Вы находитесь на странице: 1из 6

Колонки EASI-EXTRACT

ZEARALENONE
Хроматографический анализ зеараленона в зерне и кормах с предварительной
иммуноаффинной очисткой

ИНСТРУКЦИЯ ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ Кат. № RP91/RP90N


RP91/V11.doc 09.03.19/09.09.29

Пожалуйста, прочтите внимательно перед использованием!

ОБЛАСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ
Методика предназначена для определения зеараленона и его метаболитов в зерне, кормах и
ингредиентах в соответствии с межгосударственным стандартом ISO 17372:2008. Animal feeding
stuffs -- Determination of zearalenone by immunoaffinity column chromatography and high performance
liquid chromatography

КОМПЛЕКТАЦИЯ
• Кат. № RP91: 10 иммуноаффинных колонок
• Кат. № RP90N: 50 иммуноаффинных колонок

НЕОБХОДИМЫЕ ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ РЕАГЕНТЫ И МАТЕРИАЛЫ

• Дистиллированная или деионизированная вода


• 10 мМ Фосфатный буфер (PBS) или таблетированный фосфатный буфер кат №RP2021.
Для приготовления 10 мМ фосфатного буфера в мерную колбу переносят 1 таблетки фосфатного
буфер кат №RP202. В колбу добавляют 50-60 мл дистиллированной воды и перемешивают раствор
до растворения таблеток. Объём раствора в колбе доводят до 100 мл дистиллированной воды
• Центрифуга на 1600 g
• Лабораторные весы
• Блендер со стаканом, вместимостью 1 л (устойчивый к растворителям)
• Фильтровальная бумага Whatman No. 113 или No. 4 (Кат.№ Р66 и Р67)
• Набор приспособления для иммуноаффинной очистки: 10 цилиндров, 10 адаптеров и 10
шприцов с резиновой пробкой (Кат. № АР011)
• Штатив для иммуноаффинных колонок (Кат. № СR11)
• Стандарт зеараленона (Кат.№ Р441, Р44А1 или Р851)
• Ацетонитрил
• Жидкостный хроматограф высокого давления
• Пипетатор электронный Rota-filler1, или трехходовая груша1

Стеклянная посуда:
− Воронка для фильтрования
− Цилиндр, 100 мл и 500 мл
− Пипетки, 1 мл, 5 мл и 10 мл
− Лабораторные стаканы

1
Поставляется ООО «СТАЙЛАБ» тел./факс (495) 662 64 15, 707 28 68, (499) 256 23 13, тел. (495) 729 17 04,WWW.STYLAB.RU
ВАЖНЫЕ ПРЕДВАРИТЕЛЬНЫЕ ЗАМЕЧАНИЯ

Меры безопасности
Зеараленон принадлежит к высокотоксичным канцерогенным веществам!
Анализ зеараленона следует проводить в лаборатории, оснащенной всем необходимым для
работы с токсичными веществами и растворителями. При выполнении анализа следует надевать
резиновые перчатки, халат и защитные очки.
Колонки содержат 0,01% раствор тимеросола. При попадании раствора на руки или в глаза,
промойте место контакта большим количеством воды

Метанол и ацетонитрил относятся к легковоспламеняющимся растворителям. Емкости должны


быть всегда плотно закрыты. Храните растворители вдали от источников тепла, искр и открытого
пламени. Не курите во время работы.
Метанол токсичен при попадании внутрь! Пары метанола токсичны! Не вдыхайте пары
метанола! Избегайте контакта метанола с кожей.

Деконтаминация
После каждого анализа следует тщательно промывать оборудование и лабораторную посуду для
предотвращения перекрестного загрязнения от пробы к пробе.
Все использованные материалы, жидкие отходы, расходные материалы и лабораторная посуда
должны быть деконтаминированы путем замачивания в течение 30 минут в 5% растворе гипохлорита
натрия с последующим добавлением в раствор ацетона 5% по объему и выдерживанием еще 30
минут. Затем лабораторную посуду следует отмыть обычными лабораторными моющими средствами
и промыть дистиллированной водой.

Хранение колонок
Храните колонки при температуре 2 - 8°С. НЕ ЗАМОРАЖИВАЙТЕ!
Не допускайте высыхания геля. Следите за тем, чтобы гель в колонках всегда был покрыт
буферным раствором. Важно помнить, что антитела, содержащиеся в колонках, могут
денатурировать при резком изменении рН и температуры

Срок годности
Срок годности колонок указан на этикетках. Колонки EASI-EXTRACT ZEARALENONE стабильны в
течение 18 месяцев с даты производства при условии хранения при температуре 2 - 8°С. Колонки
также стабильны при комнатной температуре.

