UNIVERSIDAD AUTNOMA DE COAHUILA

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLGICAS

Maestra en Ing. Bioqumica

Monografa de pectinasas y pululanasas

INGENIERIA ENZIMATICA

CATEDRTICO: DR. MIRIAM PAULINA LUEVANOS ESCAREO

TORREN, COAHUILA
27 DE NOVIEMBRE DEL 2015

ndice
ndice de figuras

ndice de tablas

Resumen

Abstract

Introduccin

Objetivos

1 Pectinasas

1.1 Antecedentes
1.1.1 Historia
1.1.2 Clasificacin
1.1.3 Relevante
1.2 Fuentes de obtencin y tipos
1.3 Produccin a nivel industrial
1.4 Innovacin tecnolgica
1.5 Aplicaciones

7
7
8
10
11
12
13
14

2 Pululanasas
2.1 Antecedentes
2.1.1 Historia
2.1.2 Clasificacin
2.1.3 Relevante
2.2 Fuentes de obtencin y tipos
2.3 Produccin a nivel industrial
2.4 Innovacin tecnolgica
2.5 Aplicaciones

18
18
18
19
20
21
24
25
26

Discusiones

28

Conclusin

29

Referencias bibliogrficas

30

ndice figuras
Fig. 1. Accin enzimtica de las pectinasas.

Fig. 2. Estructura de la pectina y pectinasas

11

Fig. 3. La hidrlisis enzimtica del pululano y sus productos, dependiendo

14

de la enzima empleada
Fig. 4. Degradacin del pululano

22

ndice tablas
Tabla 1. Pectinasas comerciales

Tabla 2. Clasificacin de las pectinasas

Tabla 3. Caracterizacin de pectinasas microbianas

15

Tabla 4. Clasificacin de pululanasa

23

Resumen
Las pectinas y pululanas son enzimas hidroliticas que se encargan de degradar la pectina y
el pululano respectivamente. Las pectinasas de uso industrial se producen mayormente de
Aspergillus niger en un fermentador solido y su principal aplicacin es en industria
alimentaria para la elaboracin de jugos y vinos, debido a su capacidad de degradar los
cidos pcticos, reduciendo la viscosidad y aclarando las bebidas. Estas enzimas han sido
clonadas en diferentes huspedes para aislar las enzimas pcticas individualmente. Por otro
lado las pululanasas se encargan de romper los enlaces -(1,6) del pululano y polisacridos
similares, para formar azucares simples que son utilizados en la produccin de jarabes de
maltosa y glucosa. Su principal fuente de obtencin es Aerobacter aerogenes, por lo cual se
ha tenido que recurrir a la clonacin de la protena en microorganismos considerados como
GRAS (Generally Recocnized As Safe).
Abstract
Pectinases and pullulanases are hidrolitic enzymes that are responsible for the degrading of
pectin and pullulan, respectively. The industrial use of pectinasa are produced mainly from
Aspergillus niger by solid state fermentation and their main application is in the food
industry for the production of fruit juices and wine, due the ability to degradate pectic
acids, reducing the viscocity and clarifying the drinks. These enzymes has been cloned in
different host to isolate the pectic enzymes individually. Furthermore pullulanases take care
of cleaving the -(1,6) linkages of pullulan and similar polysaccharides, to form single
sugar that are used in the production of glucose and maltose syrups. His main source is
Aerobacter aerogenes, so the protein has to be cloned in GRAS (Generally Recocnized As
Safe) microorganism.

Introduccin
Las enzimas fueron descubiertas en la segunda mitad del siglo XIX y desde entonces han
sido de gran utilidad para los procesos industriales. Con los adelantos en la tecnologa en
las ltimas tres dcadas, en especial en el rea de gentica e ingeniera de protenas, las
enzimas se han utilizado en nuevos procesos industriales (Hoondal, Tiwari, Tewari, Dahiya,
& Beg, 2002).
Hay un aumento en la demanda de remplazar los procesos qumicos tradicionales con
procesos biotecnolgicos en donde se empleen microorganismos y enzimas como las
pectinasas y las pululanasas (Q. K. Beg, B. Bhushan, M. Kapoor, & G. Hoondal, 2000).
Las pectinasas fueron de las primeras enzimas en ser usadas en las casas. Su aplicacin
comercial fue a inicios de 1930s para la preparacin de jugos y vinos, y para 1960s el uso
de las enzimas fue en aumento permitiendo a las pectinasas ser una de las enzimas ms
utilizadas en la industria (Kashyap, Vohra, Chopra, & Tewari, 2001). Estas enzimas se
encargan de degradar una molcula compleja llamada pectina que se encuentra presente en
las paredes primaria y secundaria de las plantas, principalmente rompen los enlaces -(1,4).
En la actualidad son de gran importancia en la industria de los jugos de fruta, vinos y la
industria textil, adems de ser usada para otras aplicaciones biotecnolgicas (Carrera,
2003).
Las pululanas son enzimas que se encuentran ampliamente distribuidas en la naturaleza, y
son producidas por una gran variedad de especies, especialmente las mesoflicas y
termoflicas. Las pululanas microbianas son las ms empleadas debido a su accin
especfica en los enlaces -(1,6) del pululano y otros polisacridos similares como el
almidn y el glcogeno. Su principal uso en la industria es en la elaboracin de jarabes de
maltosa y glucosa (Abdullah & French, 1970; Doman-Pytka & Bardowski, 2004).

Objetivos
Compilar informacin sobre las pectinas y pululanasas para comprender su uso y aplicacin
en la industria.
Obtener conocimiento sobre su estructura y los sustratos que degrada.
Tener a la alcance la clasificacin de las pectinas y pululanasas para conocer la enzima
adecuada para las diferentes aplicaciones.
Conocer el mtodo de obtencin, extraccin, purificacin e inmovilizacin de la enzima
para su uso.

1. Pectinasas
1.1.

Antecedentes
1.1.1. Historia

Las pectinasas se encargan de degradar las sustancias pcticas presentes en los tejidos de
las plantas. El descubrimiento de las pectinas inicio sin un entendimiento de la estructura de
la pectina y el mecanismo con el cual las enzimas pectinoliticas degradan las sustancias
pcticas. Posteriormente la produccin de pectinasas microbianas destaco por muchas
dcadas (Gummadi & Panda, 2003).
Las pectinasas son primeras enzimas utilizadas para la produccin de jugo de frutas a nivel
industrial para la clarificacin del jugo de manzana en los aos 30s. Despus se usaron las
pectinasas para la despectinacin en el jugo de frutos rojos. Posteriormente se trato la pulpa
de la manzana con pectinasas y hemicelulosas para disminuir la viscosidad de la pulpa,
logrando as una mejora en la capacidad de prensado y el rendimiento. Para la produccin
de un jugo de frutos rojos claro y estable, la maceracin con calor con las enzimas asegura
un mejor rendimiento en el jugo y una mejor extraccin del color. En la actualidad los
proveedores de enzimas (Tabla 1) se encargan de producir preparaciones de enzima
especficos para optimizar el mezclado basndose en la composicin de la fruta, para poder
obtener productos con una mayor estabilidad y calidad, aunado a procesos de corta
duracin y gran capacidad (Gerhartz, 1990). Cerca del 75% de las ventas de enzimas de uso
industrial en el ao de 1995 fueron las pectinasas (Gummadi & Panda, 2003).
Tabla 1. Pectinasas comerciales(Kashyap et al., 2001)
Nombre
producto

Provedor

Panzym

C.H. Boehringer Sohn

Ultrazyme
Pectolase
Sclase

Ciba-Geigy, A.G.
Grinsteelvaeket
Kikkoman Shoyu, Co.
Schweizerische
Ferment, A.G.

