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Manual de Prcticas de Laboratorio de Introduccin a la Biologa Molecular I

Manual de Prcticas de Laboratorio de


Introduccin a la Biologa Molecular I

Autores
Ricardo Carreo Lpez, Fabiola Avelino
Flores, Mara del Roco Bustillos Cristales,
Edith Chvez Bravo, Roco Prez y Terrn,
Lorena Milflores Flores

Licenciatura en Biotecnologa de la
Benemrita Universidad Autnoma de

Pgina

Puebla

LBT-BUAP

Manual de Prcticas de Laboratorio de Introduccin a la Biologa Molecular I

Autores
Ricardo Carreo Lpez
Doctor en Ciencias Microbiolgicas, Profesor Investigador, Centro de
Investigaciones en Ciencias Microbiolgicas del Instituto de Ciencias de la
Benemrita Universidad Autnoma de Puebla. Puebla, Mxico. Correo
electrnico: ricardo.carreno@correo.buap.mx
Fabiola Avelino Flores
Doctora en Ciencias Ambientales, en el rea de Ambiente y Salud.
Profesora

Investigadora,

Centro

de

Investigaciones

en

Ciencias

Microbiolgicas del Instituto de Ciencias de la Benemrita Universidad


Autnoma

de

Puebla.

Puebla,

Mxico.

Correo

electrnico:

avelinofloresf@yahoo.com. Laboratorio de Patogenicidad Microbiana.


Mara del Roco Bustillos Cristales
Candidata a doctora en Microbiologa. Profesora Investigadora, Centro de
Investigaciones en Ciencias Microbiolgicas del Instituto de Ciencias de la
Benemrita Universidad Autnoma de Puebla. Puebla, Mxico. Correo
electrnico: mrbust@yahoo.com
Edith Chvez Bravo
Doctora en Ciencias Ambientales, en el rea de Ambiente y Salud.
Profesora

Investigadora,

Centro

de

Investigaciones

en

Ciencias

Microbiolgicas del Instituto de Ciencias de la Benemrita Universidad


Autnoma

de

Puebla.

Puebla,

Mxico.

Correo

electrnico:

echb_02@yahoo.com.mx. Laboratorio de Patogenicidad Microbiana.


Roco Prez y Terrn
Doctora en ... Profesora Investigadora, Escuela de Biologa de la
Benemrita Universidad Autnoma de Puebla. Puebla, Mxico. Correo
electrnico: rocperez33@hotmail.com
Lorena Milflores Flores
Doctora en Ciencias Qumicas, Profesor Investigador. Escuela de Biologa

Pgina

de la Benemrita Universidad Autnoma de Puebla, Puebla, Mexico. Correo


electrnico: lorenamilflo@yahoo.com.mx. Laboratorio de Biologa Molecular
y Microbiologa.

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Manual de Prcticas de Laboratorio de Introduccin a la Biologa Molecular I

ndice

Resumen

Normas generales del uso del laboratorio de Biologa Molecular

Extraccin de ADN Genmico: Mtodo tradicional y con kit

Extraccin de ADN plasmdico por mtodo tradicional

15

Purificacin de ADN plasmdico por Silica.

19

Purificacin de ADN cromosmico y ADN plasmdico

23

Cuantificacin de ADN en geles de agarosa.

32

Cuantificacin de ADN por espectrofotometra

37

Extraccin por kit de ARN bacteriano.

41

Conclusin del Manual

45

Bibliografa general

46

Pgina

Objetivo General

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Manual de Prcticas de Laboratorio de Introduccin a la Biologa Molecular I

Objetivo General
Que el alumno aprenda a realizar y compare las diferentes metodologas de
purificacin y anlisis de cidos nucleicos

Resumen
La biologa molecular como una disciplina cientfica cuyo objetivo es el estudio de
los procesos que se desarrollan en los seres vivos desde un punto de vista molecular.
Pretendiendo explicar los fenmenos de la vida a partir de sus propiedades
macromoleculares. Especialmente a travs del estudio de los cidos nucleicos y las
protenas.
Al estudiar las molculas que componen a las clulas vivas, la Biologa Molecular
roza con las metodologas utilizadas por otras disciplinas cientficas que abordan temas
similares como la gentica, la ingeniera gentica y la bioqumica entre otras.
Para el profesionista que se desarrollar en el mbito de la biotecnologa
aprovechando las cualidades de los microorganismos, clulas eucariotas y de las
estructuras subcelulares activas, es de suma importancia aprender a manipular y analizar
los cidos nucleicos.
Los mtodos de manipulacin y anlisis de los cidos nucleicos revisten especial
importancia

cuando deseamos saber la composicin, secuencia, tamao y forma de

actuacin de un gen para seguir el proceso de transmisin de esta informacin gentica


al ARN y posteriormente a un posible pptido, protena y/o enzima.
En este manual se pretende dar al alumno la informacin bsica y procedimientos
para la manipulacin de los cidos nucleicos. Se abordan diferentes metodologas de
purificacin de ADN para que el alumno juzgue las ventajas y los inconvenientes de cada
una de ellas, as como los mtodos de deteccin cualitativos y cuantitativos del ADN y ARN.

Pgina

Es una obra bsica que en sus secciones intenta complementar la informacin


terica que ha recibido el alumno con metodologas de purificacin y anlisis de los cidos
nucleicos.

