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..

,
.. ,
..

-

2008

- -
14 2008 ., 6

, ..

-
- .
3 4 .

020201


1. . .......................... 5
I. . .............................. 6
1. -
. ..............................................
2.
. ..........................................................................................................
3. (-) .
4.
QIAEX II. ........................................

9
11
12
13

II.
. .................................................................................. 14
5. . ........................... 15
6. . ................... 16
7.
. ........................................................................................ 18
2. . ....................................
I. . ........................................................... 19
8.
M-MuLV Reverse Transcriptase. ...............

22

II. . .................................................. 23
9. . ......... 26
III.
(Real-Time PCR). ......................................................................................... 28
10.
SYBR Green. ............................................................................................... 34
11.
Taqman. ........................................................................................... 36
12. . .................................................................. 37
IV. . ......................................... 41
3

13. -11-dUTP
..............................
14. -11-dUTP
. ..........................................
15. . .....................
16.
. .................................................
17. -- - . ......

44
45
46
48
49

V. . ...................... 49
18. . ..................................
19.
. ...................................................................................
20. ( ). ..................
21.
- (-). .............................
22.
. ...................................................................
23.
. ...............................................................................

56
57
58
60
61
61

1.

()
, , ,
. ,

,
,
.
- .
, ,
, .
.
, , ,
. () .
.
, . (
5

) (
, . .).
.
,
. ,
. , ,
.

I.
.
, . ,
,
, .
,
, . .
- . , - , . , 6

,
.

. .
, .
pH 78, , . ( < 5), ,
, . . pH,
,
, .
, .
(K, Na, NH4)
. ( )
. LiCl , , . LiCl
, , . ,
,

.
7

. 1.
-
,
( , , .).
( , , . .),
.
poly- , .

2.

1. -

1. D (4M ,
30 M , 30 M -, pH 7.07.5).
9

2. . . 1/5 : (24 : 1)
. 4 1 .
.
3. 4 30 .
() .
4. 1 2 96 % .
RT
10 .
5. 80 % . !!!
6. 100 .
12 LiCl 30 20 .
7. 15 . 0.8 80 % .
8. , , 40 , .
9. .
:
1) 1/5 D.
, , .
2) . ,
,
.
3) , 0.1 3 2.5 96 % . 20 C.
10

2. B
1. .
2. 65
2x CTAB ( 25 2x CTAB (CTAB - 2% (w/v), 1.4M NaCI,
0.1 Tris-CI, pH 8.0, 20mM , d2) 25 ),
.
3. 65 20 ( 1 ).
4. , : (24 : 1),
20 .
5. 5 000 rpm 10 .
6. , 0.2 5x CTAB (CTAB
5 % (w/v), 350mM , d2), 65 10 .
7. : , 1 , .
8. 5 000 rpm 10 .
9. (CTAB
1 % (w/v), 0.05 Tris-CI, pH 8.0, 10mM , d 2 )
( 23 ), 1 .
10. 8 000 rpm 20 .
11. 12 HS-TE (1M NaCI, 0.01 TrisCI, pH 8.0, 1mM , d2); 2 96 % 1 20 30 70 .
12. 8 000 rpm 4 10 .

11

13. 200 H2O 100 7.5M


NH4Ac (pH 7.5) 20 0 .
14. 13 000 rpm 4 10 , 2 96 % 20 70 .
15. 13 000 rpm 4 10 ,
80 % ;
16. TE dH2O;
17. 20 .
:
1) ,
. .
2) .
1 CTA .

3. (-)
1. 10 12 000 rpm
4 10 . 10 (15 -HCI
8.0, 0.45 , 8 ), 80 (50/) 15 .
2. 5 6 000 rpm 4 . 0.5 (10 -HCI 8.0,
10 NaCI, 1 , 1.5 % (w/v) SDS).
5 37 , .
3. 250 , . 10 .

12

4. . 1 96 % .
30 70 .
5. 15 4 . 70 % .
6. (40100 ) 2.
70 .
:
1) , , .
2) DEPC-, .
3) 96% 20 ,
11.5 .

4. QIAEX II.
1. , 3
QX 1.
2. QIAEX II 30 . 1030
QIAEX II. .
3. 10 50 . 2 .
4. 30 12 000 rpm, .
5. 500 QX 1 .
30 , .
6. 500 PE. .
30 12 000 rpm, .
13

7. 1015 . 3040 d2
.
5 .
8. 30 12 000 rpm. .
9. . 9 10. .
10. 20 .
:
1) . ,
, .
2) PE .
100 20 PE
80 96% .
3) . 7 ,
,
.