Pectinex
Rapidase,
Clarizyme
Kleryzime
Pectinol,Roham

Localizacion
Ingelheim, Alemania del
este
Basel, Suiza
Aarthus, Dinamarca
Tokyo, Japon
Basel, Suiza

Societe Rapidase, S.A.

Seclin, Francia

Wallerstein, Co.
Rohm, GmbH

Des Plaines, E.U.A

Darmstadt, Alemania del
7

ent

este

Las pectinasas en la naturaleza son producidas por los saprfitos y hongos y bacterias
patgenos de plantas para poder lograr una degradacin de la pared celular (Solbak et al.,
2005), principalmente son sintetizadas de plantas y microorganismos (Naidu & Panda,
1998). La evidencia muestra que las pectinasas se pueden producir de manera inducible a
partir de diferentes fuentes de carbono (Gummadi & Panda, 2003).
1.1.2. Clasificacin
Se clasifican en de-esterificadoras (pectinesterasas), de-polimerizadoras (pectinasas;
hidrolasas y liasas) y protopectinasas. Esta clasificacin se realiza en base a su lugar de
accin de la cadena base de galacturon, su sustrato preferido, ya sea pectina, acido pectico o
oligo-D-galacturon; si actan por trans-eliminacin o por hidrlisis y si su corte es random
o exo- (Alkorta, Garbisu, Llama, & Serra, 1998; Len & Sen, 2011).
Tabla 2. Clasificacin de las pectinasas (Alkorta et al., 1998)
Nombre de la
enzima
Enzimas deesterificantes
Polimethilgalacturonat
o esterasa
Enzimas depolimerizantes
Hidrolasas
Endopoligalacturonasa
Exopolugalacturonasa
1
Exopoligalacturonasa
2
Endopolimetilgalacturo
nasa
Exopolimetilgalacturon
asa
Liasas
Endopoligalacturonato
liasa
Exopoligalacturonato
liasa

Nombre
comn

Numero
EC

Sustrato

Pectinesterasa 3.1.1.11

Pectina

Poligalacturon
asa
3.2.1.15
Poligalacturon
asa
3.2.1.67
Poligalacturon
asa
3.2.1.82
Pectin
hidrolasa
Pectin
hidrolasa

Acido
pctico
Acido
pctico
Acido
pctico

Pectato liasa

4.2.2.2

Pectato liasa

4.2.2.9

Lugar de
accin

Random

Random
Terminal
Penltimos
enlaces

Pectina

Random

Pectina

Terminal

Acido
pctico
Acido
pctico

Random
Penltimos
enlaces

Endopolimetilgalacturo
nato liasa
Pectin liasa

4.2.2.10

Exopolimetilgalacturon
ato liasa
Pectin liasa

Pectina

Random

Pectina

Terminal

Las pectinesterasas (PE) tambin conocidas como pectinmetil hidrolasas se encargan de la

de-esterificacin de los grupos metoxi de la pectina, produciendo acido pctico. Estas
enzimas actan especialmente sobre los grupos ester metilados de las unidades de
galacturonato que se encuentran al lado de unidades no esterificadas. Los microorganismos
que producen esta clase enzimas son los hongos, bacterias, levaduras y algunas plantas
superiores (Alkorta et al., 1998; Kashyap et al., 2001).

Fig. 1. Accin enzimtica de las pectinasas. PMLG: Polimetilgalacturonato liasas, PMG:

Polimetilgalacturonato hidrolasas, PMGE: polimetilgalacturonato esterasas, PGL:
poligalacturonato lyasas, PG: poligalacturonato hidrolasas (Alkorta et al., 1998)

Las depolimerasas cortan los enlaces -(1,4)-glicosdicos entre los monmeros de acido
galacturonico ya sea por hidrlisis o por -eliminacin. Las pectinas hidrolasas se dividen
en cuatro grupos: aquellas que catalizan la hidrlisis de los enlaces -(1,4)-glicosdicos son
las Polimetilgalacturanasas (PMG) y estas se dividen en endo-PMG las cuales cortan los
enlaces de la pectina altamente esterificada y exo-PMG que causan escisiones en los
enlaces del extremo no reducido; mientras que las que degradan los enlaces -(1,4)glicosdicos de los cidos pcticos son las poligalacturonasas (PG) y tambin se dividen en
endo-PG tambin conocidos como poliglucanhidrolasas, encargado de catalizar la hidrlisis
random y exo-PG cataliza la hidrlisis en forma secuencial. Y las lyasas tambin son
conocidas como trans-eliminasas, cortando los enlaces -(1,4)-glicosdicos por transeliminacin lo cual resulta en acido galacturonico con enlaces insaturados entre C4 y C5 en
el extremo no reducido sin la participacin de molculas de agua: Se divide en
polimetilgalacturonasas liasas (PMGL) que cortan los enlaces -(1,4) de la pectina y se
subdividen en endo- PMGL tambin conocidas como polymetoxigalacturonido liasa,
encargados de catalizar los cortes random en la pectina y exo-PMGL que catalizan paso a
paso la pectina por cortes de trans-eliminacin; por ltimo las poligalacturonasas (PGL)
(endo- PGL y exo-PGL) que catalizan los cortes en los enlaces -(1,4) en los acidos
pcticos por trans-eliminacin (Alkorta et al., 1998; Kashyap et al., 2001).
Las protopectinasas (PPase) tambin conocidas como pectinosinasas son enzimas
solubilizadoras de la protopectina, liberando agua y pectina altamente polimerizada. Estas
se clasifican en dos tipos, aquellas que reaccionan con la cadena de acido galacturonico y
la que reacciona con las cadenas de polisacridos unidas al acido galacturonico (Kashyap et
al., 2001). El nombre fue dado por Briton et al. (Brinton, Wichmann, Willaman, Wilson, &
Dore, 1927).
1.1.3. Relevante
La pectinolisis microbiana es importante para la patogenicidad, simbiosis y descomposicin
de la planta (Lang & Drnenburg, 2000), las pectinasas tienen un papel importante en la
naturaleza. Estas enzimas son inducibles, en otras palabras, solamente se produce cuando
son necesarias y contribuyen al ciclo del carbono. Las pectinasas no son las nicas que
atacan a los polisacridos de la planta, no obstante, son las primeras en atacar debido a que
10

las sustancias pcticas son las ms accesibles. Otras carbohidrolasas aparecen para atacar
los polisacridos disponibles durante el ataque de los microorganismos a la pared celular de
las plantas (Hoondal et al., 2002). Las pectinasas son clasificadas en base a su actividad en
estructura principal de la pectina, la cadena de poligalacturon (Sakai, Sakamoto, Hallaert, &
Vandamme, 1993).
Su principal uso es en el rea de alimentos para la produccin de jugos con una menor
viscosidad y turbidez, mejores rendimientos y calidad y proceden de cultivos sumergidos
de Aspergillus y Rhizopus (Len & Sen, 2011).
1.2.

Fuentes de obtencin y tipos

Las pectinasas son producidas por una amplia variedad de microorganismos como lo son
las bacterias, levaduras, hongos y actinomicetos (Hoondal et al., 2002). La principal fuente
de obtencin para su uso industrial son los hongos. Por cuestiones econmicas es difcil
encontrar informacin confiable sobre la produccin comercial de las pectinasas, y
probablemente todas las cepas sean de la especie Aspergillus niger debido a que las cepas
poseen un estatus GRAS (Generally Regarded As Safe) y por lo tanto sus metabolitos son
seguros para ser utilizados (Alkorta et al., 1998; Sakai et al., 1993), y clasificadas en base a
su accin hacia la pectina (Gerhartz, 1990).

