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Autores
Ricardo Carreo Lpez, Fabiola Avelino
Flores, Mara del Roco Bustillos Cristales,
Edith Chvez Bravo, Roco Prez y Terrn,
Lorena Milflores Flores
Licenciatura en Biotecnologa de la
Benemrita Universidad Autnoma de
Pgina
Puebla
LBT-BUAP
Autores
Ricardo Carreo Lpez
Doctor en Ciencias Microbiolgicas, Profesor Investigador, Centro de
Investigaciones en Ciencias Microbiolgicas del Instituto de Ciencias de la
Benemrita Universidad Autnoma de Puebla. Puebla, Mxico. Correo
electrnico: ricardo.carreno@correo.buap.mx
Fabiola Avelino Flores
Doctora en Ciencias Ambientales, en el rea de Ambiente y Salud.
Profesora
Investigadora,
Centro
de
Investigaciones
en
Ciencias
de
Puebla.
Puebla,
Mxico.
Correo
electrnico:
Investigadora,
Centro
de
Investigaciones
en
Ciencias
de
Puebla.
Puebla,
Mxico.
Correo
electrnico:
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ndice
Resumen
15
19
23
32
37
41
45
Bibliografa general
46
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Objetivo General
LBT-BUAP
Objetivo General
Que el alumno aprenda a realizar y compare las diferentes metodologas de
purificacin y anlisis de cidos nucleicos
Resumen
La biologa molecular como una disciplina cientfica cuyo objetivo es el estudio de
los procesos que se desarrollan en los seres vivos desde un punto de vista molecular.
Pretendiendo explicar los fenmenos de la vida a partir de sus propiedades
macromoleculares. Especialmente a travs del estudio de los cidos nucleicos y las
protenas.
Al estudiar las molculas que componen a las clulas vivas, la Biologa Molecular
roza con las metodologas utilizadas por otras disciplinas cientficas que abordan temas
similares como la gentica, la ingeniera gentica y la bioqumica entre otras.
Para el profesionista que se desarrollar en el mbito de la biotecnologa
aprovechando las cualidades de los microorganismos, clulas eucariotas y de las
estructuras subcelulares activas, es de suma importancia aprender a manipular y analizar
los cidos nucleicos.
Los mtodos de manipulacin y anlisis de los cidos nucleicos revisten especial
importancia
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respiratorios.
El umbral de corriente peligrosa ocurre a los 80 mA en corriente alterna, que puede
provocar fibrilacin ventricular con posible parlisis temporal cardiaca y respiratoria. En
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laboratorio.
11.
Los medios de cultivo inoculados deben colocarse en las cmaras de cultivo con su
tiene claro cmo se utilizan deber preguntar al profesor instructor para evitar su
descalibracin. Recuerde que las micropipetas a pesar de ser un instrumento pequeo
son de alta exactitud y de costo elevado.
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15.
cogerse por los bordes para evitar que se engrasen, as como su manipulacin debe ser
con firmeza y delicadeza para evitar su dao.
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Antes de utilizar las asas con hilos de platino que sirven para las siembras, stas
deben flamearse al rojo en posicin vertical bajo la accin de la llama; tambin debe
flamearse el mango. Antes de efectuar la siembra debe esperarse algunos segundos a
que se enfren, pudiendo enfriarse tambin en el borde de la placa de Petri que contiene
el medio de cultivo. Inmediatamente despus de haberlas utilizado, deben flamearse
nuevamente para eliminar a los microorganismos que an se encuentren en ella.
18.
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Introduccin.
La extraccin y purificacin de los cidos nucleicos es el primer paso en la mayora
de los estudios de Biologa molecular. Para manipular o amplificar el ADN es necesario
eliminar otros componentes celulares que pueden interferir con los experimentos, como
protenas, ARN y lpidos sin daar al ADN. Existen varios mtodos para la extraccin y
purificacin de los cidos nucleicos, los cuales son seleccionados segn:
El tipo de cido nucleico a extraer (ADN genmico, ADN plasmdico, ARN total, ARN
mensajero).