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Manual de Prcticas de Laboratorio de Introduccin a la Biologa Molecular I

Normas generales del uso del laboratorio de Biologa


Molecular
Para el desarrollo de las prcticas en el laboratorio es conveniente tener en cuenta algunas
normas elementales que el alumno debe seguir:

1. Antes de empezar la prctica de laboratorio, debe leerse detenidamente las normas


elementales de laboratorio de Biologa Molecular, as como la prctica respectiva a
desarrollar, con el fin de tener una idea clara del objetivo, fundamento y metodologa a
seguir.
2. Accidentes personales, tales como derrame de reactivos, cortes, quemaduras u otros
deben comunicarse inmediatamente al Profesor-Instructor.
3. El orden y la limpieza son esenciales antes, durante y despus de haber desarrollado la
prctica de laboratorio.
Cada grupo o seccin de alumnos se responsabilizar de su zona de trabajo y de su
material.
4. No se podr ingerir alimentos o bebidas dentro del laboratorio as como se evitar jugar
o hacer bromas durante el desarrollo de la prctica.
5. Los productos inflamables (gases, alcoholes, ter, cloroformo etc.) deben mantenerse
alejados de las llamas, por ejemplo de los mecheros. Si se manejan mecheros de gas
se debe tener mucha precaucin de cerrar las llaves de paso al apagar la llama.
6. Antes de utilizar un reactivo hay que fijarse en la etiqueta para asegurarse de que es el
que se necesita, de la forma de manipulacin y de los posibles riesgos a su salud.
7. Todo el material y equipo especialmente los aparatos delicados, como cmaras de
electroforesis, deben manejarse con cuidado evitando los golpes o el forzar sus
mecanismos de apertura y cierre.
Se debe guardar especial atencin al utilizar la cmara electrofortica. El umbral mnimo
de contraccin muscular se produce con 9 mA, pudiendo afectar a los msculos

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respiratorios.
El umbral de corriente peligrosa ocurre a los 80 mA en corriente alterna, que puede
provocar fibrilacin ventricular con posible parlisis temporal cardiaca y respiratoria. En

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Manual de Prcticas de Laboratorio de Introduccin a la Biologa Molecular I


trminos generales una corriente ya sea continua o alterna de 100 mA es peligrosamente
mortal.
El uso de ollas de presin y hornos de microondas debe ser con sumo cuidado evitar
sellar frascos al introducirlos a dichos aparatos y evitar introducir metales al horno de
microondas.
8. Todos los materiales de desecho que hayan entrado en contacto con microorganismos
(como pipetas, placas Petri, tubos, puntas de micropipeta etc.), deben colocarse en
bolsas de autoclave preparadas para tal efecto y proceder posteriormente a su
esterilizacin. Las pipetas Pasteur de cristal, los cubreobjetos y portaobjetos usados se
colocarn en un recipiente especial para vidrio que indicar el profesor antes de iniciar
la prctica.
9. Usar siempre bata en el laboratorio, asi como guantes cubrebocas, gafas etc. cuando
el Profesor instructor lo indique o este sealado en la prctica de laboratorio que se
realizar.
No tocar solventes con la mano desnuda como acetona, metanol etc.
Si usa lentes de contacto el riesgo es mayor para sus ojos con los gases pues se pueden
ocluir detrs de las lentes.
10.

Nunca deben sustraerse cultivos de microorganismos ni sustancias qumicas del

laboratorio.
11.

Lavarse las manos con jabn o con un desinfectante si es necesario, frecuente

mente durante el desarrollo de la prctica y siempre antes de dejar el laboratorio.


12.

Los medios de cultivo inoculados deben colocarse en las cmaras de cultivo con su

identificacin respectiva, ej.: nombre del microorganismo, nombre del alumno,


naturaleza del medio, fecha etc.
13.

No arrojar residuos qumicos al desage deber informarse la manera de

desecharlos con su Profesor instructor.


14.

Las micropipetas debern utilizarse conforme a las instrucciones del profesor. Si no

tiene claro cmo se utilizan deber preguntar al profesor instructor para evitar su
descalibracin. Recuerde que las micropipetas a pesar de ser un instrumento pequeo
son de alta exactitud y de costo elevado.

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15.

Las celdas para el espectrofotmetro, y los cubreobjetos y portaobjetos deben

cogerse por los bordes para evitar que se engrasen, as como su manipulacin debe ser
con firmeza y delicadeza para evitar su dao.

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Manual de Prcticas de Laboratorio de Introduccin a la Biologa Molecular I


16.

Los tubos de ensayo que contengan medios de cultivos o cultivos de

microorganismos, nunca deben abrirse en posicin vertical, sino lo ms horizontalmente


posible (inclinados) y para quitar el tapn se mantendrn inclinados con una mano y se
abrirn con la otra, que sostendr a su vez el asa. Una vez abierto, se flamea por algunos
segundos el orificio, repitiendo dicha operacin una vez realizada la siembra (el tapn
nunca debe dejarse sobre la mesa).
17.

Antes de utilizar las asas con hilos de platino que sirven para las siembras, stas

deben flamearse al rojo en posicin vertical bajo la accin de la llama; tambin debe
flamearse el mango. Antes de efectuar la siembra debe esperarse algunos segundos a
que se enfren, pudiendo enfriarse tambin en el borde de la placa de Petri que contiene
el medio de cultivo. Inmediatamente despus de haberlas utilizado, deben flamearse
nuevamente para eliminar a los microorganismos que an se encuentren en ella.
18.

El alumno deber ser metdico en la realizacin de la prctica de laboratorio y anotar

los resultados inmediatamente despus de haberlos obtenido.


