimentacin sujeta a
diversos factores distintos a la nuestra.
Finalmente, en cuanto a discusiones generales Dado que los biorreactores utilizan
cultivos vivos, se ven afectados por muchas variables en su medio ambiente. Dichas
variables afectan tanto el crecimiento como la muerte de los microorganismos, y no
solo los microorganismos deseados sino tambin contaminacin exterior.
1. Temperatura.
2. Humedad.
3. Cuidado y alimentacin.
4. Acidez.
Temperatura
Tal vez la variable ms importante en un biorreactor es la temperatura. Un flujo de
aire caliente puede matar totalmente una biomasa con mayor rapidez que cualquier
otro accidente.
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La mayora de los microorganismos pueden sobrevivir en temperaturas de 60 a


105C. Es importante monitorear la temperatura del lecho constantemente. Por el
otro lado un flujo de aire muy frio no matara a los microorganismos pero los inducira
a un estado de animacin suspendida en el cual tienen la mnima actividad. Cada
microorganismo tiene una temperatura optima de crecimiento, sin embargo existen
variedades que se desarrollan a las mismas temperaturas es por esto que se debe
ser muy cuidadoso en mantener sellado el biorreactor porque podra contaminarse
y los microorganismos invasores podran proliferar debido a la temperatura ptima.
(Peter, 2006).
Humedad
Los microorganismos necesitan humedad para sobrevivir y la humedad crea la
biopelcula que elimina (absorbe) contaminantes de una corriente de aire, de modo
que puedan ser asimilados por los microorganismos. Para poder mantener o
recuperar la humedad en un lecho seco dentro de un biorreactor se utilizan
humificadores, o incluyendo un flujo de agua adecuado. Por otra parte, la inundacin
de un biorreactor con agua causar una cada de presin a travs del lecho, y podra
causar una prdida de eficiencia debido a la canalizacin que se desva de la
biomasa. La humedad en porcentaje ptima para el proceso de un lecho esta entre
40 y 60 porciento. (Peter, 2006).
Nutriente
Adems de lograr una temperatura cmoda y un medio ambiente hmedo, los
microorganismos necesitan una dieta de nutrientes balanceados para sobrevivir y
propagarse. Si un lecho es deficiente en ciertos nutrientes, los microorganismos
dejarn de crecer y podran morir. El nitrgeno es un nutriente esencial para el
crecimiento microbiano, otros macronutrientes esenciales incluyen el fsforo,
potasio, azufre, magnesio, calcio, sodio y hierro. (Q. Zhang, 2002). El crecimiento
de un microorganismo depende del medio que se utilice para su crecimiento, al igual
que la temperatura, existen medios ptimos para las variedades de
microorganismos, por esta razn debe cuidarse la esterilidad del medio al igual que
la del biorreactor para que no exista una contaminacin por medio de
microorganismos externos a los que se desea cultivar.
pH
La mayora de los biorreactores funcionan mejor cuando el pH es cercano a 7 o
neutro. Algunos componentes de los medios forman cidos al descomponerse.
Existen varias tcnicas disponibles para neutralizar los lechos. Estas tcnicas
implican componentes que deben agregarse al medio durante su elaboracin por
ejemplo conchas de ostras. (Joseph, 1998). Es muy importante controlar el pH del
medio ya que los microorganismos se desarrollan a pHs especficos para cada
variedad.

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Principales razones de contaminacin de biorreactor Airlift:


Alimentacin del medio por un embudo en contacto con el medio
ambiente.
Constantes entradas y salidas del rea de trabajo donde se
encontraban los biorreactores.
Probablemente no se port el equipo de trabajo (cofias, guantes,
tapabocas) todo el tiempo, exponiendo el biorreactor a contaminacin.
Cuando se tomaron las muestras, se utiliz una jeringa que se
sumerga en alcohol cada que se sacaba una muestra distinta, sin
embargo como estaba en contacto con el ambiente no se puede
garantizar que no tuviera contaminantes.
Es posible que despus de la esterilizacin del biorreactor, cuando se
estaba transportando al laboratorio, se pudiera contaminar, debido a
que el aluminio que cubra las salidas y entradas al dispositivo, tenan
pequeos orificios en algunas partes.