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suave para preservar los cidos nucleicos. Los procesos ms comunes son:
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combinadas. Se puede utilizar una solucin con detergentes para solubilizar las membranas
celulares y sales caotrpicas fuertes para inactivar las nucleasas. El ADN y otros
componentes celulares como lpidos, azcares y protenas, se disuelven en la solucin de
lisis. El ADN tiene carga negativa debido a los grupos fosfato de su estructura, y esta carga
elctrica es lo que hace soluble a esta molcula.
Posteriormente a la extraccin se debe purificar el ADN y sta se logra
frecuentemente con mtodos combinados como:
Cromatografa la cual se puede llevar a cabo por fltracin en gel, separando las
molculas por su tamao molecular; por intercambio inico, separando y
concentrando las molculas por interacciones electrostticas con la matriz de la
columna; por adsorcin, utilizando membranas de slica en presencia de altas
concentraciones de ciertas sales y posterior elucin con agua o un buffer; por
afinidad, ligando a los cidos nucleicos a una matriz particular, y posteriormente se
agrega una molcula que compite por el ligando dejando libre a los cidos nucleicos.
Centrifugacin,
que
es
un
mtodo
de
purificacin
importante
utilizado
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Material
Reactivos
Campana de extraccin
Medio LB
Vrtex
Milli-QTM
Incubadora con
agitacin orbital a 37 C
Microcentrfuga
Micropipeta de 10 a 100 L y
5.2
Campana de extraccin
Etanol absoluto
Congelador a -20 C
Sangre 1 mL
Cloroformo
Bao Mara
Buffer TE pH 8.0
Zymo Research
Protocolo.
Extraccin de ADN genmico de una cepa de Escherichia coli.
1. Propagar un cultivo de E. coli en medio LB (5 mL) durante toda la noche (18-24 hora)
a 37C con agitacin constante de 200 rpm.
2. Colocar 1 mL del cultivo en un tubo de polipropileno de 1.5 mL, centrifugar el tubo a
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i.
Fase acuosa
Interfase
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ADN. El ADN obtenido puede ser empleado inmediatamente o bien ser congelado
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Centrifugar
Lavar
Eluir
Resultados esperados.
Obtendr en ambos casos una resuspensin transparente que guardar a -20C
para que se corra en los geles de agarosa en el momento que su instructor se lo indique.
Fotodocumentar los resultados obtenidos y discutir las diferencias observada en el gel.
Cuestionario.
1. Qu procesos de extraccin de ADN se emplearon en cada caso?
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y mantener a
temperatura ambiente.
Bibliografa.
Green M.R. y Sambrook J. (2012). Molecular cloning: A Laboratory Manual (4ta edic).
Woodbury, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press.
Madigan M.T., Martinko J.M., Bender K.S., Buckley D. H.,, Stahl D. A. y Brock T. (2015).
Brock Biologa de los microorganismos (14ava edic). Madrid, Espaa: Pearson.
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Objetivo.
Aislar ADN plasmdico de clulas procariotas usando un mtodo tradicional.
Introduccin.
Los plsmidos son molculas pequeas de ADN circular (entre una y varios cientos
de kilobases) que se replican de forma autnoma e independiente del cromosoma de la
clula. La inmensa mayora de los plsmidos son ADN de doble cadena (3). Son muy
comunes en bacterias y algunos de ellos, los ms pequeos, existen en las clulas
bacterianas en un nmero elevado, se caracterizan por acarrear informacin gentica extra
que es indispensable para la adaptacin de las bacterias (1).
La mayora de los plsmidos se caracterizan por:
incluyen los tres pasos siguientes: (i) Crecimiento de las bacterias en un medio selectivo de
aquellas que llevan el plsmido. (ii) Lisis de las bacterias para la liberacin del plsmido.
(iii) Purificacin del ADN plasmdico. Uno de los mtodos ms empleados es el mtodo de
lisis alcalina, por su sencillez, bajo costo y reproducibilidad.
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Requerimientos:
Equipo
Material
Reactivos
Incubadora de agitacin
Caldo LB
Microcentrfuga
Solucin Birnie I
mL
Vrtex
Micropipetas de varios
Solucin Birnie II
volmenes
Refrigerador
Hielo
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Milli-QTM
Protocolo
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Resultados esperados.