19.

En caso de tener dudas o preguntas deber dirigirse al Profesor- Instructor nunca

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con su compaero alumno.

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Manual de Prcticas de Laboratorio de Introduccin a la Biologa Molecular I

Extraccin de ADN Genmico: Mtodo tradicional y con kit


Objetivo.
Extraer ADN genmico de una bacteria Gram negativa utilizando un mtodo
tradicional y el ADN genmico de sangre con un kit comercial.

Introduccin.
La extraccin y purificacin de los cidos nucleicos es el primer paso en la mayora
de los estudios de Biologa molecular. Para manipular o amplificar el ADN es necesario
eliminar otros componentes celulares que pueden interferir con los experimentos, como
protenas, ARN y lpidos sin daar al ADN. Existen varios mtodos para la extraccin y
purificacin de los cidos nucleicos, los cuales son seleccionados segn:

El tipo de cido nucleico a extraer (ADN genmico, ADN plasmdico, ARN total, ARN
mensajero).

El organismo de donde se extraer (clulas animales, plantas, levaduras, bacterias,


virus)

El material de extraccin (rganos completos, tejidos, cultivos celulares, sangre,


muestras ambientales)

Los resultados deseados (rendimientos, pureza, tiempo de purificacin)

La aplicacin posterior (amplificacin, clonacin, expresin, transcripcin reversa).


La extraccin de los cidos nucleicos a partir de materiales biolgicos requiere la

homogeneizacin de los tejidos, en su caso, el lisado de las clulas y la inactivacin de las


nucleasas celulares que podran digerir el ADN. Esto asegura que la cantidad de ADN
intacto obtenido sea la mxima. La homogeneizacin y la lisis celular deben ser lo
suficientemente fuertes para romper el tejido, la pared y las membranas celulares, pero ser

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suave para preservar los cidos nucleicos. Los procesos ms comunes son:

La disrupcin mecnica, como la ruptura hipotnica, o la congelacindescongelacin.

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El tratamiento qumico, como la lisis con detergentes o agentes caotrpicos.

La digestin enzimtica con proteasas, lisozima o mutanolisina.


La ruptura celular y la inactivacin de nucleasas intracelulares deben de ser

combinadas. Se puede utilizar una solucin con detergentes para solubilizar las membranas
celulares y sales caotrpicas fuertes para inactivar las nucleasas. El ADN y otros
componentes celulares como lpidos, azcares y protenas, se disuelven en la solucin de
lisis. El ADN tiene carga negativa debido a los grupos fosfato de su estructura, y esta carga
elctrica es lo que hace soluble a esta molcula.
Posteriormente a la extraccin se debe purificar el ADN y sta se logra
frecuentemente con mtodos combinados como:

Extraccin/precipitacin usando solventes para eliminar contaminantes, como la


combinacin de fenol y cloroformo para eliminar protenas; mediante la utilizacin
de altas concentraciones de sal o cambios en el pH para precipitar las protenas
(precipitacin selectiva); o la precipitacin de los cidos nucleicos con isopropanol
o etanol, dado que el ADN es insoluble en altas concentraciones de sal y alcohol. El
ADN precipitado forma unas finas hebras blancas, mientras que el resto de las
sustancias permanecen disueltas.

Cromatografa la cual se puede llevar a cabo por fltracin en gel, separando las
molculas por su tamao molecular; por intercambio inico, separando y
concentrando las molculas por interacciones electrostticas con la matriz de la
columna; por adsorcin, utilizando membranas de slica en presencia de altas
concentraciones de ciertas sales y posterior elucin con agua o un buffer; por
afinidad, ligando a los cidos nucleicos a una matriz particular, y posteriormente se
agrega una molcula que compite por el ligando dejando libre a los cidos nucleicos.

Centrifugacin,

que

es

un

mtodo

de

purificacin

importante

utilizado

frecuentemente en combinacin con otros mtodos, como la filtracin en gel y la


cromatografa de adsorcin.

Electroforesis en geles de agarosa, que se utiliza frecuentemente para determinar

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el tamao y la integridad del ADN extrado.

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Manual de Prcticas de Laboratorio de Introduccin a la Biologa Molecular I


Requerimientos.
Equipo

Material

Reactivos

Campana de extraccin

Tubos tipo falcn de 15 mL

Medio LB

Vrtex

Tubos para microcentrfuga de

Agua bidestilada estril o

1.5 mL, estriles

Milli-QTM

Incubadora con

Micropipeta de 100 a 1,000 L y

Fenol equilibrado con Tris

agitacin orbital a 37 C

puntas desechables estriles

Microcentrfuga

Micropipeta de 10 a 100 L y

Acetato de sodio 3 M con pH

puntas desechables estriles

5.2

Campana de extraccin

Cepa de E. coli K-12

Etanol absoluto

Congelador a -20 C

Sangre 1 mL

Cloroformo

Bao Mara

Kit Quick-gDNA MiniPrep de

Buffer TE pH 8.0

Zymo Research

Protocolo.
Extraccin de ADN genmico de una cepa de Escherichia coli.
1. Propagar un cultivo de E. coli en medio LB (5 mL) durante toda la noche (18-24 hora)
a 37C con agitacin constante de 200 rpm.
2. Colocar 1 mL del cultivo en un tubo de polipropileno de 1.5 mL, centrifugar el tubo a

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10

4,000 rpm durante 5 minutos y decantar el sobrenadante.

