Capitulo 1 Introduccién Objetivos LaHPLC o Cromatograffa Liquida de Alta Performance ha tenido una creviente difusion ‘desde comienzos de la décads del "70, y hoy representa una de las herramientas més ‘nupleadas en el laboratorio analitico modemo, ya sea éste dedicado a la investigaci6n bisica 0 aplicada, industrial, biol6gico 0 bromatol6gico. de este libro intentamos introdvcir al téenico y profesional de la quimnica sta metodologia, basndonos en principios teéricos pero procurando los que faciliten su comprensién. Por definicién del objetivo que nos ‘ovis a escribitlo,y porrazones de extensi6n, ‘metodologfa a consulta dela bibliografiaindicada como referencia de cada secciGnyy en las publicaciones especializades, algunas de las cuales so citan més adelante en este capitulo. La Cromatografia Segtin define Ia TUPAC, “La Cromatografia es un método, usado primariamente para la ‘separacién de los componentes de una muestra, en lacual los componentes se distribuyen ‘cuales es estacionaria, mientras Ia otra se mueve, La fase cstacionaria puede ser un sslido, un liquido retenido sobre un s6lido o un gel. La fase Tntroducctin als HPLC 1 Intodceton 3cstacionaria puede estar extendida como una capa o distribuida como una pelicula, ete. Modalidades de la Cromatografia lasficaciones permiten un estudiomés idades cromatogrificas en funcién de Apesardeevitarlas cordenado de tépicos. varios parémetros fase m6viles un gas, la modalidad cromatogré- ‘un liquido,cromatografialiquida (LC). A este ‘© Lanaturaleza de a fase m6 fica se denomina gascosa (G sino que su masa es sensiblemente superior. que mida una propiedad fisica del soluto izaciénen una llama, captura de electrones) es apropiado (Conductividad térmi ‘eomo detector de GC, pero resulta de dffeil aplicacién en HPLC (aunque llegaron a ‘comercializarse algunos dispositivos deionizaciGnde lame, aparentemente con poco éxito). En HPLC es nevesario encontrar dispositivos que diferencien el soluto en solucién de la fase movil. Los més difundidos son los detectores UV y en menor proporci6n los de fluorescencia, el de indice de refracci6n y el electroquimico. Laotrediferenci fundamental ente la CCy la HPLC se efiere a inflencia dea bien la resoluci6n puede ser mayorcon| ‘global esmayor en GC dado quela menor usar olumnas mucho més largas. in embargo, la selectividad aportada por la amplia -variedad de solventes aptos para ser empleados como fase mévil en HPLC leotorgan ‘mucho mayor versailidad. La mayor deuda de In HPLC con el analista es, tal vez, la cexistencia de un detector altamente sensible y “universal”. : clasificarse en modalidades de afinidad y por tamafio molec se encuentran la cromatografiaen fase normal (capitulo 6),en f y lade intercambio i6nico (capitulo 7) Entre las segundas se GFC (capitulo 8). Bn las modalidades de afinidad el analito indirectamente, através del solv. ‘nteracciGn con la fase estacionaia © La cantidad de muestra aplic Ja cromatografia seleccionada para una separacién no destruye Ia TLC, HPLC o columna abierta) es posible recuperar al analito separado iz ala salida de la columns. Aumentando la canta de muestra es psi obtener desde mcrogramos asa ilogramosde una sustancia pura en una sola corrda, bases que gobieman ini Ia cromatogra a en el rango de pg hasta jg, un ‘semipreparativo que abarca desde los yg hasta los gramos yun rango preparativo,que ‘ Tntroduccién ala HPLC 1 Tntroducein 7ccomprende las separaciones de anslito mayores que el gramo. La cromatografia ‘reparativa?S consituye un campo especifico dentro de la ciencia separativa, y su tratamiento esti fuera de alcance de este libro. El lector interesado puede recutir a Ia literatura especializada, Formas de Cromatografia Liquida Por su parte, y dado que nos ocupa en particular, podemos clasificar la cromatografia IMquida de ta siguiente forma: © Cromatograrfa Liquido-Sélido (LSC) 0 de adsorcién, Este método emplea un fase estacionria polar, tipicamentesicagel, yuna fase sm6vi no polar, por eemplohexano,cn general con el agregado