18

3 METODOLOGI

3.1 Waktu dan Tempat

Penelitian dilakukan pada bulan September 2011 sampai Desember 2011
bertempat di Laboratorium Atsiri, Pusat Penelitian Kimia, Lembaga Ilmu
Pengetahuan Indonesia (LIPI), Kawasan PUSPIPTEK, Serpong, Propinsi Banten;
Laboratorium Biokimia Hasil Perairan, Departemen Teknologi Hasil Perairan,
Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan; Laboratorium Kimia Pangan, Departemen
Ilmu dan Teknologi Pangan, Fakultas Teknologi Pertanian; dan Laboratorium
Terpadu, Institut Pertanian Bogor.

3.2 Bahan dan Alat

Bahan utama yang digunakan adalah minyak ikan hasil samping dari
pengalengan lemuru yang berasal dari perusahaan pengalengan ikan PT. X, di
Banyuwangi-Jawa Timur yang diambil pada bulan Oktober. Bahan-bahan dalam
ekstraksi meliputi pelarut gas CO2 teknis dengan kemurnian 90%. Bahan untuk
penyaringan minyak ikan, yaitu kertas Whatman 40. Bahan-bahan untuk analisis
asam lemak, yang meliputi 1 ml larutan standar, 1 ml 0,5 N NaOH dalam
methanol, 2 ml BF3 20%, 2 ml NaCl, 1 ml isooctane, dan 0,1 g Na2SO4 anhidrat.
Bahan-bahan untuk analisis bilangan asam dan kadar asam lemak bebas meliputi
KOH 0,1 N, 25 ml alkohol netral 96%, indikator fenolftalein. Bahan-bahan untuk
analisis bilangan penyabunan adalah 50 ml KOH, indikator fenolftalein, aquades,
HCl 0,1 N. Bahan-bahan untuk analisis bilangan peroksida adalah 30 ml pelarut
(60% asam asetat dan 40% pelarut), 30 ml aquades, Natriumthiosulfat 0,02 N,
1 gram KI.
Alat utama dalam proses ekstraksi asam lemak omega-3 minyak ikan
adalah satu unit Supercritical Fluid Extraction (SFE) Model 46-19360 dari
Superspressure-hydrodynamics, Newport Scientific Inc.AMINCO, USA dengan
kapasitas ekstraktor 0,845 liter dan separator 0,3 liter, serta tekanan maksimum
9200 psi yang berada di Pusat Penelitian Kimia, LIPI, Serpong (spesifikasi
lengkap

pada

Lampiran

1).

Alat

untuk

analisis

lemak

berupa

Gas

Chromatography (GC) Shimadzu Model GC 2010 plus dengan kolom

18

19

cyanopropil methyl sil (capillary column), dimensi kolom p = 60 m, dalam =

0,25 mm, 0,25 m film thickness, laju alir N2 20 mL/menit, dan laju alir H2 30
mL/menit. Alat untuk penyaringan minyak ikan sebelum dilakukan ekstraksi
berupa vakum Buchner. Peralatan untuk analisis lainnya antara lain neraca
analitik, erlenmeyer, tabung reaksi, hot plate, buret, pipet gondok, pipet tetes,
bulb.

3.3 Metode Penelitian

Tahapan pelaksanaan penelitian dilakukan meliputi, (1) preparasi sampel
minyak ikan hasil samping pengalengan lemuru mengacu pada penelitian Setha
(1996) dan Boran et al. (2006), (2) analisis mutu minyak ikan sebelum ekstraksi
dengan fluida CO2 superkritik, dengan parameter uji yang mengacu pada Celik
(2002) tentang minyak ikan komersial, IFOMA (International Fishmeal and Oil
Manufacturers Association) tentang standar minyak ikan untuk konsumsi, serta
penelitian Dewi (1996) dan Estiasih et al. (2005) untuk perbandingan hasil
ekstraksi asam lemak omega-3 minyak ikan, (3) proses ekstraksi asam lemak
omega-3 minyak ikan dengan fluida CO2 superkritik mengacu pada penelitian
Lopes et al. (2011) dengan modifikasi, (4) analisis konsentrat asam lemak
omega-3 beserta kandungan asam lemak omega-3, dengan parameter uji mengacu
pada IFOMA.
3.3.1 Preparasi sampel minyak ikan hasil samping pengalengan lemuru
Sampel yang digunakan dalam penelitian ini merupakan minyak ikan hasil
samping pengalengan ikan lemuru yang baru diambil dari proses pengalengan
tahapan pre-cooking pada bulan Oktober. Minyak ikan dimasukkan dalam wadah
(jerigent) yang tidak tembus cahaya dan tertutup rapat, lalu dimasukkan dalam
boks sterofoam. Minyak ikan sebelum digunakan disaring menggunakan kertas
Whatman 40 dengan vakum Buchner. Hasil saringan, kemudian ditaruh pada
wadah yang tidak tembus cahaya. Ketentuan preparasi sampel mengacu pada
penelitian Setha (1996). Sedangkan pencegahan terhadap oksidasi dilakukan
penyimpanan sampel minyak ikan dengan cara menyimpan sampel di freezer
(atau suhu di bawah 0 oC) (Boran et al. 2006).