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3. Agregar 250 L de agua desionizada estril al paquete celular y agitar
vigorosamente utilizando un vrtex hasta lograr la resuspensin de las clulas
(aproximadamente 30 s).
4. Agregar 250 L de fenol (equilibrado con Tris 1M pH 8.0) y agitar vigorosamente
durante 30 s utilizando un vrtex.

i.

5. Agregar 250 L de cloroformo y agitar vigorosamente utilizando un vrtex durante


30 s.
6. Centrifugar a 9,000 rpm durante 5 minutos.
7. Recuperar la fase acuosa (fase superior, aprox. 225 L) y colocarla en otro tubo de
1.5 mL. En muchas ocasiones en la interfase se presenta un precipitado blanco,
este precipitado no debe ser recuperado, ya que son protenas que pueden
contaminar la muestra e inhibir reacciones posteriores.

Fase acuosa
Interfase

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11

8. Agregar 225 L de cloroformo y agitar vigorosamente durante 30 s utilizando un


vrtex.
9. Centrifugar a 9,000 rpm durante 5 minutos.

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10. Recuperar la fase acuosa (fase superior, aprox. 200 L) y colocarla en otro tubo de
1.5 mL, teniendo las mismas precauciones que en el paso VII.
11. Agregar 20 L de Acetato de Sodio (3M) a la fase acuosa, agitar en vrtex 20 s y
agregar 440 L de etanol Absoluto fro a la fase acuosa.
12. Centrifugar a 12,000 rpm durante 30 minutos. Es importante colocar los tubos en la
misma orientacin siempre, para saber en qu lado del tubo est el ADN precipitado.
13. Retirar el sobrenadante y dejar secar a 37 C.
14. Resuspender en 100 L de TE o agua grado PCR y conservar a -20 C. Para
utilizarlo en anlisis posteriores se deber cuantificar y determinar el grado de
pureza.

Extraccin de ADN genmico de sangre con el kit Quick-gDNA MiniPrep.


1. Adicionar 400 l del Buffer de lisis a 100 l de sangre en un microtubo de 1.5 mL
(4:1). Mezclar completamente con agitacin mecnica de 6-10 segundos, incubar a
temperatura ambiente durante 5-10 minutos.
2. Transferir la mezcla a una columna Zymo-Spin (unida a un tubo de recoleccin) y
centrifugar a 11000 rpm durante un minuto. Descartar el tubo de recoleccin junto
con el lquido contenido.
3. Transferir la columna a un nuevo tubo de recoleccin, adicionar 200 L del Buffer
de pre-lavado y centrifugar nuevamente a 11000 rpm durante un minuto. Descartar
el tubo de recoleccin junto con el lquido contenido.
4. Aadir 500 L del Buffer de lavado a la columna y centrifugar a 11000 rpm durante
un minuto. Descartar el tubo de recoleccin junto con el lquido contenido.
5. Transferir la columna a un tubo limpio y estril para microcentrifuga. Adicionar > 50
L de Buffer de elucin de ADN o agua estril. Incubar durante 5 minutos a
temperatura ambiente. Centrifugar a 12,000 rpm durante 45 segundos para eluir el
a -20C.

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12

ADN. El ADN obtenido puede ser empleado inmediatamente o bien ser congelado

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Muestra de sangre
+
Amortiguador de lisis genmica

Centrifugar
Lavar
Eluir

DNA ultrapuro para:


PCR
Digestin por endonucleasas
Secuenciacin

Resultados esperados.
Obtendr en ambos casos una resuspensin transparente que guardar a -20C
para que se corra en los geles de agarosa en el momento que su instructor se lo indique.
Fotodocumentar los resultados obtenidos y discutir las diferencias observada en el gel.

Cuestionario.
1. Qu procesos de extraccin de ADN se emplearon en cada caso?

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13

2. Cules son los cuidados que se deben tener al manipular fenol?


3. Ser lo mismo obtener ADN de E. coli y de sangre humana? Sustente su
respuesta.
4. Cul es la funcin de la columna en el mtodo de extraccin de ADN por kit?

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5. Cules seran las aplicaciones de estas tcnicas en la Biotecnologa?

Preparacin de soluciones y reactivos.


1. Fenol equilibrado con Tris 1 M pH 8.0
2. Acetato de sodio 3 M pH 5.2
3. Buffer TE pH 8.0: 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA. Esterilizar

y mantener a

temperatura ambiente.

Bibliografa.
Green M.R. y Sambrook J. (2012). Molecular cloning: A Laboratory Manual (4ta edic).
Woodbury, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press.
Madigan M.T., Martinko J.M., Bender K.S., Buckley D. H.,, Stahl D. A. y Brock T. (2015).
Brock Biologa de los microorganismos (14ava edic). Madrid, Espaa: Pearson.

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14

Zymo Research. (2014). Manual intructivo del kit Quick-gDNA MiniPrep

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Extraccin de ADN plasmdico por mtodo tradicional

Objetivo.
Aislar ADN plasmdico de clulas procariotas usando un mtodo tradicional.

Introduccin.
Los plsmidos son molculas pequeas de ADN circular (entre una y varios cientos
de kilobases) que se replican de forma autnoma e independiente del cromosoma de la
clula. La inmensa mayora de los plsmidos son ADN de doble cadena (3). Son muy
comunes en bacterias y algunos de ellos, los ms pequeos, existen en las clulas
bacterianas en un nmero elevado, se caracterizan por acarrear informacin gentica extra
que es indispensable para la adaptacin de las bacterias (1).
La mayora de los plsmidos se caracterizan por:

Tener un origen de replicacin autnomo.