de alginatitivoque proveeselectividad. ‘© Cromatografia Liquido-Liquido (LLC) 0 de particién. Enesta modalidad, las moléculas de soluto se distribuyen entre dos liquidos: uno es la fase mévil, y el otro Ia fase estacionaria, que se encuentra homogéneamente dispersa en un soporte slid finamente dividido. El desarrollo de este método le vvalié a Martin y Synge Ia obtencién del premio Nobel de quimica de 1952. Sin ‘embargo, varios inconvenientes, especialmente derivados del tipo de fijacién de Ia {y los resultados reproducibles al nivel que hoy se pretende. © Cromatografia de Fase Lig Las virtudes de Ia LLC eran claras, tanto como sus limitaciones. Por ello resulta también razonable pensar que reemplazando el tipo de unin cestacionaria ‘su soporte, haciéndola perdurable por medio de una unién quimica covalente, el Grito del material estarfa asegurado. Asi, priticamente el 90 % de las separaciones romatogrificas modernas se efectéa sobre material uimicamente modificado, el ‘cul permite optar, egtn el reactivo empleado para su fabricaciGn, entre materiales wre). altamente hidrof6bicosoaltamente| con un amplio rango de polaridad y de selectividad: octadecilo,octilo, hexilo, bull, etilo, ciano, diol, feilo, amino, nitro, amonio cuaternario, resto sulfonico, ct. ‘© Cromatografia de Intercambio Ténico (IEC). En este caso se emplean rellenos en los cuales la particula esté consituida por un ppolimeroopor ilicagel,en cadacaso unida aun grupo funcional aninicooeatiénico (Upicamente sulfnico para el intercambio de cationes, amonio cuatemario para el intereambio de aniones). La selecci6n del tipo de grupo funcional permite escoger ‘entre intercambiadores débiles y fuerte. © Cromatografia de Exclusién por Tamaio (SEC). [Esta modalidad emplea materiales de porosidad controlada, que funcionan como un Pequefis son las itimas).Sise dispone de estindares apropiados, de peso molecular adecuado (proteinas para el anélisis de proteinas, dextranos para el ensayo de dextranos, etc), puede evaluarse el peso molecular de un compuesto desconoeido, 0 bign Ie distribucién de pesos moleculares de un polimero sinttico. ? Referencias Bibliograficas Acontinuacién sefalamos un lstado dereferencias, que no pretendeenglobarla otalidad ‘i tampaco lo mis representativo, pero que tienen a nuestro juicio la calidad y claridad necesaris para el objetivo propueso. Libros * Snyder L., Kikland J, “Itroduetion to Modem Liquid Chromatography”, 24a, edicion, 1 Willey, N-Y., 1979. Unger K, “Packings and Stationary Phases y Chromatographic Techniques", M. 1990. \dbuch der HPLC”, Git Verlag GMBH, Darmstardt, 1989, “Practice of High Performance Liquid Chromatography, Applica 6 Tntroducci6n ala HPLC 1 Introduccion 7©o., Springfield, 1985. Berridge J., “Techniques for the Automated Optimization of HPLC Separations",J. Wiley, Chichester, 1985, * Dolan J., Snyder L., “Troubleshooting HPLC Systems”, Humana Press, Clifton, 1989. Runser.,"Mantaining and Troubleshooting HPLC Systems", J. Wiley,N.Y., 1981, Revistas * Analytical Chemisty, American Chemical Society, Washington DC, USA. * CA Selects, (High Speed Liquid Chromatography, Gel Permeation Chromato- raphy), Abstracts Service, Columbus, Ohio, USA. CCromstographia, Verlag Vieweg und Sohn, Wiesvaden, RFA. Jounal of Chromatography, Elsevier Scientific Publishers, Amsterdam, Holanda, Journal of Liquid Chromatography, Marcel Dekker, N.Y., USA. Journal of Chromatographic Science, Preston Publishers, Hinois, USA. Journal of High Resolution Chromatography & Chromatography Communications, Allfred Huthig Verlag, Heidelberg, RFA. LCIGC International, Aster Publishing Corp, Eugene, OR, USA. Referencias . TUPAC, “Recomendations on Nomenclature for Chromatography", Pure Appl. retier G., Rocea J, Chimicaoggi, 17, Noviembre de 1986, a 5 Tntroduceiin ala HPLC. Capitulo 2 Instrumental CCaracterfsticas de ls bombas Bombas reciprocantes Bomba adiafragma Bomba jeringa 26 Sistemas de gradiente Indice de Refraccién Fresnel on 2.9 Sistema de tome y Referencias 2 Instrumental °