Fig. 2. Estructura de la pectina y pectinasas (Gerhartz, 1990)

11

Las cepas de Aspergillus niger producen varios tipos de pectinas entre las que se incluyen
PMG, PG y PE, estas mismas enzimas han sido aisladas de Trichoderma reesei por
cromatografa; Poligalacturonasa ha sido purificada de Rhizopus stolonifer, PG y PL de
Aurobasidium pullulans; pectatoliasa fue sintetizado de especies de Amycolata y fue
purificado por columnas de intercambio ionico y cromatografa de interaccin hidrofobica;
Pectinasas de Clostridium aectobutylicum; endo-PL fue sintetizado de Bacillus macerans
(Gummadi & Panda, 2003).
1.3.

Produccin a nivel industrial

Para que el uso de las pectinasas sea el adecuado en la industria, es esencial una adecuada
purificacin y un amplio conocimiento de las propiedades de la enzima (Gummadi &
Panda, 2003). Las pectinasas se producen durante la fase de crecimiento de los hongos, y
posteriormente deben ser purificadas y concentradas (Gerhartz, 1990).
Para la produccin a nivel industrial de las pectinasas se utiliza el cultivo sumergido con
medios sintticos y medios con altos contenidos de pectina de origen natural (Trejo et al.,
1991).
El uso de las pectinasas en la industria del procesado de jugo de frutas se ha realizado en
reactores Batch usando enzimas solubles, evitando la reutilizacin de la enzima y causando
alteraciones en las propiedades organolpticas de los jugos. Por lo cual es necesario
inmovilizar las enzimas para el uso de ellas a nivel industrial (Lozano, Manjon, Iborra, &
Galvez, 1990).
Para la produccin de pectinasas alcalinas existen diversos mtodos como la fermentacin
sumergida, fermentacin solida, y su inmovilizacin ha sido usada de manera exitosa en las
pectinasa producidas por diferentes microorganismos. La produccin de estas enzimas por
fermentacin solida ha sido inducida por la complementacin del medio con diferentes
fuentes de nitrgeno y carbono que contengan sustancias pcticas como polmeros de
pectina, poligaracturonato sdico, residuos de la agricultura como fibras u hojas, pectina
ctrica, cascara de naranja, entre otros (Hoondal et al., 2002). Hay reportes en donde los
azucares simples como arabinosa, glucosa y galactosa inhiben la sntesis de pectinasas
alcalinas(Q. Beg, B. Bhushan, M. Kapoor, & G. Hoondal, 2000).
12

Una exo-poligalacturonasa ha sido separada de extractos micelares de Aspesrgillus niger

por la elucin en celulosa con buffer de acetato de sodio al 0.2M a un pH de 4.6, la
purificacin fue eficiente con un incremento en la especificidad de la actividad, una
recuperacin del 8.6% y la enzima solo presenta una actividad al 100% en presencia de
iones Hg2+ (Naidu & Panda, 1998). Benkova y Slezarik crearon un mtodo de purificacin
para aislar PMG, PG y PE que se encuentran extracelularmente, se les agrego sal a las
enzimas junto con sulfato de amonio y fueron precipitadas con etanol despus de una
filtracin en gel, se realiz una cromatografa en una columna de celulosa obteniendo una
preparacin enzimtica (. Rexov-Benkov & Slezarik, 1966).
Relativamente hay poca investigacin sobre la inmovilizacin de las pectinasas, diversos
autores han reportado diferentes ventajas de la inmovilizacin de estas enzimas en
comparacin con los procesos en los que se usan enzimas solubles para la clarificacin de
frutas (Alkorta et al., 1998).
La mayora de los estudios con pectinasas inmovilizadas se pueden clasificar en dos
grupos: (a) las que inmovilizan todo el complejo de pectinasas y (b) aquellas que
inmovilizan a las enzimas por separado (Heinrichov & Zliechovcov, 1986). Diferentes
endopoligalacturonasas han sido inmovilizadas en diferentes soportes, como la
endopoligalacturonasa de Aspergillus sp. fue inmovilizada por absorcin en polvo poroso
de polietilenetereptalato y por unin covalente por grupos amino en poli 2,6-dimetil-poxidofenil (L. Rexov-Benkov, Omelkov, & Kubnek, 1982; RexovBenkov,
Omelkov, Veruovi, & Kubnek, 1989). Soportes similiares como la -alumina y otros
tipos

de

soportes

de

macromolculas

han

sido

utilizados

para

inmovilizar

endopoligalacturonasas y pectinesterasas para el tratamiento de jugos de frutas (Pifferi,

Manenti, LO PRESTI, & Spagna, 1989). Tambin la pectina liasa purificada a partir de
Penicillium italicum fue inmovilizada mediante enlaces covalentes al nylon para evaluar su
posible utilizacin en el procesado de los jugos de fruta. Los procedimientos propuestos
aun muestran un rendimiento bajo para la inmovilizacin debido al alto costo de los
soportes y los mtodos para su inmovilizacin son muy elaborados para ser aplicados a
escala industrial, adems de que existe un decremento en la actividad enzimtica y en
algunos caso otras caractersticas de la enzima son alterados (Alkorta et al., 1998). Otras
13

investigaciones han inmovilizado de endo-pectin liasa en microesferas de nucleo de cortaza

hechas a la medida (Dinnella, Doria, Laus, & Lanzarini, 1996) otros han utilizado
preparados comerciales de pectinasas para inmovilizarlos en resinas de intercambio ionico
con atraccin electrosttica (Demir, Acar, Sarolu, & Mutlu, 2001).
1.4.

Innovacin tecnolgica

Con los avances de la biologa molecular, diversos investigadores han clonado y expresado
los genes de las pectinasas en varios huspedes, como la clonacin de los genes de hongos,
entre los que ms destacan son los procedentes de Aspergillus aculeatus. Cada pectinasa se
usa con un fin especifico, y para tener un enfoque adecuado es necesario realizar utilizar
tcnicas de recombinacin gentica, donde las pectinas especificas son expresadas en
diferentes huspedes. Para lograr esto se necesita purificar y caracterizar la protena para
determinar su secuencia nucleotidica (Gummadi & Panda, 2003).
La podredumbre suave causa que Erwinia spp. produzca diferentes clases de pectinasas y
multiples isoenzimas de pectato liasa, algunas se han utilizado para la maceracin de tejidos
vegetales. Las tcnicas de mutanogenisis in vitro de las diferentes clases de pectinasas de
cepa Erwinia han sido ineficientes debido al enmascaramiento de la perdida de una de las
pectinasas por la constante expresin del resto de las pectinasas (Chatterjee & Starr, 1980).
Con el fin de eliminar esta dificultad en la seleccin de las mutantes y facilitar el estudio
individual de los genes de las pectinasas tanto dentro como fuera de su ambiente natural, el
genoma de Erwinia carotovora subsp. carotovora 71 fue identificado. Esta cepa produce
por lo menos cinco clases diferentes de pectinasas, dependiendo del sustrato y las
condiciones de crecimiento, las cuales son: exo-PL, endo-PL, endo-PG, pectin metilesterasa
y pectin liasa. Las secuencias de aminocidos que producen estas enzimas fueron
incertados en E. coli para su estudio individual (Zink & Chatterjee, 1985).
Existen pectinasas provenientes de hongos patgenos, y con el fin de tener evidencia ms
concluyente acerca del rol de estas enzimas en la patologa de la planta se han utilizado
tcnicas de ADN recombinante.
1.5.