19

20

3.3.2 Analisis mutu minyak ikan sebelum ekstraksi dengan fluida CO2
superkritik
Analisis mutu minyak ikan dilakukan untuk mengetahui kondisi awal
bahan baku minyak ikan hasil samping pengalengan ikan lemuru yang akan
digunakan dalam proses ekstraksi dengan teknologi fluida CO2 superkritik.
Analisis yang dilakukan meliputi bilangan asam dan asam lemak bebas (AOAC
1995), bilangan penyabunan (AOCS Cd 3-25 1997), dan bilangan peroksida
(AOAC 1995). Parameter yang dianalisis ini mengacu pada Celik (2000), yaitu
bilangan asam (10,15 mg KOH/gr), asam lemak bebas (4,6%), bilangan
penyabunan (187,4 mg KOH/gr), serta mengacu pada IFOMA (International
Fishmeal and Oil Manufacturers Association), yaitu asam lemak bebas (1-7%),
dan bilangan peroksida (3-20 meq/kg).
Kandungan asam lemak omega-3 yang terdapat dalam minyak ikan
sebelum diekstraksi dilakukan analisis asam lemak omega-3 menggunakan Gas
Chromatography (GC) (AOAC 1984 butir 28.060/GC). Hasil analisis asam lemak
yang diperoleh dibandingkan dengan penelitian Dewi (1996), yaitu kandungan
omega-3 (29,68%) dengan EPA (15,15%) dan DHA (11,36%), serta penelitian
Estiasih et al. (2005) dengan EPA (11,71%) dan DHA (9,11%).
3.3.3 Proses ekstraksi asam lemak omega-3 minyak ikan dengan fluida CO2
superkritik
Proses ekstraksi asam lemak omega-3 minyak ikan dengan fluida CO2
superkritik dilakukan dengan tahapan sebagai berikut :
1. Kondisi sampel sebelum ekstraksi
Sampel yang akan digunakan untuk proses ekstraksi, yaitu minyak ikan
yang sudah disaring dengan kertas Whatman 40 (Setha 1996), dan disimpan pada
wadah yang tidak tembus cahaya dengan suhu di bawah 0 oC (Boran et al. 2006).
2. Penentuan tekanan dan suhu ekstraksi
Proses ekstraksi asam lemak omega-3 minyak ikan lemuru dengan fluida
CO2 superkritik terdiri dari tiga tahap, yaitu tahap persiapan, tahap proses dan
tahap flushing. Skema unit alat ekstraksi fluida CO2 superkritik terdapat pada
Lampiran 2. Prosedur operasional standar ekstraksi dengan fluida CO2 superkritik
dapat dilihat pada Lampiran 3. Jumlah bahan baku minyak ikan yang dimasukkan

20

21

setiap ekstraksi sebanyak 200 gram. Kondisi proses ekstraksi dijaga kestabilannya
dan dicatat setiap 15 menit.
Proses ekstraksi asam lemak omega-3 minyak ikan dengan fluida CO2
superkritik dilakukan dengan 2 variasi tekanan dan suhu ekstraksi, yaitu tekanan
3500 psi dan 4000 psi serta suhu 40 oC dan 50 oC yang mengacu pada penelitian
Lopes et al. (2011) dengan modifikasi. Tekanan dan suhu pemisahan atau separasi
setelah proses ekstraksi adalah tekanan 500 psi dan suhu 30 oC. Lama proses
berlangsung 4 jam, pada laju alir 5,5 liter/menit yang mengacu pada penelitian
Rizvi (1999) dan Utami (2004). Kondisi proses ekstraksi asam lemak omega-3
minyak ikan lemuru dengan fluida CO2 superkritik dapat dilihat pada Tabel 7.
Tabel 7 Kondisi proses ekstraksi asam lemak omega-3 minyak ikan lemuru
dengan fluida CO2 superkritik
TE (oC)

PE
(psi)