II.
(
) 260 (. 3). ,
260 .

14

. 3.
5.
40 ( 5 195 ). 260 1 , .
(/) ,
260 = 20 ( ).
[] = 260
10 ( 20
180 ). 260
1 , . (/) ,
260 = 4 (
).
[] = 260
15

6.
260 280
(260280 ) . , 260 / 280
1.8 2.8 .
260280 , , 280 .

260/280 = 1.8

260/280 = 2.8

260230 .
1.8 2.2.
260/230 , .

1.8

260
2.2
230

. . ( ) , .

, , .

16

( , SYBR Green I). ( ) .


. , 20 %
, .
,
.
SYBR Green I.
, . , .

. 4.
SYBR Green I
17

, . .
1


%

[kbp]

0.3

0.5

0.6

560

130

120

0.7

0.8

0.8

0.6

12

10

0.9

1.0

1.2

1.5

0.58

0.57

0.46

0.23

7.

1. (
).
2. 1 ( 50 (2 Tris-HCI, 5.71 %
, 2 ED, 8.5).

3. , .
4. 5060 o ( ), 0,1 %.
5. , 0.51 .
6. ,
(0.1% , 0.1% , 60%
, 60 ).

7. 610 1 .
18

:
1) ~2 , , ,
SaranWrap, ( ; < 1%
).
2) (50: 1 -HCI, 0.9 , 1 , 8.5), .

2.
I.
, , ,
.
(, )
, -
( ). ,
(..
, /-). ,
. In vivo ,
-.

. 1970.

(), ().
19

,
, , () (RNAsin).
.

oligo(dT) ( ), ,
3- - , oligo(dT) .

. 5.
oligo(dT)
20


(random hexamer).

,
.

. 6.
random hexamer

, .

.
21

. 7.

8. M-MuLV Reverse Transcriptase

1. 11 ,
:
a. : 0.15 ; 10
0.5 ; 0.01 0.5 .
b. : oligo(dT) 0.5 ; random hexamer 0.2 ;
1520 .
c. 11 .

22

2. 70 5 .
3. :
a. 10 2 ,
b. 10 2 ,
c. 20 .,
d. 19 .
4. 37 5 .
random hexamer, 25 5 .
5. 200 . M-MuLV Reverse Transcriptase,
, oligo(dT)
3742 60 . random
hexamer, 25 60 .
6. 70 . .
:
1)
. ,
, .

II.
() () .

23

Taq--.
Thermus aquaticus, 40 95 7072.
, . , Taq-, (2030 )
, . : 1)
, 2)
, 3)
- - .
, . - ,
.
3 . 95
.
() ( ).
5862.

72

Taq--

, . 24

, ().
. , :

= 2n , n .
3040 100 .
, .

. 8. : 1
96 C; 2 68 oC; 3 72 oC; 4
. (P Taq--).
. ,

25

, :
1) : dATP, dGTP, dUTP, dCTP, ;
2) : Taq-- Mg- , ;
3) Taq--: ,
-;
4) : ;
5) :

(2040 ), -;
6) -: ,
- .

9.

1. .
2. :

26


10 -
10
1 (50 )
2 (50 )
Taq--
25 MgCI2
-


1
0.2
1
1
1.25 .
14
0.11


50
5
1
1
1
0.5
25

50

3. . (2040 ) .
4. - .
:
1) -, . 95 oC 3 .
, . .
2) 2535.
PCR : ( , ), ( ,
).
3)
,
.
4) :
a) , Taq-. 20 o
, 4 o ;
b) , . 70 o 20 o , 4 o .
27

c) , . 70 o 20 o ,
4 o . - Taq-.
5) ,
:
20 o. , ;
(~4 o) .

III.
(Real-Time PCR)
,


. -,
, , .
. .
,
,
, .. . .

: ,
, . , 28

.
23 .

- .
2 .
, , ,
, , .
1. Taqman. -,
5-
3-, 3-.
. ,
3- -.
-
, , ,
.
5- . ,
, .
, .

29

. 9. -
Taqman. .

2. (Molecular Beacons).
,
56 ,
. , .
, (
) , . 5- Taq-, ,
, . . -

30

,
- .

. 10. -
Molecular Beacons. .

3.
(Light Cycler). 2 . ,
-.
, 3`-
, , 5`- , , 31

15 .
- , . , .

. 11. -
(Light Cycler).
-. -


, , . , SYBR Green I/II SYBR Gold.
,
SYBR Green I SYBR Gold 32

(. . 4). SYBR
Green I SYBR Gold
.

. SYBR Green I . ,
, (-, )
. -
. , , , , ROX.
,
- . ,
, .
, ()
, . - ()
, - () .
, . ,
, ,
. ,
,
, . , 33

, . .

. 12.
. Tm 1 Tm 2 .
-,
.