Aplicaciones

14

Las pectinasas se han utilizado por muchos aos para incrementar el rendimiento de los
jugos al facilitar la filtracin y su clarificacin al remover la turbidez que es causada por la
pectina presentes en la pulpa de las frutas y removiendo las partculas por sedimentacin o
por filtracin (Whitaker, 1990).
Otra de las aplicaciones de las pectinasas en la industria de los alimentos es la extraccin
del jugo de las frutas al degradar la pectina con estas enzimas facilita el prensado y aumenta
el rendimiento. Al exprimir frutas suaves como las moras, zarzamoras y moras azules, los
jugos suelen ser viscosos y con restos slidos de difcil separacin, la adicin de estas
enzimas disminuye la viscosidad haciendo posible la extraccin del jugo por prensado
(Alkorta et al., 1998; Whitaker, 1990).
En aos recientes se ha considerado potencialmente valioso el uso de pectinasas para la
reduccin de sustancias alcalinas en el pre-tratamiento del algodn, ya que es necesario
extraer los materiales no celulosos que se encuentran de manera natural en el, para poder
eficientar el proceso de coloracin. Anteriormente se usaban qumicos alcalinos para
realizar este proceso, pero causaba un serio impacto ambiental, y tambin degradaban
parcialmente la celulosa del algodn lo que causaba fibras menos resistentes y materiales
de baja calidad (Solbak et al., 2005).
1.-Pectinasas acidas
Se usan en la produccin de jugos de frutas y vinos, principalmente su fuente de obtencin
son hongos, especialmente de Aspergillus niger (Kashyap et al., 2001). En la elaboracin de
alimentos para bebe, las pectinsas ablandan las frutas y vegetales para que sean ms suaves
para su ingesta (Jayani, Saxena, & Gupta, 2005). Entre los jugos que se producen con la
adicin de esta enzima son los jugos claros espumosos y los productos unicelulares
(Kashyap et al., 2001).
Tabla 3. Caracterizacin de pectinasas microbianas

Productor
Pectinasas acidas
Aspergillus niger
CH4

Tipo de
pectinasa

Endo-pectinasa
15

pH
optimo

4.5-6.0

Temp.
Optima

Debajo de 50

Exo-pectinasa

3.5-5.0

Endo-PG
Endo-PG
Endo-PG
PG

4.5-4.7
3.5
4.8
5.0

50
55
50
40

PGL

5.5-7.0

30-40

Pectinas alcalinas
Bacillus sp. RK9
Bacillus sp.NT-33

PGL
PG

10.0
10.5

75

Bacillus polymyxa

PG

8.4-9.4

45

Bacillus pumilis
Amucola sp.
Xanthomonas
campestris
Bacillus No. P-4-N

PATE
PAL

8.0-8.5
10.25

60
70

PATE
PG

9.5
10-10.5

25-30
65

PATE

9.0

70

Pectin liasa
Pectin liasa
Pectato liasa

8.0
8.0
8.5

50
60
60-65

Pectato liasa

8.0

30-40

Penicillium
frequentans
Sclerotium rolfsii
Rhizoctonia solani
Mucor pusilus
Clostridium
thermosaccharolyti
cum

Bacillus
strarothermophilus
Penicillium italicum
CECT 22941
Bacillus sp.DT 7
Bacillus subtilis
Pseudomonas
syringae pv.
Glycinea

Para la produccin de jugos espumosos la enzima se agrega con el fin de incrementar el

rendimiento del mismo durante el prensado, la extraccin y para remover materia solida.
Los productos unicelulares son aquellos que se forman por una transformacin de los
tejidos organizados en una suspensin de clulas intactas, el producto es la base para la
elaboracin de jugos con pulpa y nctares, as como la comida para bebes, pudines y
yogurt. (Kashyap et al., 2001).
2.- Pectinasas alcalinas
Existen pocos reportes del uso de estas enzimas, principalmente se usan para el desgomado,
enriamiento y macerado de las fibras de yute, lino, camo y fibra de la cascara de coco;
16

procesado de textiles; fermentaciones de caf y t donde las pectinasas tienen un rol muy
importante ya que eliminan el mucilago de los granos de caf o la capa de pula de la haba;
para la produccin de alimentos de animales de granja ayudando a reducir la viscosidad del
alimento lo que ayuda a la absorcin y liberacin de nutrientes; y el colorado de fibras de
algodn tambin se utiliza para el pre-tratamiento de aguas residuales pertenecientes al
procesado de vegetales en la industria alimentaria. Bacillus spp. y Pseudomona sp. son los
microorganismos de mayor uso para la obtencin estas enzimas alcalinas, aunque tambin
hay diversos estudios sobre la produccin de pectinas alcalinas por actinomicetos y hongos.
Otros usos que pueden tener estas pectinasas son la purificacin de virus de plantas y
elaboracin de papel japons por Bacillus sp. y Erwinia carotovora, sin embargo, estos
usos tan interesantes aun no han sido comercializados (Hayashi et al., 1997; Hoondal et al.,
2002; Kashyap et al., 2001).

17

2. Pululanasas
2.1.
Antecedentes
2.1.1. Historia
La enzima pululano 6-glucanohidrolasa (E.C.3.2.1.41) pertenece a la familia de las 13
glicosil hidrolasas tambin llamada familia de las -amilasas. Tambin se le conoce como
-dextrina 6-glucohidrolasa, amilopectina 6-glucohidrolasa o dextrinasa limitada. Estas
enzimas se encuentran ampliamente distribuidas en los animales, plantas, hongos, levaduras
y bacterias Gram (+) y Gram(-) (Doman-Pytka & Bardowski, 2004; Hii, Tan, Ling, & Ariff,
2012)
Su nombre comn es pululanasa, se considerada como una enzima desramificante
encargada de cortar los enlaces -(1,6) del pululano, un polisacrido lineal formado por
enlaces -D-glucopiranosil que consiste esencialmente de unidades de maltotriosil unidas
por enlaces -(1,6). Pero a su vez tambin hidrolizan los enlaces -(1,6) de la -Dextrina,
los residuos ricos en enlaces -(1,6) de los maltooligosacaridos, almidn, o amilopectina.
(Gerhartz, 1990; Saha & Zeikus, 1989).
En 1951 fue aislada la primera enzima de una planta y fue conocida como R-enzima la cual
precedi a la dilucidacin del pululano varios aos despus. Al descubrirse el pululano,
permiti el descubrimiento en 1961 de la pululanasa bacteriana en Klebsiella aerogenes, y
posteriormente en Streptococcus mitis, Bacillus sp., B. acidopullulyticus, B. cereus var.
mycoides, B. macerans y B.polymyxa; al igual que una enzima inicialmente descrita como
isoamilasa pero que presentaba propiedades de pululanasa tambin fue aislada de
Escherichia intermedia (Adams & Priest, 1977; Leathers, 2003; Saha & Zeikus, 1989).
Estas enzimas se encuentran de manera intracelular como extracelular y su peso molecular
vara desde 80000 a 145000 (Arellano-Carbajal & Olmos-Soto, 1999). Otros artculos
mencionan que estas enzimas fueron descubiertas hasta 1966 por Wallenfels, Bender y
Rached

de igual manera en una cepa de Aerobacter aerogenes (Doman-Pytka &

Bardowski, 2004)

18

2.1.2. Clasificacin
Las pululanasas son clasificadas en base a dos de caractersticas bioqumicas: la reaccin de
catlisis y la especificidad por el sustrato. Las enzimas que hidrolizan el pululano han sido
clasificadas en cuatro tipos. Pululanasas (EC 3.2.1.41), Isopululanasas (EC 3.2.1.57),
Neopululanasas (EC 3.2.1.135) y Glucoamilasas (EC 3.2.1.3), las primeras hidrolizan
enlaces glucosdicos -1,6 del pululano para producir maltosa, maltotriosa y maltotetrosa
de los enlaces de dextrina y maltotriosas del pululano pero no los similares a amilosa de
la amilopectina, su peso molecular vara entre 110000-20000; mientras que las segundas
hidrolizan enlaces glucosdicos -1,4 para producir isopanosa y tienen poca o ninguna
actividad sobre el almidn, solamente ha sido encontrada en A. niger donde se produce a
30C y se encuentra de manera intracelular, y es estable a un pH de 4.0 a 7.0. Las
neopululanasas hidrolizan los enlaces -1,4 para producir panosa, al igual que las amilasas de Thermoactinomyces vulgaris; y por ltimo las glucoamilasas que hidrolizan el
pululano en su extremo no reducido para producir glucosa y pequeas cantidades de
oligosacaridos, su peso molecular vara desde 20000 hasta 306000 (Arellano-Carbajal &
Olmos-Soto, 1999; Saha & Zeikus, 1989).