Tener un gen que confiere a la bacteria resistencia a antibiticos o metales pesados,


le sirve para el desempeo de alguna funcin metablica, y/o que codifica para
algn factor de virulencia

Poseer un sitio de clonacin mltiple en el que se encuentra dianas nicas para


varias enzimas de restriccin y que permite la introduccin del ADN extrao (3).
Hay varios procedimientos para la purificacin de ADN plasmdico, aunque todos

incluyen los tres pasos siguientes: (i) Crecimiento de las bacterias en un medio selectivo de
aquellas que llevan el plsmido. (ii) Lisis de las bacterias para la liberacin del plsmido.
(iii) Purificacin del ADN plasmdico. Uno de los mtodos ms empleados es el mtodo de
lisis alcalina, por su sencillez, bajo costo y reproducibilidad.

Pgina

15

La lisis alcalina utiliza las diferencias en las propiedades de desnaturalizacin y


renaturalizacin entre el ADN plasmdico y el ADN cromosmico. La alcalinizacin con
NaOH en presencia de un detergente fuertemente aninico (SDS), provoca la lisis celular,
la desnaturalizacin del ADN cromosmico y de las protenas, y la liberacin de los

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plsmidos. Los plsmidos se ven menos afectados por su pequeo tamao y estructura
superenrollada. La neutralizacin del medio en presencia de una concentracin alta de sal
(acetato potsico), provoca la precipitacin de las protenas (por el tratamiento con el
detergente y la insolubilidad de la sal potsica del SDS) y la del ADN cromosmico (por
reasociaciones aleatorias intracatenarias). Los agregados insolubles de protenas y ADN
cromosmico se separan por centrifugacin del ADN plasmdico que queda en el
sobrenadante y conserva mayoritariamente su estructura nativa (2).

Requerimientos:
Equipo

Material

Reactivos

Incubadora de agitacin

Tubos tipo falcon de 15 mL

Caldo LB

Microcentrfuga

Tubos eppendorf de 1.5

Solucin Birnie I

mL
Vrtex

Micropipetas de varios

Solucin Birnie II

volmenes
Refrigerador

Puntas azules, amarillas y

Solucin Birnie III

blancas nuevas y estriles


Concentrador de vaco

Hielo

Isopropanol absoluto fro


Etanol absoluto frio
Etanol al 75%
Agua bidestilada estril o

Pgina

16

Milli-QTM

Protocolo
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1. Centrifugar a 8000 rpm 1.5 mL de un cultivo bacteriano de 24 h, durante 2 minutos.
2. Aspirar el sobrenadante con ayuda de una punta estril y resuspender el paquete celular
en 100 L de solucin de Birnie I. Incubar 5 minutos a temperatura ambiente.
3. Adicionar 200 L de solucin de Birnie II y mezclar suavemente por inversin suavemente
por 10 veces (La solucin debe tornarse clara). Incubar 5 minutos sobre hielo.
4. Adicionar 150 L de Birnie III. Incubar de 15-30 minutos sobre hielo.
5. Centrifugar a 12000 rpm durante 10 minutos. Adicionar 600 L de isopropanol y dejar
reposar por 10 minutos.
6. Centrifugar a 14000 rpm durante 10 minutos.
7. Remover el sobrenadante y lavar el paquete con 1000 L de etanol al 75% fro, mezclar
por inversin suavemente de 7 a 10 veces y centrifugar por 10 minutos a 14000 rpm.
8. Remover tanto como sea posible el etanol y secar el tubo en el concentrador de vaco
por aproximadamente 5 minutos.
9. Resuspender el ADN en 50 L de agua estril bidestilada y guardar a -20C.

Resultados esperados.
Obtendr una resuspensin transparente que guardar a -20C para que se corra
en los geles de agarosa en el momento que su instructor se lo indique. Fotodocumentar los
resultados observados en el gel.

Cuestionario.
1. Qu finalidad tiene la neutralizacin en el mtodo de lisis alcalina?
2. Por qu la alcalinizacin en presencia de SDS afecta menos a los plsmidos que al
ADN cromosmico?

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17

3. Qu finalidad tiene el paso de incubacin con ribonucleasa A en la purificacin de ADN


plasmdico?
4. Qu usos se le puede dar a los plsmidos en Biotecnologa?

Preparacin de soluciones y reactivos


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1. Medio LB: 10 g/L de peptona de casena, 5 g/L de extracto de levadura, 10 g/L de
NaCl.
2. Birnie I: 25 mM de Tris-HCl, 10 mM de cido etilendiamino tetractico (EDTA) y
RNAsa H o A, pH 8.0.
3. Birnie II: 0.2 N de NaOH y 1.0% de dodecil sulfato de sodio (SDS)
4. Birnie III: 3 M de Acetato de potasio (KOAc), pH 4.8

Bibliografa
Balbs P. (2010). De la Biologa molecular a la Biotecnologa (2da. edic). Mxico: Trillas.
Green M.R. y Sambrook J. (2012). Molecular cloning: A Laboratory Manual (4ta edic).
Woodbury, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press.
Madigan M.T., Martinko J.M., Bender K.S., Buckley D. H.,, Stahl D. A. y Brock T. (2015).

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Brock Biologa de los microorganismos (14ava edic). Madrid, Espaa: Pearson.

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Purificacin de ADN plasmdico por silica.