Спецификация
Колонки EASI-EXTRACT  ZEARALENONE могут использоваться не только при анализе
зеараленона и метаболитов зеараленона, но также и при анализе синтетического анаболика
зеранола, схожего по химической структуре с зеараленоном. Зеранол ранее использовался в
животноводстве как стимулятор роста (в виде добавки к кормам или при аппликации) однако в 1991
году был запрещен Евродирективой.

Чувствительность
Чувствительность процедуры анализа зависит от используемой системы регистрации
аналитического сигнала. При необходимости, чувствительность определения может быть снижена с
увеличением объема пробы, пропускаемого через иммуноаффинную колонку

Извлекаемость
При оценке извлекаемости и возможных потерь в результате выполнения всех процедур
методики, рекомендуется использовать в качестве стандарта искусственно загрязненный образец
того же типа, как и анализируемая проба
Полученный процент извлекаемости может в дальнейшем учитываться при корректировке
результата анализа
5

Отбор проб
Отбор проб осуществляют в соответствии с действующей нормативной документацией.
Рекомендуется размолоть как минимум 1 кг отобранной представительной пробы и использовать для
анализа 50 г от размола.

НАЗНАЧЕНИЕ
Зеараленон принадлежит к токсичным микотоксинам, образующимся в результате
жизнедеятельности плесневых грибов рода Fusarium.
Будучи «растительным гормоном», обладающим эстрогенными и анаболическими свойствами,
зеараленон вызывает нарушения репродуктивной функции животных, в том числе - свиней, лошадей,
крупного и мелкого рогатого скота, домашней птицы и грызунов, с клиническими признаками
гиперэстрогенизма, наиболее выраженного у свиней (но также наблюдающегося у коров, лошадей и
овец). С продуктами растительного и животного происхождения зеараленон может попадать также и
в организм человека.
В основе процедуры иммуноаффинной очистки с помощью колонок EASI-EXTRACT Zearalenone
лежит иммунохимическое взаимодействие зеараленона с моноклональными антителами. Метод
иммуноаффинной очистки, в отличие от традиционного метода пробоподготовки, характеризуется
высокой специфичностью, чувствительностью, простотой и экспрессностью. Преимущества
иммуноаффинной очистки обусловили широкое использование колонок EASI-EXTRACT Zearalenone
в практике анализа пищевых продуктов.
Ключевой компонент системы EASI-EXTRACT Zearalenone представляет собой иммуноаффинную
колонку, содержащую суспензию моноклональных антител к зеараленону, его метаболитам и
зеаранолу, ковалентно связанных на гелевом носителе. После экстракции проба пропускается через
колонку, зеараленон, при его присутствии в пробе, взаимодействуют с антителами и удерживается на
колонке. На следующей стадии колонка промывается фосфатным буфером от других компонентов
матрицы. Адсорбированный зеараленон затем элюируется с колонки ацетонитрилом. Чистые
элюаты исследуются методом ВЭЖХ.

ВЫПОЛНЕНИЕ АНАЛИЗА

Приведенная ниже методика рекомендуется для определения зеараленона в зерне и кормах для
животных. В дополнение к основной методике, по запросу предоставляются валидированные
методики, разработанные для анализа других матриц, в том числе:
− зеараленон в кормах (A2-RP91.v7)
− зеараленон в зерне (A1-RP91.v5)
− общие рекомендации по валидация метода (A3-RP91.v1 и A3-RP91.v2)
− зеараленон в мясе

Пробоподготовка

Поместите навеску 25 г измельченной пробы в стакан для блендера, добавьте 125 мл 75%
раствора ацетонитрил/вода. Закройте стакан крышкой и перемешивайте на высокой скорости в
течение 2 минут.
Центрифугируйте полученный экстракт в течение 10 минут при 1600 g или отфильтруйте через
фильтровальную бумагу Whatman No. 113 (рекомендуется увлажнить перед фильтрованием) или No.
4. Сохраните фильтрат.
Смешайте 20 мл фильтрата с 80 мл 10 Мм фосфатного буфера (рН 7,4). Важно забуферить
раствор до рН 7,4 перед иммуноаффинной очисткой. Если наблюдается выпадение осадка после
разбавления, профильтруйте или отцентрифугируйте раствор ещё раз.
Примечание: через иммуноаффинную колонку можно пропустить больший объем экстракта, но
отношение объёма экстракта к объёму буфера должно сохраняться