Obtendr una resuspensin transparente que guardar a -20C para que se corra
en los geles de agarosa en el momento que su instructor se lo indique. Fotodocumentar los
resultados observados en el gel.
Cuestionario.
1. Qu finalidad tiene la neutralizacin en el mtodo de lisis alcalina?
2. Por qu la alcalinizacin en presencia de SDS afecta menos a los plsmidos que al
ADN cromosmico?
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Bibliografa
Balbs P. (2010). De la Biologa molecular a la Biotecnologa (2da. edic). Mxico: Trillas.
Green M.R. y Sambrook J. (2012). Molecular cloning: A Laboratory Manual (4ta edic).
Woodbury, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press.
Madigan M.T., Martinko J.M., Bender K.S., Buckley D. H.,, Stahl D. A. y Brock T. (2015).
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Introduccin.
El aislamiento de ADN plasmdico a partir de bacterias es fundamental en biologa
molecular y es un paso esencial en muchos procedimientos tales como la clonacin,
secuenciacin de ADN, transfeccin y la terapia gnica. Estos procedimientos donde se
manipula el ADN requieren el aislamiento de ADN plsmido de alta pureza. En el mercado
existen a la venta columnas de intercambio aninico, aunque ampliamente utilizado, son
relativamente costosas. Un mtodo alternativo menos costoso utiliza xido de slice como
la matriz de unin al ADN. Pero tiene la desventaja de que el lipopolisacrido bacteriano
(LPS) o endotoxina, son copurificadas y pueden inhibir posibles aplicaciones posteriores.
En particular, el contenido de Lipopolisacarido puede influir en gran medida en la
transfeccin influyendo en la eficiencia. Adems, estos mtodos por lo general requieren el
uso de productos qumicos peligrosos (por ejemplo, hidrocloruro de guanidina), que actan
como sustancias caotrpica para facilitar la unin del ADN a xido de slice. Un
procedimiento ligeramente modificado es el siguiente que resulta fcil, rpido y
relativamente de bajo costo.
Requerimientos:
Equipo
Material
Cmara de electroforesis
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horizontal
Microcentrfuga
(14000
Tubos de polipropileno de
Reactivos
Agarosa grado Biologa
1.5 mL
Molecular
Solucin P1
rpm)
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Solucin P2
Incubadora
Solucin P3
Asa bacteriolgica
Solucin de NaI 6M
Placas
Petri
90X15 Marcador
de
Peso
desechables
molecular de ADN de 1 KB
Micropipetas de 2-20 L,
20-200 L y 200-1000 L
Wash)
Agua bidestilada estril o
Milli-QTM
Agar LB*
Glicerol
Azul de bromofenol
Ampicilina
Silica
cido Actico
Protocolo.
Una colonia de Escherichia coli que contenga un plsmido de inters (ejem.
pTZ18R) se inocula en un tubo que contenga 5 mL de medio de cultivo (LB) con el
antibitico adecuado (Amp). Se incuba toda la noche a 37C a 160 rpm.
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Resultados a documentar.
1. Observe y documente como el paquete celular sufre modificaciones al agregar las
diferentes soluciones;
2. Observe y documente la diferencia entre el paquete celular y el ADN obtenido de
ste por la metodologa de silica;
3. Documente el resultado del anlisis electrofortico del ADN purificado;
4. Compare los resultados de purificacin de ADN plasmdico con otras metodologas
realizadas.
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Cuestionario.
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10 mM EDTA
100 g/mL RNase A
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NaI 6M
NaI KI 90 g
Sulfito de sodio 1 g
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Bibliografia.
Bert Vogelstein and David Gillespiet. (1979). Preparative and analytical purification of ADN
from agarose. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76(2): 615-619.
Debra A. Dederich, Geoffrey Okwuonu, Toni Garner, Amanda Denn, Angelica Sutton,
Michael Escotto, Ashley Martindale, Iliver Delgado, Donna M Muzny, Richard A
Gibbs and Michael L. Metzker. (2002). Glass bead purification of plasmid template
ADN for high throughput sequencing of mammalian genomes. Nucl Acds research
30(7): 1-5.