Fig. 3. La hidrlisis enzimtica del pululano y sus productos, dependiendo de la enzima

empleada (Saha & Zeikus, 1989).
19

2.1.3. Relevante
La habilidad de las pululanasas de atacar los diferentes sustratos depende hasta cierto punto
de la estructura terciaria del polmero (Lee, Wheland, & W.J., 1971). Las funciones son (a)
promedio del largo de la cadena exterior (distancia entre el extremo no reducido de la
cadena y la ramificacin mas externa), (b) promedio del largo de la cadena interior
(distancia entre ramificaciones) y (c) donde el enlace -(1,6) constituya un punto de
ruptura, ya que la ubicacin de estos enlaces en los polisacridos es muy importante
(Manners, 1971).
La actividad de las pululanasas es fuertemente influenciada por la estructura de los
polisacridos. Las pululanasas microbianas pueden hidrolizar la amilopectina y los enlaces
de las dextrinas, pero no pueden hidrolizar el glicgeno (pueden hidrolizarlo
parcialmente). Las pululanasas que provienen de B. macerans tienen una menor afinidad
por las ramificaciones largas o por estructuras que tienen muchas ramificaciones, ya que
previene el ingreso de la enzima al polisacridos (Adams & Priest, 1977). Las provenientes
de B. cereus var. mycoides tienen una gran afinidad con ramificaciones cortas en enlaces
de las dextrinas, pero muy baja afinidad por las ramificaciones largas en amilopectinas
(Takasaki, 1976)
El anlisis de la primera secuencia de pululanasas mostro cuatro dominios: A, B, C y F
(Doman-Pytka & Bardowski, 2004)

La mayora de las pululanasas contiene ciertas

regiones conservadas I-IV lo que constituye un centro activo y un sitio de unin al sustrato
caractersticos en las amilasas. Tambin se observo que dos residuos, Aspartato y
Glutamina, presentes en el sitio cataltico de las pululanasas son cruciales para la actividad
cataltica de la enzima (Kuriki & Imanaka, 1999). Se encontr que Asp-206, His-296 e
Hist-210 son importantes para la funcionalidad del sitio de unin al sustrato (Kuriki &
Imanaka, 1989).
La diversidad en las enzimas degradadoras de pululano (Pullulan degrading enzymes PDE),
el mecanismo de hidrlisis de los carbohidratos y la variedad en el producto de la
degradacin son muy importantes para el uso que se le va a dar en la industria
farmacutica, de alimentos y qumica.
20

2.2.

Fuentes de obtencin y tipos

La principal fuente de obtencin de esta enzima son las bacterias entre las cuales se
encuentran Klebsiella aerogenes, Streptococcus mitis, Bacillus sp., B. acidopullulyticus, B.
cereus var. mycoides, B. macerans y B.polymyxa. Pero de igual manera pueden obtenerse
de fuentes vegetales (Saha & Zeikus, 1989).
Las enzimas de origen bacteriano se pueden clasificar en: Pululanasas tipo I, tipo II, tipo III
y tipo IV. Las tipos I tambin son llamadas verdaderas pululanasas o -dextrina-6glucanohidrolasas (EC 3.2.1.41). Estas enzimas hidrolizan los enlaces glucosdicos -(1,6)
de forma endo en el pululano y en las ramificaciones de oligosacaridos a maltosa y
oligasacaridos lineales respectivamente. Estas enzimas no solamente degradan el pululano
pero tambin amilosas productoras de almidn, sin embargo no hidrolizan los enlaces (1,4) de los glucanos y amilosa o los enlaces -(1,6) en glicgeno y panosa (Kashiwabara,
Ogawa, Miyoshi, Oda, & Suzuki, 1999).
Las pululanasas hidrolasas del tipo I tambin conocidas como Neopululanas hidrolizan el
pululano en panosa. Su secuencia de aminocidos aparte de presentar las cuatro regiones
altamente conservadas de la familia de las amilasas tambin presento dos regiones
adicionales, que le brinda la caracterstica hidroltica, las cuales no estn presente en las
enzimas no hidrolizantes (Tonozuka et al., 1995).
Las tipos II son las amilopululanasas. Presentan propiedades nicas, debido a que esta
enzima tiene actividades tanto de pululanasas como de -amilasas, rompiendo enlaces (1,6) y -(1,4) en almidn y polisacridos relacionados. La secuencia de aminocido nos
revela que todas las enzimas amiloliticas con excepcin de las producidas por Pyrococcus
furiosus contienen cuatro regiones altamente conservadas, incluyendo el centro activo y el
sitio de unin al sustrato (S.-P. Lee, Morikawa, Takagi, & Imanaka, 1994). Realizando una
comparacin en la secuencia de diferentes pululanasas sugiere que las enzimas de tipo II
contiene una secuencia especifica de aminocidos que difiere de las tipo I que solo rompen
enlaces -(1,6) (Doman-Pytka & Bardowski, 2004)

21

Fig. 4. Degradacin del pululano (Doman-Pytka & Bardowski, 2004)

Las pululanasas tipo II hidrolasas son las Isopululanasas, las cuales tambin son llamadas
pululano 4-glucano-hidrolasas se encargan de hidrolizar los enlaces glucosdicos -(1,4) del
pululano para producir isopanosa. Esta enzima no hidroliza el almidn y solamente han
sido encontradas en hongos, no en bacterias ms que en A. niger (Doman-Pytka &
Bardowski, 2004).
Las enzimas de tipo III atacan los enlaces glucosdicos -(1,4) as como los enlaces
glucosdicos -(1,6) del pululano para formar maltotriosa, panosa y maltosa, tambin
puede degradar el almidn, amilosa y amilopectina para formar maltotriosa y maltosa
principalmente (Duffner, Bertoldo, Andersen, Wagner, & Antranikian, 2000). Todas las
pululanasas hidrolasas del tipo III presentan tres residuos cidos, dos Aspartatos y un
22

Gluconato, los cuales se encuentran en el sitio cataltico de la enzima. Este nuevo tipo de
pululanasas se encontraron en Thermococcus aggregans (Doman-Pytka & Bardowski,
2004).
Tabla 4. Clasificacin de pululanasa

Enzima
Pululanasas tipo I
Pululanasa

Cepa
Bacteroides
thetaiotaomicon

pH

Temperat
ura
optima

Localizaci
n

6.5
4.011.0

--------

Extracelular

--------

6.3-7.0

83-85

Extracelular
Asociada a la
clula

--------

85

Extracelular

5.6
--------------8.0

85-90
--------------50

Extracelular
Extracelular
Extracelular
--------

8.5-9.5

50

Extracelular

Amilopululanasa

Bacillus sp. KSM-1378

Thermoanaerobacter
ethanolicus

5.5-6.0

90

Amilopululanasa
Amilopululanasa
-amilasa-pululanasa

Pyrococcus furiosus
Bacillus sp. TS-23
Bacillus sp. XAL601

5.5-6.0
7.5-9.6
9

105
65
70

-------Asociada a la
clula
Extracelular
Extracelular

Amilopululanasa

Thermoanaerobacterium
thermosaccharoliticum

5.0-5.5

65

Extracelular

5.6

85-90

Extracelular

6.0

50

Extracelular

6.0
--------

40
60-70

Extracelular
intracelular

Pululanasa alcalina tipo I

Pululanasa termoestable
tipo I
Pululanasa termoestable
tipo I
Pululanasa
Pululanasa
Pululanasa
Pululanasa hidrolizadora
Amilopululanasa
Amilopululanasa

-amilasa-pululanasa
termoestable
Neopululanasa
Neopululanasa
Neopululanasa
Neopululanasa
Pululanasa tipo III
Pululanasa tipo III
Glucoamilasa
Glucoamilasa

Bacillus sp.S-1
Bacillus flavocaldarius
KP1228
Caldicellulosiruptot
saccharolyticus
Clostridium
thermohydrosulfuricum
Klebsiella aerogenes
Klebsiella pneumoniae
Micrococcus sp.