Подготовка колонки
Перед выполнением анализа колонка должна быть доведена до комнатной температуры.
Убедитесь в том, что колонка не высохла и содержит буферный раствор над поверхностью геля.
Снимите крышку с верхней части колонки, через адаптер подсоедините колонку к стеклянному
цилиндру на 10 мл и установите колонку с цилиндром на стенд (штатив). Нижняя часть колонки
должна быть ещё закрыта пробкой

Сорбция зеараленона на колонке


Снимите пробку с нижней части колонки, внесите раствор в стеклянный цилиндр, присоединённый
к колонке через адаптер. С помощью прилагаемого шприца (из комплекта Кат.№ АР01) или
вакуумного манифольда для твердофазной экстракции пропустите 25 мл разбавленной пробы
(эквивалентно 1 г пробы) через колонку EASI-EXTRACT Zearalenone со скоростью 5 мл/мин
(предпочтителен режим свободного протекания под действием силы тяжести).
5

Для эффективной сорбции зеараленона важно обеспечить медленное и равномерное протекание


раствора через колонку. Чувствительность аналитического определения может быть повышена при
пропускании большего объема пробы через колонку.

Отмывка
Промойте колонку с помощью 10 мл 10 мМ фосфатного буфера, пропустив его через колонку со
скоростью примерно 5 мл/мин. Повторите промывку еще раз. При помощи шприца или вакуумного
манифольда удалите из колонки остатки фосфатного буфера.

Элюирование
Подставьте под колонку чистую виалку темного стекла. Внесите в цилиндр над колонкой 1,5 мл
100% ацетонитрила и подождите, пока элюат медленно вытекает в подготовленную виалку со
скоростью 1 капля в секунду (под действием силы тяжести). Для того чтобы обеспечить максимально
полную десорбцию зеараленона, ацетонитрил должен находиться в контакте с антителами не менее,
чем 30 секунд в течение элюирования. Для этого, с помощью шприца, нужно создать разряжение на
входе в колонку, чтобы элюирующий раствор медленно пошел вверх по колонке. Эту процедуру
нужно повторить трижды. На последнем этапе десорбции пропустите воздух через колонку при
помощи шприца, собирая в виалку, тем самым, последние капли элюата.

Обратный ход при элюировании. Описание процедуры:

При пропускании элюирующего раствора через колонку медленно вытягивайте и


опускайте поршень над цилиндром. Обращение расхода нужно повторить трижды. Таким
образом обеспечивается максимально полная денатурация антител и десорбция
зеараленона с колонки
ПРИМЕЧАНИЕ: адсорбция зеараленона на стекле может приводить к занижению
результатов анализа. Для того чтобы снизить этот эффект, рекомендуется максимально
сократить время между последней стадией иммуноаффинной очистки проб
(элюированием) и анализом ВЭЖХ.

Пропустите через колонку 1,5 мл дистиллированной воды. Суммарный объем элюата,


собранный в виалке, составит 3 мл.

Количественный анализ зеараленона методом ВЭЖХ


Для количественного анализа зеараленона методом ВЭЖХ в петлю инжектора загружается 100
мкл элюата. Концентрация зеараленона в испытуемом растворе определяется при сравнении высоты
пика зеараленона (или площади под пиком) с соответствующей высотой пика (или площади под
пиком), которые наблюдаются при хроматографировании стандартного раствора зеараленона
известной концентрации.

Рекомендуемые условия ВЭЖХ

Предколонка: Inertsil ODS-3


Катридж: 5 мкм, 4 мм х 10 мм (Hichrom) или эквивалент
Аналитическая колонка: Inertsil ODS-3V, 5 мкм, 4.6 мм х 150 мм (Hichrom) или эквивалент
Подвижная фаза Ацетонитрил/вода (60/40)
Подстроить значение рН до 3,2, добавляя уксусную кислоту
(около 12 мл на литр)
Расход подвижной фазы 1 мл/мин
Длина волны возбуждения флуоресценции: 274 нм
Флуоресцентный детектор:
Длина волны регистрации флуоресценции: 455 нм
Термостат: Предколонка и аналитическая колонка термостатируются при 40°С
Интегратор По Вашему выбору
Система инжекции Автосамплер/инжектор Reodyne
5