Objetivo.
Purificar ADN plasmdico mediante el uso de silica.

Introduccin.
El aislamiento de ADN plasmdico a partir de bacterias es fundamental en biologa
molecular y es un paso esencial en muchos procedimientos tales como la clonacin,
secuenciacin de ADN, transfeccin y la terapia gnica. Estos procedimientos donde se
manipula el ADN requieren el aislamiento de ADN plsmido de alta pureza. En el mercado
existen a la venta columnas de intercambio aninico, aunque ampliamente utilizado, son
relativamente costosas. Un mtodo alternativo menos costoso utiliza xido de slice como
la matriz de unin al ADN. Pero tiene la desventaja de que el lipopolisacrido bacteriano
(LPS) o endotoxina, son copurificadas y pueden inhibir posibles aplicaciones posteriores.
En particular, el contenido de Lipopolisacarido puede influir en gran medida en la
transfeccin influyendo en la eficiencia. Adems, estos mtodos por lo general requieren el
uso de productos qumicos peligrosos (por ejemplo, hidrocloruro de guanidina), que actan
como sustancias caotrpica para facilitar la unin del ADN a xido de slice. Un
procedimiento ligeramente modificado es el siguiente que resulta fcil, rpido y
relativamente de bajo costo.

Requerimientos:
Equipo

Material

Cmara de electroforesis

Pgina

19

horizontal
Microcentrfuga

(14000

Tubos de polipropileno de

Reactivos
Agarosa grado Biologa

1.5 mL

Molecular

Puntas amarillas y azules

Solucin P1

rpm)

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Fuente de poder

Tubos tipo falcn de 15 mL

Solucin P2

Incubadora

Escherichia coli (pTZ18R)

Solucin P3

Asa bacteriolgica

Solucin de NaI 6M

Placas

Petri

90X15 Marcador

de

Peso

desechables

molecular de ADN de 1 KB

Micropipetas de 2-20 L,

Solucin de lavado (New

20-200 L y 200-1000 L

Wash)
Agua bidestilada estril o
Milli-QTM
Agar LB*
Glicerol
Azul de bromofenol
Ampicilina
Silica
cido Actico

Protocolo.
Una colonia de Escherichia coli que contenga un plsmido de inters (ejem.
pTZ18R) se inocula en un tubo que contenga 5 mL de medio de cultivo (LB) con el
antibitico adecuado (Amp). Se incuba toda la noche a 37C a 160 rpm.

eppendorf y se centrifuga a 5000 x g durante 5 minutos. El sobrenadante se


desecha en un recipiente adecuado para posteriormente esterilizarlo.

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20

1. 1.5 mL de cultivo bacteriano son trasferidos a un tubo de polipropileno tipo

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2. El sedimento (clulas bacterianas) libre de medio de cultivo se resuspende con 100
L de solucin P1 (con vrtex o micropipeta).
3. Agregar 200 L de solucin de lisis P2, invertir el tubo 4-6 veces (no usar vrtex),
dejando reposar en hielo 5 minutos
4. Adicionar 150 L de solucin de neutralizacin P3, invertir 4-6 veces el tubo (no usar
vrtex) dejar reposar 10 minutos en hielo y centrifugar a mxima velocidad 10
minutos
5. Recuperar sobrenadante y agregar 800 L de solucin de unin NaI mezclar por
inversin y agregar 5 L de suspensin de silica, mezclar por inversin e incubar a
temperatura ambiente 5-7 minutos
6. Centrifugar a 14000 rpm 30 s y eliminar todo el sobrenadante por decantacin y
pipeta
7. Adicionar 800 L de new wash y resuspender la silica por inversin, centrifugar a
14000 rpm/30 s, repetir procedimiento si se requiere plsmido de mejor calidad
8. Secar a 42 C de 2-5 minutos
9. Agregar 50 L de agua con ARNasa e incubar 1 hora, centrifugar y recuperar el
sobrenadante.

Resultados a documentar.
1. Observe y documente como el paquete celular sufre modificaciones al agregar las
diferentes soluciones;
2. Observe y documente la diferencia entre el paquete celular y el ADN obtenido de
ste por la metodologa de silica;
3. Documente el resultado del anlisis electrofortico del ADN purificado;
4. Compare los resultados de purificacin de ADN plasmdico con otras metodologas
realizadas.

1. Explique por qu es necesario cultivar a la bacteria Escherichia coli (pTZ18R) con


el antibitico Ampicilina;

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Cuestionario.

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2. Describa cul es la funcin de cada solucin en el proceso de purificacin de ADN
por esta metodologa
3. Explique por qu es necesario eliminar completamente el alcohol contenido en la
solucin de lavado para poder eluir el ADN de la silica

Preparacin de Soluciones y reactivos.


P1: 50 mM Tris/HCl (pH 8.0)

P2: 200 mM NaOH, 1 % SDS

10 mM EDTA
100 g/mL RNase A

P3: 3.0 M acetato de potasio, pH 5.5

Preparacin de la suspensin de silica


Moler con mortero 2 pipetas Pasteur nuevas
Resuspender en un mismo volumen de agua (Pisa)
Dejar reposar 5 minutos
Tomar la fase superior y secar
Resuspender en un mismo volumen de agua (pisa)
Tomar 1 mL de la fase superior en un tubo eppendorf y centrifugar 1 minutos a 14000rpm
Lavar 6 veces con el mismo volumen de agua (pisa)
Resuspender en agua (pisa aprox. 1 ml)

Solucin de unin de ADN a Silika

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NaI 6M
NaI KI 90 g
Sulfito de sodio 1 g

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CBP 100 mL agua
Filtrar con papel y almacenar en recipiente opaco al abrigo de la luz.