Etienne Joly. (1996). Purification of DNA Fragments from Agarose Gels Using Glass
Beads. Basic ADN and RNA Protocols. Methods Mol Biol. 58: 237-240.
Hamid Kheyrodin1 and Khosro Ghazvinian. (2012). ADN purification and isolation of
genomic ADN from bacterial species by plasmid purification system. African J
Agricult Research 7(3): 433-442.
Karl-Heinz Esser1, Dr. Wolfram H. Marx2 and Prof. Dr. Thomas Lisowsky. (2005). Nucleic
acid-free matrix: Regeneration of ADN binding columns. Biotechniques. 39(2): 270271.
Marko M.A., R. Chipperfield, H.C. Birnboim. (1982). A procedure for the large-scale isolation
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23
of highly purified plasmid ADN using alkaline extraction and binding to glass powder.
Analyt Biochem 121(2): 382387.
Osamu Yamada, Toshiya Matsumoto, Masahiro Nakashima, Shinobu Hagari,Toshio
Kamahora, Hiroshi Ueyama, Yuichiro Kishi, Hidetoshi Uemura, Takashi Kurimura.
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http://www.ejbiotechnology.info/index.php/ejbiotechnology/article/view/v12n2-4/709
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Introduccin.
La purificacin de cidos nucleicos es un requisito imprescindible para realizar
diversas tcnicas de biologa molecular. La obtencin exitosa de datos confiables y
reproducibles depende, en gran medida, de la extraccin de ADN ntegro y de su
purificacin. La extraccin consiste en el aislamiento y purificacin de molculas de ADN y
se basa en las caractersticas fisicoqumicas de la molcula.
El ADN est constituido por dos cadenas de nucletidos unidas entre s formando
una doble hlice. Los nucletidos estn integrados por un azcar (desoxirribosa), un grupo
fosfato y una base nitrogenada (adenina, guanina, timina o citosina). La unin de los
nucletidos ocurre entre el grupo fosfato y el azcar, mediante enlaces fosfodiester, dando
lugar al esqueleto de la molcula. Las bases de cadenas opuestas se unen mediante
puentes de hidrogeno y mantienen estable la estructura helicoidal. Los grupos fosfato estn
cargados negativamente y son polares, lo que le confiere al ADN una carga neta negativa
y lo hace altamente polar, caractersticas que son aprovechadas para su extraccin. Los
grupos fosfato tienen una fuerte tendencia a repelerse, debido a su carga negativa, lo que
permite disolver al ADN en soluciones acuosas y formar una capa hidratante alrededor de
la molcula. Pero, en presencia de etanol, se rompe la capa hidratante y quedan expuestos
los grupos fosfato. Bajo estas condiciones se favorece la unin con cationes como Na+ que
reducen las fuerzas repulsivas entre las cadenas de nucletidos y permiten que el ADN
precipite. Por otro lado, la carga neta negativa del ADN le permite unirse a molculas y
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Requerimientos:
Equipo
Material
Reactivos
Incubador orbital.
Micropipetas automticas.
Cmara de electroforesis
horizontal.
Fuente de alimentacin.
Guantes.
Etanol absoluto
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Hielo picado.
Etanol 70%
Agitador vrtex.
TE pH 8, con Ribonucleasa
o 2 mL
Transiluminador UV.
Rotuladores permanentes.
Toallas de papel
Cloroformo
Toallas de papel
Isopropanol
Contenedores de puntas
Marcador
utilizadas
molecular de 1 Kb
de
peso
TAE
Proteinasa K
RNAsa A
Protocolo.
Purificacin de ADN genmico bacteriano
a. Aadir 0,5 mL de suspensin bacteriana (esto es, cultivo en fase estacionaria
crecido durante la noche) a un tubo Eppendorf de 1,5 mL y sumergirlo en hielo
picado.
b. Centrifugar a 13.00016.000 g durante 5 segundos para precipitar las clulas.