40

50

3500

U1

U2

U1

U2

4000

U1

U2

U1

U2

Keterangan

PS

TS

(psi)

(oC)

500

30

PE : Tekanan Ekstraktor
PS : Tekanan Separator
U : Ulangan

Laju alir CO2

Waktu
Proses

5,5 liter/menit

4 jam

TE : Suhu Ekstraktor
TS : Suhu Separator

Konsentrat asam lemak omega-3 minyak ikan lemuru hasil ekstraksi

dimasukkan dalam wadah botol gelap yang tidak tembus cahaya dan tertutup
rapat. Kemudian disimpan pada suhu di bawah 0 oC sampai dilakukannya analisis.
3.3.4 Analisis konsentrat asam lemak omega-3 beserta kandungan asam
lemak omega-3
Analisis konsentrat asam lemak omega-3 meliputi analisis asam lemak
dengan Gas Chromatography (GC) (AOAC 1984 butir 28.060/GC) untuk
mengetahui kandungan asam lemak omega-3, analisis asam lemak bebas (AOAC
1995), dan bilangan peroksida (AOAC 1995). Parameter yang dianalisis mengacu
pada IFOMA (International Fishmeal and Oil Manufacturers Association)
tentang standar minyak ikan konsumsi.

21

22

3.4 Prosedur Pengujian

Pengujian yang dilakukan pada penelitian ini untuk menguji mutu minyak
ikan sebelum ekstraksi dengan fluida CO2 superkritik dan analisis konsentrat asam
lemak omega-3 minyak ikan hasil ekstraksi dengan fluida CO2 superkritik.
Analisis mutu minyak ikan hasil samping pengalengan lemuru meliputi analisis
asam lemak, analisis bilangan asam dan asam lemak bebas, analisis penyabunan,
dan analisis bilangan peroksida. Analisis konsentrat asam lemak omega-3 minyak
ikan hasil ekstraksi meliputi analisis asam lemak, analisis asam lemak bebas dan
analisis bilangan peroksida. Selain itu juga dilakukan perhitungan rendemen dan
solubilitas konsentrat asam lemak omega-3 minyak ikan hasil ekstraksi.
3.4.1 Rendemen (Sahena et al. 2010)
Rendemen

konsentrat

asam

lemak

omega-3

ditentukan

dengan

membandingkan bobot (g) hasil ekstraksi yang diperoleh terhadap bobot (g)
minyak ikan yang digunakan dikalikan 100%.
Rendemen (%) =

3.4.2 Solubilitas (Sahena et al. 2010)

Solubilitas konsentrat asam lemak omega-3 dalam CO2 ditentukan dengan
rumus sebagai berikut :
Solubilitas (g/kg CO2) =

3.4.3 Analisis total asam lemak omega-3 (AOAC 1984 butir 28.060/GC)
Sebanyak 20-30 mg contoh minyak ditimbang dalam tabung bertutup
teflon. Lalu ditambahkan 1 ml NaOH 0,5 N dalam metanol dan dipanaskan dalam
penangas air selama 20 menit. Selanjutnya ditambahkan 2 ml BF3 20%,
dipanaskan lagi selama 20 menit. Setelah dingin, kemudian ditambahkan 2 ml
NaCl jenuh dan 1 ml isooctane dikocok dengan baik. Lapisan isooctane
dipindahkan dengan bantuan pipet tetes ke dalam tabung yang berisi sekitar 0,1 g
Na2SO4 anhidrat, dibiarkan 15 menit. Fase cair dipisahkan dan selanjutnya
diinjeksikan ke kromatografi gas.

22

23

Kandungan komponen asam lemak (%) =

Ax x Cstandar x Vcontoh x 100 %

As

100
gram contoh

3.4.4 Bilangan asam dan kadar asam lemak bebas (AOAC 1995)
Prinsip bilangan asam dan asam lemak bebas adalah pelarutan contoh
lemak atau minyak dalam pelarut organik tertentu (alkohol netral 96%)
dilanjutkan dengan penitaran dengan basa (NaOH atau KOH). Contoh yang akan
diuji, ditimbang sebanyak 5-10 gram di dalam erlenmeyer 250 ml, lalu ke dalam
contoh ditambahkan alkohol netral 96% sebanyak 25 ml dan dipanaskan sampai
mendidih. Larutan ditambahkan 2 tetes indikator PP, kemudian dititrasi dengan
larutan KOH 0,1 N hingga berwarna merah muda (konstan selama 15 detik).
Bilangan asam (mg KOH/gram sampel) =