Clostridium
thermohydrosulfuricum
Bacillus polymyxa
Thermoactionomyces
vulgarys
Bacillus strearothermiphilus
Thermococcus aggregans

6.5

95

Clostridium spG0005

4.5

Asociada a la
25 clula

23

--------

Glucoamilasa
Glucoamilasa
Glucoamilasa

Flavobacterioum sp
Halobacterium sodomense
Thermomyces lanuginosus

5.5-6.5
7.5
4.9

----------------------

Asociada a la
clula
Extracelular

Por ltimo las glucoamilasas son exoglucanasas, las cuales de manera consecutiva rompen
los enlaces glucosdicos -(1,4) de los polmeros de los -glucanos como pululano para
obtener glucosa. La literatura tambin conoce a esta enzima como glucano 1,4-glucosidasa,

amiloglucosidasa,

-amilasa,

lysosymal

-glucosidasa

exo-1,4--

glucosidasa. Estas enzimas cortan los enlaces 1-4 terminales de los residuos -D-glucosa en
el extremo no reducido de la cadena para liberar -D-glucosa. Su actividad disminuye al
disminuir el largo de la cadena del sustrato. Su actividad ha sido encontrada mayormente en
hongos, y en pocas bacterias (Sierks, Ford, Reilly, & Svensson, 1989).
2.3.

Produccin a nivel industrial

Recientemente la actividad de pululanasas termoestables ha sido descubierta en una amplia

cantidad de microorganismos. Por ejemplo C. thermohydrosulfuricum produce una
pululanasa altamente termoestable y termoactiva, su sntesis es inducida, hay una mutante
hiperproductiva de este organismo que mejora el crecimiento, la produccin de etanol y el
consumo de almidn (Hyun & Zeikus, 1985). En un bioreactor se colocan las dos cepas (la
nativa y la mutante) logrando una alta produccin de pululanasa en niveles limitados de
almidn pero sin limitarle el consumo de glucosa o xilosa (Saha & Zeikus, 1989).
Para la produccin de pululanasas se coloca la cepa con una fuente rica en carbono, en la
fase exponencial se empieza a producir la enzima, junto al crecimiento celular y el
crecimiento de biomasa. Durante las primeras horas la enzima se encuentra asociada a la
clula, la actividad fuera de la clula ocurre despus de la fase logartmica de crecimiento y
sufre un incremento entre el 75-80% del total. El nmero de enzima asociada a la clula
disminuye con respecto al incremento de la enzima extracelular. Para la extraccin de la
enzima asociada a la clula es necesario la utilizacin de detergentes especialmente SDS,
ya que la enzima se encuentra fuertemente ligada a la superficie de la clula. La
purificacin ocurre en dos pasos, primeramente la enzima extrada con SDS se mezcla con
una suspensin de DEAE-celulosa, con Tris-HCl a un pH 7.7 y se deja reposar una media
hora a 0C, pasado este tiempo se remueve la celulosa y se lava dos veces con NH 4SO4,
repitiendo el proceso una vez mas pero con una solucin de sal. En el segundo paso se
satura la solucin obtenida en el paso uno con NH4SO4, precipitados se forman por
centrifugacin y se disuelven en un buffer de fosfato para recuperar la enzima (Wallenfels,
Bender, & Rached, 1966)

24

La utilizacin de la pululanasa es esencial para la degradacin del almidn para la industria

alimentaria, sin embargo la pululanasa libre es soluble y por consiguiente solo puede ser
usado una vez en soluciones libres. Es aceptable que para aumentar el potencial de la
pululanasa es necesario inmovilizarla para tener una enzima estable y que pueda
recuperarse. Adems se pueden realizar operaciones continuas usando la pululanasa
inmovilizada. Hasta la fecha muchos soportes son utilizados entre los que se incluyen los
co-polmeros de acrlico, geles de agar y otros polmeros tanto sintticos como naturales
(Zhang, Zhu, Zheng, & Sun, 2009).
Estas enzimas se utilizan para produccin a nivel industrial de jarabes de glucosa y maltosa
a base de almidn, son necesarias tres etapas para una conversin enzimtica de este
sustrato, las cuales son gelatinizacin, licuefaccin y sacarificacin. La pululanasa se utiliza
durante la sacarificacin a 60C, con un pH de 4.5 (Moral, Ramrez-Coutio, & de Jess
Garca-Gmez).
Tambin se utiliza en la industria cervecera, especialmente las cervezas ligeras, bajas en
caloras o atenuadas. Se encarga de hidrolizar los enlaces glucosdicos -(1,6) para eliminar
las ramificaciones de amilopectina o dextrina. Ayudando a disminuir hasta un 50% la
maceracin (Moral et al.).
2.4.

Innovacin tecnolgica

La principal fuente de obtencin de la pululanasa es Aerobacteraerogenes anteriormente

conocido como Klepsiella aerogenes pero al ser una bacteria patgena se ha trabajado por
transferir los genes de la pululanasa a otros microorganismos que sean aprobados por la
FDA para ser utilizados en el rea de los alimentos logrando que la

produccin se

incremente (Ciencia, 1985).

Las dems cepas que producen esta enzima presentan poca actividad cataltica, pero por
medio de la clonacin molecular de los genes y su expresin en genes heterlogos se puede
aumentar significativamente esta actividad o a travs de la insercin de una secuencia seal
en una bacteria husped para la transferencia del producto del gen ligado a la regin
periplasmica, siendo E. coli y Bacillus subtilis las cepas comnmente utilizadas como
husped para expresin del gen de la pululanasa (Kuriki, Okada, & Imanaka, 1988).

25

Los estudios moleculares en los genes que codifican para las PDE y su expresin en los
microorganismos husped contribuyen para un mejor entendimiento de su funcin y
mecanismos de regulacin ayudando a incrementar la produccin industrial de estas
enzimas (Solbak et al., 2005).
Existen muchos ejemplos de la clonacin exitosa de las pululanasas tipo I, entre los cuales
se encuentran gran (+) como gran (-), as como aerobias como anaerobias. Donde la
clonacin de esta protena incrementa la produccin de pululanasa. Se ha observado que
cuando el gen cromosomal de la pululanasa de A. aerogenes es clonado en el plsmido
pBR322 en E. coli la produccin de pululanasa se incrementa de tres a siete veces ms.
(Takizawa & Murooka, 1985). Los genes de neopululanas de A. acidocaldarius, B.
thetaiotaomicron, Thermoactinomyces vulgaris y B. stearothermophilus fueron clonados y
expresados exitosamente en B. subtilis, E. coli y A. acidocaldarius. (Doman-Pytka &
Bardowski, 2004)
Las pululanasas de tipo II tambin han sido clonadas exitosamente en E. coli, adems en B.
subtilis. Mientras que las pululanasas tipo III fueron clonadas en E. coli, comprende 2181
pb y codifica para una protena de 727 aminocidos, mostrando cuatro regiones
conservadas, las cuales son caractersticas de la familia de las glicosil hidrolasas (DomanPytka & Bardowski, 2004).
2.5.