CONCLUSIONES.
Se oper el biorreactor tipo Air-lift para la produccin de proteasas a partir de
B. subtilis en sustratos crudos, mediante un cultivo por lote y lote alimentado.
Se lograron medir ciertos parmetros cinticos en cuanto a la concentracin
celular y la generacin de producto respecto al tiempo; sin embargo, debido
a una posible preparacin errnea del reactivo DNS, no se logr cuantificar
sustrato residual por mtodo de Miller.
Se consigui la produccin de proteasas, cuya actividad enzimtica mxima
correspondi a 0.419 UP. Adems de su corroboracin por otros mtodos
cualitativos.

CUESTIONARIO POST-LABORATORIO.
1.
Discuta ampliamente la importancia de medir y controlar los parmetros
mencionados anteriormente.
Parmetros como la temperatura, el pH, la concentracin de oxgeno disuelto, entre
otros tienen un importante efecto sobre el rendimiento de la biorreaccin y sobre las
reacciones enzimticas.
Un biorreactor necesita el uso de sensores para medir los parmetros presentes en
los biorreactores, as logrando un ajuste en el equipo a un punto ptimo de
operacin.
Idealmente, los sensores deben de estar en lnea, para medir las propiedades
fsicas del cultivo, estos sensores deben ser esterilizables para asegurar la asepsia
del proceso
2.
Investigue y explique algunas alternativas para controlar el pH, que no sean
las mencionadas durante la prctica (p.e. sales amortiguadoras, produccin de
metabolitos secundarios, etc.).

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La solucin por sales amortiguadoras on aquellas disoluciones cuya concentracin


de protones apenas vara al aadir cidos o bases fuertes. Por lo general esta
formado por mezcla binarias, un cido dbil y una sal del mismo cido con una base
fuerte (por ejemplo, cido actico y acetato sdico) y una base dbil y la sal de esta
base con un cido fuerte (por ejemplo, amonaco y cloruro amnico). Si a este
sistema aadimos un cido fuerte como el HCl, se produce un aumento instantneo
de la [H+], y el equilibrio se desplaza hacia la izquierda, formndose AcH hasta
recuperarse prcticamente la [AcH] inicial. Adems, los iones acetato procedentes
de la sal se pueden combinar con los H+ procedentes del HCl para formar ms AcH.
Si aadimos una base fuerte (NaOH), los iones OH- consumen rpidamente los H+
del sistema para formar agua, con lo que el equilibrio de disociacin del cido se
desplaza hacia la derecha para restaurar la concentracin inicial de protones.
3.
Por qu es importante cuantificar el tiempo de respuesta de cada
instrumento?
Es importante medir el tiempo transcurrido entre la aplicacin de una funcin
escaln y el instante en que el instrumento indica un cierto porcentaje del valor final.
Para instrumentos con aguja indicadora, el tiempo de respuesta es aqul que tarda
la aguja en estabilizarse aparentemente, lo cual ocurre cuando ha llegado a un
porcentaje determinado de su valor final.
4.
Adems de las 4 variables enumeradas anteriormente, menciona otras tres
que sean importantes monitorear y cuantificar durante la fermentacin.
La concentracin de CO2, composiciones de mezcla de salida, Conductividad,
Concentracin de biomasa, Morfologa, Composicin de Biomasa, Concentracin
de enzimas, Viabilidad, entre otras.
ANEXOS.
Anexo 1. PREPARACIN REACTIVO DNS (100 mL).
A. Disolver 2g de NaOH en 100 mL de agua destilada en agitacin.
B. Agregar 2g de cido 3,5-dinitrosaliclico.
C. Agregar 40g de tartrato sdico-potsico tetrahidratado.
D. Agregar 0.4g de fenol.
E. Agregar 0.1g de sulfito de sodio.
F. Aforar hasta 200mL.
G. Guardar en oscuridad.
Anexo 2. MTODO DE MILLER (Consumo de Sustrato)
A. 100 L sol. Problema + 300 L DNS.
B. Bao Mara por 5 min y enfriar por 10 min.
C. Aforar hasta 1 mL (600 L agua destilada).
D. Agitar en vrtex.
E. Leer absorbancia a 540 nm.
F. Obtener ecuacin lineal.

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PRCTICA 6: CULTIVO POR LOTE Y LOTE ALIMENTADO

Anexo 3. MTODO DE KUNITZ MODIFICADO (Cuantificacin de proteasas).


A. 2 mL de solucin libre de clulas + 2 mL de albmina 1%.
B. Incubar a 40C por 10 minutos.
C. Agregar 2 mL de cido actico 1 M.
D. Centrifugar 1 mL de muestra por 10 minutos a 10,000 rpm.
E. Leer absorbancia a 280 nm.

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