, .
10.
SYBR Green

1) .
2) :
34


10 -
10
1 (5 )
2 (5 )
SYBR Green
ROX
Taq--
25 MgCI2
-


1
0.2
0.1
0.1
1.25 .
5
0.11


50
5
1
1
1
0.125
0.26
0.5
10

50

3) . -
:
1.

95 . .

2.

95 30 .

3.

6065 2030 .

4.

7072 1 .

5.

6.

( 2 5) 3040 .

7.

60 C
95 C 0.2 C.

:
1) SYBR Green , .
2) , ,
. , 1520
.
3) SYBR Green, , C(T)
3538, 40 .
4) SYBR Green -.
35

11.
Taqman

1) .
2) :

10 -
10
1 (5 )
2 (5 )
TaqMan
Taq--
25 MgCI2
-


1
0.2
0.1
0.1
0.25
1.25 .
3.5
0.11


50
5
1
1
1
1
0.5
7

50

3) . -
:
1.

95 10 .

2.

95 15 .

3.


60 1 .

4.

5.

( 2 4) 4045 .

:
1) - (Pfu, Pwo .), 6072 .
2) (
-, ).
36

12.

. ,
( ). ,
, ,
,
, . : , (
, CT), . CT
.

, .
, , . CT , , .
CT, , CT

.
,
CT.

37

, CT .
,
CT CT.

,
,
. , CT
.
:
1. .
2. .

C(T) log P0 -,
(P0) .
, (,
, )
. :
1.

.
2.

.
3.

.
38


,
. ,
, .


C(T) = (1/log E) * log P0 + log PC(T)/log E

(1)

, E 1 2,
R = P1/P2 = E (C(T)1C(T)2) = E -

(T)

(2)


REF (, ,
housekeeping gene (, )).
REF Eref.
R=E

(T)

/ Eref

(T)

ref .

(3)


, :
R=E

(T)

/E

(T)

(T)

ref

ref = E

(T )

(4)

, , , 2, :
R= E

(T)

ref -

(T)

~2

(T)

ref -

39

(T)

= 2-

(T )

(5)

- REF , ,
, .
house-keeping genes.

. 13. -
( )

40

IV.
1961 , : 100 ,
65 . .
, : , , .
, , . , . ,
, -. 15
1000 .
: , , . - : , , ,
. .
1975 . , .
. . , . , , .
41

.
. 80 .
, . .
.

. 14.
42

, , -.
,
, . .

( () ) ( () ).
,
, . (DMB-), ( , .)
.

. -. ,
. . ,
,
. , ,
.
-
:
1) . -
( 20 ), 43

- .

- (), . , ,
. .
2) .
, , . , , ,
. , 30 ,
-.

13. -11-dUTP

1) .
2) :

25

4.0
2.5
1
1
0.52.5 .
0.020.15
3.5
25

-11-dUTP 1/3
10 -
1 (50)
1 (50)
Taq-
-
25

44

3)
:
1.

94 1 ;

2.

94 10 ;

3.

3768 10 ;

4.

72 1060 (
);

5.

( 2 4) 40 .

6.

72 3 .

14. -11-dUTP

1. :
(50-100 )

5.0 ,

10

2.5 ,

2.5 ,

6.0 .

2. .
3. 510
. .
4. :
-11-dUTP 8.0 ,
-: 1.0 0.5 .
5. 37 45 .
45

6. 1 0.5 8.0.
7.
20 . .
(25 ) 8 7 , 100 , 30 70 2
20 .
8. 12 000 / 10 , 70 % , .
:

1) ,
37 (~22 ).
( ) .
2) ,
.
3) , . 4 2.

15.

1. .
2. (1,5 NaOH, 0,5 NaCI)
30 ,
(1,5 -I, 0,5 NaCI, pH 6,5) 30 .

46

3.
6 SSPE 5 .
4. , . 20 SSPE (1,5 -I, 0,5 NaCI, pH 6,5):
H2O;
0.4N NaOH ~30 ;
:
* 3 3MM ;
* 2 3MM ;
* Hybond N+ ( + 35 mm c );
* 4 ;
* ;
0.4M NaOH
, NaOH;
( ), 0.4M NaOH;
() ,
3MM, ;
0.4M NaOH, ( );
3 3MM ( 0.4N
NaOH), , (~300
10 10 2 );

5.
. 20 SSPE 1 .
6. , (
) 5 - (254 ).
7. .
42 10
3060 .
47

8. - 2 SSPE, 0,1% , 5
.
9. .
:
1) , Mg2+ (
~1 Mg2+). 100
6 MgCl2.

16.

1. 2 SSC
. .
2. 30
(0.1 1 2 ). : 5% , 0.1% Tween 20, 150
NaCI 50 .