Приготовление стандарта Внесите в виалку тёмного стекла 75 нг зеараленона (75 мкл


зеараленона стандартного раствора кат № Р44 или Р44А с концентрацией 1000
нг/мл), смешайте с ацетонитрилом до объема 1,5 мл. Добавьте в
виалку 1,5 мл дистиллированной воды. В 100 мкл приготовленного
стандарта содержится 2,5 нг зеараленона
Инжектируемый объем 100 мкл

Приготовление стандартных растворов для ВЭЖХ


А) Стандартный раствор зеараленона может быть приобретен готовым (кат № Р44 или Р44А, 1000
нг/мл),

Б) в сухом виде, например, Кат. № Р85 от R-Biopharm

Для приготовления стандартного раствора зеараленона внесите в виалку с сухим стандартом 10 мл


метанола, закройте крышку виалки и перемешайте на вортексе в течение 30-ти секунд. Полученный
концентрированный стандартный раствор содержит 25 мкг/мл зеараленона. Для приготовления
рабочего стандартного раствора с концентрацией 1000 нг/мл разбавьте концентрированный
стандартный раствор в 25 раз в ацетонитриле

или

В) приготовлен самостоятельно, например Sigma (25 мг, Кат.№ Z2125).

ВНИМАНИЕ: КРАЙНЕ ОПАСНО! соблюдайте предельную осторожность при взятии навесок


микотоксинов для самостоятельного приготовления стандартных растворов.

Возьмите навеску 25 мг стандарта зеараленона. Растворите в 5 мл метанола, осторожно


перемешайте. Оставьте раствор на ночь при комнатной температуре для полного растворения
зеараленона. Вы получили стандартные растворы зеараленона с концентрацией 5 мг/мл.
Раствор хранится при -20ºС в течение двух лет
Для приготовления свежего рабочего раствора зеараленона отберите 25 мкл подготовленного
концентрированного стандартного раствора зеараленона и внесите его в 5 мл метанола. Свежий
рабочий раствор зеараленона необходимо готовить в день выполнения анализа.
Для измерения оптической плотности раствора токсина применяют спектрофотометр с фильтром
на 274 нм, метанол применяют в качестве бланк-раствора. Истинную концентрацию считают как
среднеарифметическое значение:

[зеараленон], мкг/л = оптическая плотность (274 нм) × молекулярная масса × 1000=


коэффициент экстинции зеараленона

= оптическая плотности (274 нм) × 318 × 1000=


13900

Разбавьте концентрированные стандартные растворы Б) или В) в ацетонитриле до концентрации


1000 нг/мл. Подготовьте стандартный раствор зеараленона для ВЭЖХ.
Внесите в виалку тёмного стекла 75 нг зеараленона (75 мкл стандартного раствора с
концентрацией 1000 нг/мл), смешайте с ацетонитрилом до объема 1,5 мл. Добавьте в виалку 1,5 мл
дистиллированной воды. В 100 мкл приготовленного стандарта содержится 2,5 нг зеараленона

Смежные продукты
А) Иммуноаффинные колонки для количественного определения микотоксинов методом ВЭЖХ:
− AFLAPREP (P07)
− EASY-EXTRACTAflatoxin (RP70N)
− AFLAPREPM (P04)
− OCHRAPREP(P14B)
− DONPREP (P50B)
− EASY-EXTRACTZearalenone (RP90)
− FUMONIPREP(P31)
− EASY-EXTRACTT2 и HT-2 (P43)
− AFLAOCHRA PREP(P89)
− DZT PREP(P73B)
5

Б) Стандартные растворы и стандартизированные образцы


В) Ячейка KOBRA для электрохимической дериватизации афлатоксинов B1 и G1
Г) Другие продукты для анализа микотоксинов: тест-полоски, тест-карточки и тест-системы для
определения микотоксинов

ГАРАНТИИ
R-Biopharm Rhône Ltd и ООО «Стайлаб» отвечают за качество реагентов, входящих в комплект
поставки, за исключением тех случаев, когда порча реагентов была вызвана нарушением условий
транспортировки и/или хранения. Конечный пользователь реагентов принимает на себя все риски и
ответственность, вытекающие из использования этих реагентов и/или процедур.
R-Biopharm Rhône Ltd и ООО «Стайлаб» не отвечают за любой вред, убытки или затраты,
непосредственно или косвенно связанные или вытекающие из использования поставленных
реагентов и/или рекомендуемых процедур