Aplicaciones

Es una enzima de uso industrial, se usa generalmente con amilasas sacarificantes como la
glucoamilasa, -amilasa o -amilasa de los hongos para la produccin de jarabes,
aumentando el grado de sacarificacin y su rendimiento, debido a que el almidn presenta
enlaces glucosidicos -(1,6) que actan como barrera para las enzimas que hidrolizan este
compuesto. Adems es una herramienta til para el estudio de la estructura de los
carbohidratos (Hii et al., 2012; Saha & Zeikus, 1989).
Degradan el pululano y varios polisacridos similares para producir jarabes con un alto
contenido de maltosa, el cual se puede utilizar para la elaboracin de gelatinas, helados y
pasteles, gracias a que la maltosa tiene una menor capacidad de cristalizacin, tiene un
carcter menos higroscpico y poder edulcorante menor a la glucosa. Como punto adicional
26

es de fcil fermentacin, poco viscoso, soluble y difcil de cristalizar. Tambin puede

producir amilosa, el cual se utiliza en la industria alimentaria para producir geles de rpida
gelificacin, elevada estabilidad para la produccin de caramelos y salsas gracias a que
reduce el contenido de grasa en los alimentos que han sido fredos; y a su vez se puede
utilizar en la industria textil para el terminado de tejidos (Ciencia, 1985).
Algunas pululanasa alcalinas han sido utilizadas como aditivos en los detergentes de platos
y de lavandera para remover el almidn, la efectividad de estas enzimas puede ser
mejorado con la combinacin de las amilopululanasa y -amilasas (Hii et al., 2012).

27

Discusiones
Las pectinasas son una de las enzimas que ms se utilizan en la industria alimentos, todos
los autores sealan que las pectinasas

usan como principal fuente de obtencin a

Aspergillus niger y que se dividen en grupos: enzimas depolimerizadoras, enzimas deesterificadoras y protopectinasas, esta clasificacin est hecha en base al lugar de accin de
la enzima sobre las sustancias pcticas. Su principal uso es en la produccin de jugos de
frutas, ayudando al rendimiento del producto y a su clarificacin, donde generalmente son
usadas de manera soluble. En algunas ocasiones es necesario el uso de las enzimas
especificas para las sustancias pcticas a hidrolizar, por lo cual es necesario realizar
clonaciones de los genes en huspedes para aislar las enzimas y producirlas de manera
individual.
En los ltimos aos muchas investigaciones se han dedicado a identificar el mtodo de
inmovilizacin adecuado para que la enzima no reduzca su rendimiento y pueda ser
reutilizada, pero aun no se ha logrado aplicar algn mtodo a escala industrial debido a su
alto costo.
Las pululanasas se encargan de hidrolizar el pululano, el almidn y otros polisacridos,
pueden ser clasificadas segn dos parmetros: su especificidad al sustrato o su accin de
catlisis, siendo la primera las utilizada en la literatura. Son principalmente obtenidas de
microrganismos patgenos por lo cual es necesario clonar esos genes por medio de
recombinacin

gentica

en

otros

micoorganismos

que

sean

seguros,

diversas

investigaciones utilizan a E. coli y B. subtilis como huspedes, permitiendo una mejora en

el rendimiento de la enzima.
Estas enzimas deben ser inmovilizadas en geles o polmeros sintticos o naturales para ser
reutilizadas, ayudando a la produccin de jarabes y cervezas claras.

28

Conclusin
Ambas enzimas pertenecen a la familia de las hidrolasas y son utilizadas primordialmente
en la industria alimentaria. Las pectinasas son enzimas que han sido utilizadas por un largo
tiempo para la degradacin de las sustancias pectinas en los jugos y vinos, aunque hay que
considerar que tiene una amplia variedad de aplicaciones como lo son el tratamiento de
aguas de desechos de limpieza de frutas y verduras, la produccin de alimentos para bebes,
entre otros. Diversas compaas se encargan de la produccin de ellas, y aun se sigue
buscando el mejor mtodo de inmovilizacin para poder escalarlo industrialmente.
Las pululanasas son enzimas que pertenecen a la familia de las -amilasas, por lo cual son
utilizadas para la sacarificacin del almidn con el fin de obtener jarabes, en la degradacin
del almidn y en la industria cervecera para obtener cervezas claras o light. Desde su
descubrimiento en Acetobacter aerogenes se han logrado diversos avances, como es la
clonacin de los genes en huspedes considerados como seguros por la FDA.

29

Referencias bibliogrficas

Abdullah, M., & French, D. (1970). Substrate specificity of pullulanase. Archives

of biochemistry and biophysics, 137(2), 483-493.
Adams, K., & Priest, F. (1977). Extracellular pullulanase synthesis in Bacillus
macerans. FEMS Microbiology Letters, 1(5), 269-273.
Alkorta, I., Garbisu, C., Llama, M. J., & Serra, J. L. (1998). Industrial applications
of pectic enzymes: a review. Process Biochemistry, 33(1), 21-28.
Arellano-Carbajal, F., & Olmos-Soto, J. (1999). Enzimas amilolticas microbianas.
Electronic Journal of Biotechnology, 4.
Beg, Q., Bhushan, B., Kapoor, M., & Hoondal, G. (2000). Production and
characterization of thermostable xylanase and pectinase from
Streptomyces sp. QG-11-3. Journal of industrial microbiology &
biotechnology, 24(6), 396-402.
Beg, Q. K., Bhushan, B., Kapoor, M., & Hoondal, G. (2000). Effect of amino acids
on production of xylanase and pectinase from Streptomyces sp. QG-11-3.
World Journal of Microbiology and Biotechnology, 16(2), 211-213.
Brinton, C., Wichmann, H., Willaman, J., Wilson, C., & Dore, W. (1927).
Definitions written by the Committee on Nomenclature of Pectin of the
Agriculture-Food Division. J. Am. Chem. Soc, 49, 38-40.
Carrera, J. E. (2003). Produccin y aplicacin de enzimas industriales Facultad
de Ciendias Agropecuarias, 1(1).
Ciencia, M. d. E. y. (1985). Programa movilizador de biotecnologa (S. d. P. d. M.
d. E. y. Ciencia Ed.). Espaa: Grafisa, Graficas Internacionales, S.A.
Chatterjee, A. K., & Starr, M. P. (1980). Genetics of Erwinia species. Annual
Reviews in Microbiology, 34(1), 645-676.
Demir, N., Acar, J., Sarolu, K., & Mutlu, M. (2001). The use of commercial
pectinase in fruit juice industry. Part 3: Immobilized pectinase for mash
treatment. Journal of Food Engineering, 47(4), 275-280.
Dinnella, C., Doria, M., Laus, M., & Lanzarini, G. (1996). Reversible adsorption of
endopectin-lyase to tailor-made core-shell microspheres prepared by
dispersion polymerization. Biotechnology and applied biochemistry,
23(2), 133-140.
Doman-Pytka, M., & Bardowski, J. (2004). Pullulan degrading enzymes of
bacterial origin. Critical reviews in microbiology, 30(2), 107-121.
Duffner, F., Bertoldo, C., Andersen, J. T., Wagner, K., & Antranikian, G. (2000). A
new thermoactive pullulanase from Desulfurococcus mucosus: cloning,
sequencing, purification, and characterization of the recombinant
enzyme after expression in Bacillus subtilis. Journal of bacteriology,
182(22), 6331-6338.
Gerhartz, W. (1990). Enzymes in industry: production and applications: Vch
Verlagsgesellschaft mbH.
Gummadi, S. N., & Panda, T. (2003). Purification and biochemical properties of
microbial pectinasesa review. Process Biochemistry, 38(7), 987-996.
Hayashi, K., Inoue, Y., Shiga, M., Sato, S.-I., Takano, R., Hirayae, K., . . . Hara, S.
(1997). Pectinolytic enzymes from Pseudomonas marginalis MAFF 0301173. Phytochemistry, 45(7), 1359-1363.
30