3. 2 SSC .
4. -
(0.1% Tween 20 50 ) 1 : 3000
(0.1 1 2 ). +4
12 .
5. 30
.
6. , 2
15 2 SSC .
7. (0,1 -HCI 7.6, 10
MgCI2, 10 ZnCI2, 0.1% -100) 2 .
48

8. (0.1 ( 0.1 (. . 7) 0.7


1 () 0.35 2 (5--4--3- )) 1 2 ).

9.
.
:
1)
, .
, .
, 30 3 ( +37 , ).
2) ,
;
, ;
.

17. -- -

1.
.
2.
5 .
3. 1020 - 300 (1,5 NaOH, 0,5 NaCI).
.

49

4. . ,
1 .
5. , (
) 5 (254 ).
6. 20 SSPE (3 NaCI, 200 NaH2PO4xH2O, 20
) 5 .

7.
.

V.

().
,
.
. . ()
, . .
,
,
. - . 50

( ).
. , () .
, .
.

,
.
(), . .
(, EcoRI ,
Escherichia coli). -

, . . , 5'3' .
EcoRl 5'-GAATTC-3'. EcoRI G .
(), . , ,
.
.
, , (Sma I, EcoR V .).
,
, .
51

1. . . , .
,
. , , . -.

. 15.

2. . -, ,
.
, .
- , 3' . 3'- in vitro
52


oligo(dA)- ,
oligo(dT)- ,
oligo(d)-
oligo(dT)-. -.
3. . , , , ,
, ( ). , . . .
S1, , ,
- I .
. : (F-); (R-) , ( ). , ,
- ( ; . cryptic
, ). 1
500 ... (ori), 53

- .
10100 ; . 1
4 .

. 16. pGEM-T.


,
: 1) , . coli 15 ...; 2) , ; 3)
, .
- ( , . coli). .
, . .
. , , .
54

. 17.

, .
.
.

55

18.

1. . 37 o 1012 .
2. (1012) ~23
40 (2% , 0.5% ,
10 NaCI, 10 KCI).

3. (200300 rpm)
37 o OD600 = 0.6.
!!!

4. 50 30 , 1015 .
5. 2 000 rpm 4 oC 10 ,
.
6. 10 (10 HEPES 6.7,
55 MgCI2, 15 CaCI, 250 KCI). 1015 .

7. 2 000 rpm 4 oC 10 ,
.
8. 2 (. . 6), DMSO
3.5 %. 1015 .
9. 100 2 . . 70 o.
:

1)

37 o ( ) . 18 o
.

56

2)

PIPES TB HEPES BES. .

3)

DMSO ( ), .

4)

45 .

19.

1) ( ) 50 /.
a) . :
. ,
: 1 : 1 1 : 3. , .
() (kb)
(kb)

= ()

b) : ,
:

100 ,

50 ,
10 (50M -HCI (pH 7.8 25 C);
10M MgCI2; 10M TT; 1M AT;
1 ,
25 / )
4 -
1 .,

10 .

57

c) 16
3040 .
2) 0.5 M -
.
3)

0.5M

- 2 ;
4) 0 oC 2060 .
5) , , 42 oC. 30 .
6) 2 .
7) 400
(2% , 0.5% , 10 NaCI, 10 KCI).
8) , 37 o 30 .
9) 50 ( 100
0.1 IPTG 20 xGal (50 /)). 1012

37 .
10) . , , , . ,
.
11) : N ,
= N 106 [/].
:

1) 4050 .
2)
, ~10 .
58

20. ( )

1. 1.5 1.7 , 30 10 000 rpm, ( ).


2. 200 (25 - HCI 8.0,
50 , 10 ), .

5 .
3. 400 (0.2 NaOH, 1% ),
, , ~5 . 0 o 5 ( !!!).
4. 200 10 AcONH4, ~5 .
0 o 5 .
5. 12 000 rpm
5 .
6. 500 , . 10 .
7. 12 000 rpm
5 .
8. 100 2 AcONH4, 20 .
5 .
9. 12 000 rpm
5 ., 100 .
10 .
10. 12 000 rpm
10 , 70 % , . .
11. 25 (H20 TE ).

59

1) , .

2) , ,
. , .

21.

(-)

1. . 25 STE (10 -HCI 8.0, 10 NaCI, 1 ).


2. 25 : : 25 : 24 : 1.
3. 1 . 12 000 rpm 20 .
4. .
12 000 rpm 10 .
5. -.
:
1) 96 %
. 5.

60

22.

1. ,
,
, EcoR I.
2. :
10 EcoR I

EcoR I

1,5 .
1 .
1 .
15 .

3. 37 30 . 65 20 .
23.

1.
13, .
2. ,
.
3. 13,
:

1) 95 3 .
2) 95 30 .
3) 50 30 .
4) 72 40 .
5) . 2. . 4. 30 .
6) 72 3 .
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