Eliminar el mximo posible de sobrenadante: primero por decantacin; luego
dejando escurrir el tubo sobre papel absorbente limpio, o retirando restos con
micropipeta.
c. Aadir 300 L de la solucin de lisis y pipetear suavemente hacia arriba y hacia
abajo hasta que las clulas queden resuspendidas de nuevo.
d. Incubar la muestra a 80 C durante 5 minutos para lisar las clulas.
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5.
Se aaden al mismo tubo, 200 L de la solucin de lisis (NaOH, SDS) que est a
temperatura ambiente y recin preparada. Se agita suavemente con la mano por
inversin del tubo (unas 10 veces). Se incuba 5 minutos a 4C.
Neutralizacin
6. Se aaden al mismo tubo, 150 L de la solucin de neutralizacin (acetato potsico
3M, pH 4,8). Se agita con la mano por inversin del tubo (unas 10 veces). Se incuba
5 minutos a 4C.
Aislamiento de los plsmidos
7. Los agregados macromoleculares se precipitan por centrifugacin (15 minutos a
12.000 g y 4C), formndose un sedimento blanco de aspecto lechoso. El tubo se
traslada con cuidado a la mesa de trabajo.
8. Se retira (2 x 200 L) con cuidado el sobrenadante con el ADN plasmdico y se
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Resultados a documentar
1. Observe y documente los tipos de extraccin ADN total de cada uno de los mtodos.
2.
3.
Cuestionario
1. Qu mtodos existen para extraer y purificar ADN?
2. Por qu es necesario realizar la extraccin independiente de ADN cromosmico y
de ADN plasmdico?
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y purificacin de ADN?
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Solucin de lisis:
0,2 N NaOH, 1% SDS, preparar fresca antes de cada extraccin de ADN plamdico.
Solucin de neutralizacin:
Acetato potsico 3 M, pH 4,8.
TAE:
Tris-Acetato 40 mM, EDTA 1 mM.
Bibliografa.
Ausubel FM, Brent R, Kingston RE, Moore DD, Seidman JG, Smith JA, Struhl K (eds)
(2005): Current Protocols in Molecular Biology. Vols 1 a 4. New York: Greene &
John Wiley (New York).
Avise J. C. 2004. Molecular markers, natural histori and evolution. Sinauer Associates, Inc.
Publishers. Massachusetts, EE.UU.
Birnboim HC, Doly J (1979) A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant
plasmid ADN. Nucleic Acids Research 7: 1513-1523.
Dundass N., N. K. Leos, M. Mitui, P. Revell y B. B. Rogers. 2008. Comparison of automated
nucleic acid extraction methods with manual extraction. Journal of Molecular
Diagnostics 10: 311-316.
Stormer M., K. Kleesiek y J. Dreier. 2007. High-Volume Extraction of Nucleic Acids by
Magnetic Bead Technology for Ultrasensitive Detection of Bacteria in Blood
Components. Clinical Chemistry 53: 104110.
Tokuda Gaku, Nathan Lo, Aya Takase, Akinori Yamada, Yoshinobu Hayashi and Hirofumi
Watanabe. Purification and partial genome characterization of the bacterial
Research Notes 2008, 1:118p.
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Introduccin.
Existen una gran variedad de mtodos de extraccin y purificacin de ADN, la eleccin
del mtodo depender del origen de la muestra, del grado de pureza y calidad que se requiere
para su uso posterior.
Luego de la extraccin del ADN, son necesarias la cuantificacin y confirmacin de
la integridad de las molculas obtenidas. Si no es posible cuantificar el ADN por mtodos
espectrofotomtricos la estimacin de la concentracin se puede llevar a cabo mediante
su visualizacin en geles de agarosa.
Los geles de agarosa se preparan fundiendo agarosa en presencia del buffer
adecuado hasta que se logre una solucin transparente. La solucin fundida es puesta en
un molde donde gelifica. El gel forma una matriz cuya densidad est determinada por la
concentracin de agarosa. Cuando se aplica un campo elctrico a travs del gel, el ADN
migra hacia el nodo por los grupos fosfato que confieren carga neta negativa a estas
molculas. La velocidad de migracin de las molculas de ADN est en funcin de su
tamao, de la conformacin de la molcula, la concentracin de la agarosa y el voltaje
aplicado a la cmara de electroforesis.