Kadar asam lemak bebas (%) =

Keterangan :
V

= Volume KOH untuk titrasi contoh (ml)

= Normalitas larutan KOH

= Bobot molekul asam dominan (asam oleat 282)

= Bobot contoh (gram)

56,1

= Bobot molekul KOH

3.4.5 Bilangan penyabunan (AOCS Cd 3-25 1997)

Prinsip bilangan penyabunan adalah asam lemak terikat (trigliserida) dan
asam lemak bebas (FFA) bereaksi dengan basa (KOH/NaOH) membentuk sabun,
gliserol dan air.
a. Timbang sampel minyak sebanyak 1-2 g. Tambahkan 50 ml KOH
beralkohol dengan menggunakan pipet kering
b. Siapkan blanko dengan cara yang sama, tetapi tidak menggunakan lemak
atau minyak

23

24

c. Sambungkan ke kondensator dan didihkan dengan perlahan hingga seluruh

sampel tersaponifikasi. Untuk sampel yang bersifat formal biasanya proses
ini membutuhkan waktu selama 1 jam.
d. Setelah labu dan kondensor mendingin, tetapi belum berubah bentuk
menjadi gel, cuci bagian dalam kondensor dengan menggunakan akuades.
Lepaskan kondensor, tambahkan 1 ml indikator fenolftalein dan titrasi
dengan menggunakan HCL 0,5 N sampai warna merah muda menghilang.
Tulis volume HCL 0,5 N yang dibutuhkan untuk titrasi.
Bilangan penyabunan (mg KOH/g sampel) =

Keterangan :
B

= Volume HCL 0,5 N untuk titrasi blanko (ml)

= Volume HCL 0,5 N untuk titrasi contoh (ml)

= Normalitas larutan HCL

= Bobot sampel

3.4.6 Bilangan peroksida (AOAC 1995)

Analisis bilangan peroksida dilakukan dengan menimbang 5 gram contoh
dalam Erlenmeyer 250 ml kemudian ditambahkan 30 ml pelarut (60% asam asetat
dan 40% kloroform) dan dikocok sampai sampel larut. Selanjutnya ditambahkan
0,5 ml KI jenuh kemudian didiamkan selama 2 menit di ruang gelap sambil
sekali-kali dikocok. Tambahkan 30 ml aquades, kemudian titrasi dengan
Natriumthiosulfat 0,01 N. Perhitungkan sebagai berikut :
Bilangan peroksida (meq/kg) =

Analisis terhadap blanko dilakukan dengan cara yang sama. Sampel diganti
dengan akuades sebagai blanko.

3.5 Rancangan Percobaan

Rancangan percobaan yang digunakan adalah Rancangan Acak Lengkap
Faktorial, yakni menunjukkan pengaruh perlakuan tekanan dan suhu ekstraksi,
24

25

serta interaksi keterkaitan antara tekanan dan suhu ekstraksi . Setiap interaksi
perlakuan yang digunakan dalam penelitian ini adalah 2 kali ulangan. Model
Rancangan Acak Lengkap Faktorial adalah sebagai berikut (Steel dan Torrie
1991) :

Yijk

= + i + j + ()ij + ijk

Keterangan :
Yij

= Pengamatan pada satuan percobaan ke k yang memperoleh kombinasi

perlakuan taraf ke i dari faktor dan taraf ke j dari faktor .

= Mean populasi

= Pengaruh taraf ke i dari faktor

= Pengaruh taraf ke j dari faktor

()ij

= Pengaruh taraf ke i dari faktor dan taraf ke j dari faktor

ijk

= Pengaruh acak satuan ke k yang memperoleh kombinasi perlakuan

Data dianalisis dengan menggunakan analisis ragam oneway ANOVA

untuk melihat pengaruh terhadap paramater yang diuji. Apabila hasil analisis
ragam memberikan pengaruh yang nyata (tolak Ho), maka dilakukan dengan uji
lanjut Beda Nyata Terkecil (BNT), untuk melihat adanya perbedaan dari masingmasing perlakuan yang diberikan. Rumus pengujian dengan Uji BNT adalah
sebagai berikut (Steel dan Torrie 1991):
BNT = t (dbs)
Keterangan :
n

= Ulangan

dbs

= Derajat bebas sisa

= 0,05

kts

= Kuadrat tengah sisa

Data hasil rendemen dan solubilitas konsentrat asam lemak omega-3

minyak ikan, kandungan asam lemak omega-3 (EPA dan DHA), kadar asam
lemak bebas, dan bilangan peroksida dianalisis menggunakan program Microsoft
Excel 2007 dan SPSS versi 13.0.

25