Solucin de lavado (New Wash)


100 mM NaCl
1 mM EDTA
10 mM Tris-HCl, pH 7.5
50% Etanol

Bibliografia.
Bert Vogelstein and David Gillespiet. (1979). Preparative and analytical purification of ADN
from agarose. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76(2): 615-619.
Debra A. Dederich, Geoffrey Okwuonu, Toni Garner, Amanda Denn, Angelica Sutton,
Michael Escotto, Ashley Martindale, Iliver Delgado, Donna M Muzny, Richard A
Gibbs and Michael L. Metzker. (2002). Glass bead purification of plasmid template

ADN for high throughput sequencing of mammalian genomes. Nucl Acds research
30(7): 1-5.
Etienne Joly. (1996). Purification of DNA Fragments from Agarose Gels Using Glass
Beads. Basic ADN and RNA Protocols. Methods Mol Biol. 58: 237-240.
Hamid Kheyrodin1 and Khosro Ghazvinian. (2012). ADN purification and isolation of
genomic ADN from bacterial species by plasmid purification system. African J
Agricult Research 7(3): 433-442.
Karl-Heinz Esser1, Dr. Wolfram H. Marx2 and Prof. Dr. Thomas Lisowsky. (2005). Nucleic
acid-free matrix: Regeneration of ADN binding columns. Biotechniques. 39(2): 270271.
Marko M.A., R. Chipperfield, H.C. Birnboim. (1982). A procedure for the large-scale isolation

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of highly purified plasmid ADN using alkaline extraction and binding to glass powder.
Analyt Biochem 121(2): 382387.
Osamu Yamada, Toshiya Matsumoto, Masahiro Nakashima, Shinobu Hagari,Toshio
Kamahora, Hiroshi Ueyama, Yuichiro Kishi, Hidetoshi Uemura, Takashi Kurimura.

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Manual de Prcticas de Laboratorio de Introduccin a la Biologa Molecular I


(1990). A new method for extracting ADN or RNA for polymerase chain reaction. J
Virolog Methods. 27(2): 203209.
Valter de Oliveira L.F., da Luz Wallau G., Silva Loreto E.L. (2009). Isolation of high quality
ADN: a protocol combining rennet and glass milk. Electronic J Biotech 12(2)

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24

http://www.ejbiotechnology.info/index.php/ejbiotechnology/article/view/v12n2-4/709

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Purificacin de ADN cromosmico y ADN plasmdico.


Objetivo.
Conocer, realizar y comparar el procedimiento de purificacin de ADN cromosmico
y de ADN plasmdico.

Introduccin.
La purificacin de cidos nucleicos es un requisito imprescindible para realizar
diversas tcnicas de biologa molecular. La obtencin exitosa de datos confiables y
reproducibles depende, en gran medida, de la extraccin de ADN ntegro y de su
purificacin. La extraccin consiste en el aislamiento y purificacin de molculas de ADN y
se basa en las caractersticas fisicoqumicas de la molcula.
El ADN est constituido por dos cadenas de nucletidos unidas entre s formando
una doble hlice. Los nucletidos estn integrados por un azcar (desoxirribosa), un grupo
fosfato y una base nitrogenada (adenina, guanina, timina o citosina). La unin de los
nucletidos ocurre entre el grupo fosfato y el azcar, mediante enlaces fosfodiester, dando
lugar al esqueleto de la molcula. Las bases de cadenas opuestas se unen mediante
puentes de hidrogeno y mantienen estable la estructura helicoidal. Los grupos fosfato estn
cargados negativamente y son polares, lo que le confiere al ADN una carga neta negativa
y lo hace altamente polar, caractersticas que son aprovechadas para su extraccin. Los
grupos fosfato tienen una fuerte tendencia a repelerse, debido a su carga negativa, lo que
permite disolver al ADN en soluciones acuosas y formar una capa hidratante alrededor de
la molcula. Pero, en presencia de etanol, se rompe la capa hidratante y quedan expuestos
los grupos fosfato. Bajo estas condiciones se favorece la unin con cationes como Na+ que
reducen las fuerzas repulsivas entre las cadenas de nucletidos y permiten que el ADN
precipite. Por otro lado, la carga neta negativa del ADN le permite unirse a molculas y

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matrices inorgnicas cargadas positivamente.

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Manual de Prcticas de Laboratorio de Introduccin a la Biologa Molecular I


El mtodo clsico de purificacin de cidos nucleicos se basa en el uso de
disolventes orgnicos txicos, siendo la extraccin mediante fenol/cloroformo la ms
conocida. No obstante, recientemente se han desarrollado mtodos alternativos que
emplean una alta concentracin salina en vez de disolventes orgnicos. El primer paso
consiste en la lisis de las clulas cuyo ADN se desea purificar. Este paso se realiza
mediante un detergente aninico que solubiliza los componentes celulares. Dicha rotura
celular se lleva a cabo en presencia de conservantes, que garantizan la integridad del
ADN; esto es, que impiden o limitan la accin de las ADNasas presentes en las clulas o
contaminantes del medio. El ARN presente se elimina mediante tratamiento con ARNasa.
Posteriormente se eliminan las protenas y otros contaminantes celulares, mediante
precipitacin salina (que sustituye al tratamiento clsico con disolventes orgnicos txicos).
Finalmente, el ADN genmico se asla mediante precipitacin en presencia de alcohol y se
disuelve en agua o en una solucin tamponada que puede contener conservantes del
ADN.
Existen diversos procedimientos para la purificacin de ADN, aunque todos incluyen
los tres pasos siguientes: (i) Crecimiento de las bacterias en un medio selectivo de aquellas
que llevan el plsmido. (ii) Lisis de las bacterias para la liberacin del plsmido. (iii)
Purificacin del ADN plasmdico.
El problema principal que hay que resolver es la separacin del ADN plasmdico y
ADN cromosmico.