Las molculas de ADN una vez que migraron en la matriz de agarosa pueden
visualizarse mediante tincin con diferentes colorantes siendo el ms comnmente utilizado
el bromuro de etidio. Este colorante se intercala en el ADN y al hacer incidir luz UV sobre
La estimacin de la concentracin de ADN se obtendr al comparar la fluorescencia emitida
por la muestra problema con la fluorescencia emitida por patrones de peso molecular.
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Requerimientos:
Equipo
Material
Reactivos
P200 y P10
Fuente de Poder
Puntas
w/v
de
diferentes Marcador
de
peso
molecular (100pb)
Solucin de bromuro de
etidio (10 mg/mL)
Buffer de carga
Buffer TAE 1X
Agua desionizada
Muestras de ADN
Protocolo.
1. Pesar 0.5 g de agarosa y mezclarla en un matraz de 250 mL con 50 mL de buffer
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Resultados a documentar.
1. Observe y documente las caractersticas fsicas de la muestra de ADN a
cuantificar.
2. Observe y documente la ventaja de utilizar buffer de carga en este protocolo.
Cuestionario.
1. Menciones otros mtodos de cuantificacin de ADN.
2. Que otros colorantes hay para visualizar el ADN .
3. Qu ventajas tiene el Bromuro de etidio sobre otros colorantes.
TAE 1X
Tris
2.42 g
EDTA
0.373g
Ac. Actico
0.572 mL
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Buffer de carga
Azul de bromofenol
0.25%
Xileno cyanol FF
0.25%
15%
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Bibliografa
Sambrook, J. y Russell, D. W. (2001). Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3 ed).
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Introduccin.
El espectrofotmetro se funda en la transmisin de la luz a travs de una solucin
para determinar la concentracin de un soluto presente en la misma. Cada molcula
absorbe la energa radiante a una longitud de onda especfica, a partir de la cual es posible
extrapolar la concentracin de un soluto en una solucin. Las protenas y los cidos
nucleicos absorben la luz en el intervalo ultravioleta, a longitudes de onda comprendidas
entre los 210 y los 300 nm, la absorbancia mxima de las soluciones de ADN y ARN
corresponde a 260. Dado que las soluciones de ADN y ARN absorben parcialmente la luz
a 280 nm y las que contienen protenas hacen lo propio a 260 nm, el cociente de los valores
obtenidos a 260 nm y a 280 nm (A 260/ A280) proporciona una estimacin del grado de pureza
de los cidos nucleicos. Los cocientes A 260/ A280 respectivos del ADN y el ARN puros son
aproximadamente de 1,8 y 2,0. Con un paso de luz de 10 mm y una longitud de onda de
260 nm, una absorbancia A = 1 corresponde aproximadamente a 50 g/ml de ADN
bicatenario, 37 g/ml de ADN monocatenario, 40 g/ml de ARN o 30 g/ml de
oligonucletidos.
Para cuantificar la cantidad de material obtenido despus de una extraccin de
cidos nucleicos o la sntesis qumica de un oligonucleico, se debe tomar una lectura a
longitudes de onda de 260 nm y 280 nm. La lectura a 260 nm permitir calcular la
concentracin de cidos nucleicos en la muestra.
Se toma como referencia que una O.D. (Densidad ptica), medida a 260 nm,
corresponde aproximadamente a:
150 g/ml de ADN de doble cadena,
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Requerimientos.
Equipo
Material
Reactivos
Microcentrifuga
Cubeta de cuarzo
Espectrofotmetro
Puntas estriles
Vrtex
Gradilla
Solucin TE
Micropipeta
Tubos
Guantes, material de limpieza
Protocolo.
1. Tomar el ADN en estudio y realizar una dilucin 1/10 en buffer TE. Preparar1ml de
esta dilucin.
2. Colocar la solucin de ADN en la cubeta de cuarzo. Esta cubeta debe haber sido
previamente lavada con 1 ml de extran diluido, agua destilada y purgada con
solucin TE. Si es necesario, adicionar etanol absoluto para lograr su completo
secado.