Heinrichov, K., & Zliechovcov, D. (1986). Poly (ethylene terephthalate)

immobilized exo-D-galacturonanase. Collection of Czechoslovak
chemical communications, 51(3), 723-730.
Hii, S. L., Tan, J. S., Ling, T. C., & Ariff, A. B. (2012). Pullulanase: role in starch
hydrolysis and potential industrial applications. Enzyme research, 2012.
Hoondal, G., Tiwari, R., Tewari, R., Dahiya, N., & Beg, Q. (2002). Microbial
alkaline pectinases and their industrial applications: a review. Applied
Microbiology and Biotechnology, 59(4-5), 409-418.
Hyun, H., & Zeikus, J. (1985). General biochemical characterization of
thermostable pullulanase and glucoamylase from Clostridium
thermohydrosulfuricum. Applied and environmental microbiology, 49(5),
1168-1173.
Jayani, R. S., Saxena, S., & Gupta, R. (2005). Microbial pectinolytic enzymes: a
review. Process Biochemistry, 40(9), 2931-2944.
Kashiwabara, S.-i., Ogawa, S., Miyoshi, N., Oda, M., & Suzuki, Y. (1999). Three
domains comprised in thermostable molecular weight 54,000 pullulanase
of type I from Bacillus flavocaldarius KP1228. Bioscience, biotechnology,
and biochemistry, 63(10), 1736-1748.
Kashyap, D., Vohra, P., Chopra, S., & Tewari, R. (2001). Applications of
pectinases in the commercial sector: a review. Bioresource technology,
77(3), 215-227.
Kuriki, T., & Imanaka, T. (1989). Nucleotide sequence of the neopullulanase
gene from Bacillus stearothermophilus. Journal of general microbiology,
135(6), 1521-1528.
Kuriki, T., & Imanaka, T. (1999). The concept of the -amylase family: structural
similarity and common catalytic mechanism. Journal of Bioscience and
Bioengineering, 87(5), 557-565.
Kuriki, T., Okada, S., & Imanaka, T. (1988). New type of pullulanase from
Bacillus stearothermophilus and molecular cloning and expression of the
gene in Bacillus subtilis. Journal of bacteriology, 170(4), 1554-1559.
Lang, C., & Drnenburg, H. (2000). Perspectives in the biological function and
the technological application of polygalacturonases. Applied
Microbiology and Biotechnology, 53(4), 366-375.
Leathers, T. D. (2003). Biotechnological production and applications of pullulan.
Applied Microbiology and Biotechnology, 62(5-6), 468-473.
Lee, Wheland, E. Y. C. a., & W.J. (1971). The Enzyme's 5.
Lee, S.-P., Morikawa, M., Takagi, M., & Imanaka, T. (1994). Cloning of the aapT
gene and characterization of its product, alpha-amylase-pullulanase
(AapT), from thermophilic and alkaliphilic Bacillus sp. strain XAL601.
Applied and environmental microbiology, 60(10), 3764-3773.
Len, M. R. M., & Sen, C. (2011). Efecto de dos pectinasas comerciales y su
tiempo de incubacin en las caractersticas fsico-qumicas y sensoriales
de un pur de guayaba roja.
Lozano, P., Manjon, A., Iborra, J., & Galvez, D. (1990). Characteristics of the
immobilized pectin lyase activity from a commercial pectolytic enzyme
preparation. Acta biotechnologica, 10(6), 531-539.
Manners, D. J. (1971). Nature New Biol., 234, 150-151.
Moral, S., Ramrez-Coutio, L. P., & de Jess Garca-Gmez, M. Aspectos
relevantes del uso de enzimas en la industria de los alimentos.

31

Naidu, G., & Panda, T. (1998). Production of pectolytic enzymesa review.

Bioprocess Engineering, 19(5), 355-361.
Pifferi, P., Manenti, I., LO PRESTI, A., & Spagna, G. (1989). Immobilization of
pectinesterase on y-alumina for the treatment of fruit juices. Belgian
journal of food chemistry and biotechnology, 44(5), 173-182.
Rexov-Benkov, L., Omelkov, J., & Kubnek, V. (1982). Endo-dgalacturonanase immobilized by adsorption on porous
polyethyleneterephthalate. Collection of Czechoslovak chemical
communications, 47(10), 2716-2723.
Rexov-Benkov, ., & Slezarik, A. (1966). Isolation of extracellular pectolytic
enzymes produced by Aspergillus niger. Collection of Czechoslovak
chemical communications, 31(1), 122-129.
RexovBenkov, L., Omelkov, J., Veruovi, B., & Kubnek, V. (1989). Mode of
action of endopolygalacturonase immobilized by adsorption and by
covalent binding via amino groups. Biotechnology and bioengineering,
34(1), 79-85.
Saha, B. C., & Zeikus, J. G. (1989). Novel highly thermostable pullulanase from
thermophiles. Trends in Biotechnology, 7(9), 234-239.
Sakai, T., Sakamoto, T., Hallaert, J., & Vandamme, E. J. (1993). Pectin, pectinase
and protopectinase: production, properties, and applications. Advances
in applied microbiology, 39, 213.
Sierks, M. R., Ford, C., Reilly, P. J., & Svensson, B. (1989). Site-directed
mutagenesis at the active site Trpl20 of Aspergillus awamori
glucoamylase. Protein engineering, 2(8), 621-625.
Solbak, A. I., Richardson, T. H., McCann, R. T., Kline, K. A., Bartnek, F.,
Tomlinson, G., . . . Podar, M. (2005). Discovery of pectin-degrading
enzymes and directed evolution of a novel pectate lyase for processing
cotton fabric. Journal of Biological Chemistry, 280(10), 9431-9438.
Takasaki, Y. (1976). Purifications and Enzymatic Properties of -Amylase and
Pullulanase from Bacillus cereus var. mycoides. Agricultural and
Biological Chemistry, 40(8), 1523-1530.
Takizawa, N., & Murooka, Y. (1985). Cloning of the pullulanase gene and
overproduction of pullulanase in Escherichia coli and Klebsiella
aerogenes. Applied and environmental microbiology, 49(2), 294-298.
Tonozuka, T., Mogi, S.-i., Shimura, Y., Ibuka, A., Sakai, H., Matsuzawa, H., . . .
Ohta, T. (1995). Comparison of primary structures and substrate
specificities of two pullulan-hydrolyzing -amylases, TVA I and TVA II,
from Thermoactinomyces vulgaris R-47. Biochimica et Biophysica Acta
(BBA)-Protein Structure and Molecular Enzymology, 1252(1), 35-42.
Trejo, M., Oriol, E., Lpez, A., Roussos, S., CHARLESSI, P., VINIEGRA, G., &
RAIBANT, M. (1991). Produccin de pectinasas de Aspergillus niger por
fermentacin slida sobre soporte. Micol. Neotrop. Apl, 4, 49-62.
Wallenfels, K., Bender, H., & Rached, J. (1966). Pullulanase from Aerobacter
aerogenes; production in a cell-bound state. Purification and properties
of the enzyme. Biochemical and biophysical research communications,
22(3), 254-261.
Whitaker, J. R. (1990). New and future uses of enzymes in food processing.
Food biotechnology, 4(2), 669-697.

32

Zhang, L., Zhu, X., Zheng, S., & Sun, H. (2009). Photochemical preparation of
magnetic chitosan beads for immobilization of pullulanase. Biochemical
Engineering Journal, 46(1), 83-87.
Zink, R. T., & Chatterjee, A. K. (1985). Cloning and expression in Escherichia coli
of pectinase genes of Erwinia carotovora subsp. carotovora. Applied and
environmental microbiology, 49(3), 714-717.

33