3. En otra cubeta colocar como solucin blanco, el TE si el ADN fue rehidratado con
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LBT-BUAP
Resultados a documentar
1. Observe y documente los datos de la estimacin de ADN total de cada una de las
muestras
2.
3.
4.
Cuestionario.
1. Por qu considera, que es necesario realizar la estimacin de la concentracin del ADN
aislado?
2. Por qu se debe realizar una dilucin de la muestra antes de medir la D.O. en el
espectrofotmetro?
3. Por qu slo se toma en cuenta la D.O. a 260 nm en la estimacin de la concentracin
del ADN? Qu informacin nos provee la D.O. a 280 nm?
4. Compare sus resultados (Concentracin de ADN y relacin de pureza D.O.260:D.O.280)
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Universidad de la Sabana.
Solano F. G., Mrquez C M.P., Shuler I. 2009. Optimizacin de la extraccin de ADN de
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Introduccin.
La mayora de protocolos para extraccin de ARN estn basados en el mtodo
descrito por Chomezynski y Sacchi, el cual se basa en el aislamiento de este cido nucleico
empleando fenol-cloroformo e isotiocianato de guanidina. Cada uno de estos componente
juega un papel especfico: el cido tiosanato de guanidina es sumamente fuerte y tiene un
alto poder denaturalizante; el fenol, al estar acidificado, provoca que el ADN se acumule en
la interfase entre la fase acuosa y la del fenol, dejando al ARN en la fase acuosa. Debido a
su estructura qumica el ARN es una molcula muy frgil que puede romperse por accin
de los grupos 2-OH (altamente reactivos) adyacentes al esqueleto de ribosa-fosfato.
La mayor dificultad para la obtencin de preparaciones de ARN es que la mayora
de las ARNasas, que degradan nuestras molculas de inters, son enzimas muy estables
y activas no requiriendo cofactores para su funcionamiento. Una pequea cantidad de las
mismas que permanezca como contaminante en nuestra preparacin puede constituir un
verdadero problema. Por lo que es importante tratar las muestras con ADNasas libres de
ARNasas.
Existen paquetes comerciales para estabilizacin de muestras de ARN de
compaas como QIAGEN, Ambion y RNA-works, que en general funcionan con una mezcla
de anticuerpos especficos para ribonucleasas, inhibidores de ribonucleasas y/o contienen
compuestos que neutralizan a los grupos 2-OH (como es el caso de RNA-works). Nosotros
el desarrollo de esta prctica.
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Material
Reactivos
ZR
Fungal/Bacterial
RNA
Micropipetas
de
volmenes
Campana de Flujo Puntas
Laminar
azules,
estril
amarillas
y Etanol 95-100%
blancas
Asa bacteriolgica
Mechero
Protocolo.
1. Un da previo a la prctica se inocula una colonia de clulas de E. coli en 5 mL de
caldo LB usando el antibitico respectivo. Incubar a 37C toda la noche con
agitacin.
2. Al da siguiente resuspender en MgSO47H2O 10 mM estril las clulas bacterianas
que crecieron el da anterior en los tubos eppendorf. Agitar en vrtex y centrifugar a
mxima velocidad. Decantar.
3. Resuspender las clulas en 800 L en RNA Lysis Buffer y transferir la mezcla a un
tubo ZR Bashing Bead Lysis.
4. Ensamblar el dispositivo anterior en un tubo Bead beater y centrifugar 1 minuto a
12,000 x g
5. Transfiera 400 L del sobrenadante a una columna Zymo-Spin IIIC adaptada a un
tubo de coleccin (Collection tube) y centrifugue a 8,000 x g por 30 segundos
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matriz de la
ZR
Fungal/Bacterial
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Diagrama:
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Observe y documente las caractersticas fenotpicas del cultivo tanto en placa como
en tubo.
2.
Observe y describa el paso del protocolo que se debe cuidar para evitar que el ARN
se contamine y se degrade.
3.
Cuestionario
1.
2.
3.
Bibliografa
Chomczynski P. and Sacchi. (1987). Anal Biochem. 162:156.
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