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Requerimientos:
Equipo

Material

Reactivos

Incubador orbital.

Tubos de ensayo estriles.

Solucin isotnica GTE

Micropipetas automticas.

Tubos Eppendorf de 1,5 mL. Solucin de lisis

Cmara de electroforesis

Puntas para micropipeta de Solucin de neutralizacin

horizontal.

10, 200 y 1 000 L con filtro

Fuente de alimentacin.

Guantes.

Etanol absoluto

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Bao termostatizado.

Hielo picado.

Etanol 70%

Agitador vrtex.

Gradilla para tubos de 1.5

TE pH 8, con Ribonucleasa

o 2 mL

Transiluminador UV.
Rotuladores permanentes.

Toallas de papel

Cloroformo

Toallas de papel

Isopropanol

Contenedores de puntas

Marcador

utilizadas

molecular de 1 Kb

de

peso

TAE
Proteinasa K
RNAsa A

Protocolo.
Purificacin de ADN genmico bacteriano
a. Aadir 0,5 mL de suspensin bacteriana (esto es, cultivo en fase estacionaria
crecido durante la noche) a un tubo Eppendorf de 1,5 mL y sumergirlo en hielo
picado.
b. Centrifugar a 13.00016.000 g durante 5 segundos para precipitar las clulas.
Eliminar el mximo posible de sobrenadante: primero por decantacin; luego
dejando escurrir el tubo sobre papel absorbente limpio, o retirando restos con
micropipeta.
c. Aadir 300 L de la solucin de lisis y pipetear suavemente hacia arriba y hacia
abajo hasta que las clulas queden resuspendidas de nuevo.
d. Incubar la muestra a 80 C durante 5 minutos para lisar las clulas.

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e. Enfriar la muestra hasta temperatura ambiente.


Digestin del ARN.
f. Aadir 15 L de la solucin de ARNasa A al lisado celular.

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g. Mezclar bien la muestra, invirtiendo el tubo 25 veces.
h. Incubar a 37C durante 1560 minutos.
Precipitacin de protenas
i. Enfriar la muestra hasta temperatura ambiente. Si la misma fuera superior a 21C,
enfriar en hielo.
j. Aadir 100 L de la solucin de precipitacin de protenas al lisado celular
previamente tratado con ARNasa.
k. Agitar vigorosamente (p. ej., con agitador tipo vrtex) a alta velocidad durante 20
segundos, para mezclar uniformemente la solucin de precipitacin de protenas
con el lisado celular.
l. Centrifugar a 13.00016.000 g durante 3 minutos.
Nota: las protenas precipitadas deben formar una pella compacta.
Precipitacin del ADN
m. Decantar el sobrenadante (que contiene el ADN) a un tubo Eppendorf de 15 mL que
contenga 300 L de isopropanol (tambin llamado 2propanol) puro (100%). El
precipitado (que contiene las protenas) puede tirarse.
n. Mezclar la muestra invirtiendo suavemente 50 veces.
o. Centrifugar a 13.00016.000 g durante 1 minuto. El ADN debe ser visible como un
pequeo precipitado blanco.
p. Eliminar el sobrenadante por decantacin y escurrir el tubo en papel absorbente
q. Aadir 300 L de etanol al 70%. Invertir el tubo varias veces para limpiar el
precipitado de ADN.
r. Centrifugar a 13.00016.000 g durante 1 minuto.
s. Con cuidado, eliminar el etanol por decantacin.
t. Escurrir el tubo en papel absorbente limpio y secar la muestra al aire durante 15
minutos.
u. Rehidratar el ADN a temperatura ambiente durante toda la noche.

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v. Guardar el ADN a 28 C (~4 C) hasta su uso.

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Purificacin de ADN plasmidico
Recoleccin de la muestra
1. Se toman 1,5 mL (2 x 750 L) de un cultivo estacionario de una bacteria portadora
de un plsmido con un gen de resistencia a un antibitico.
2. Se dispensan en un tubo eppendorf y se centrifuga a temperatura ambiente, durante
3 minutos a 12.000 g.
3. Se retira el sobrenadante (2 x 750 L) con mucho cuidado y SE TIRA. Se da un
pulso de centrfuga, se retira cuidadosamente el sobrenadante y se tira. Nos
quedamos con el precipitado de las bacterias.
Proceso por Lisis alcalina
4.

Se resuspende (agitando vigorosamente) el sedimento de bacterias en 100 L de


una solucin isotnica (GTE: Glucosa, Tris y EDTA) a 4C. Se deja a temperatura
ambiente durante 5 minutos.

5.

Se aaden al mismo tubo, 200 L de la solucin de lisis (NaOH, SDS) que est a
temperatura ambiente y recin preparada. Se agita suavemente con la mano por
inversin del tubo (unas 10 veces). Se incuba 5 minutos a 4C.

Neutralizacin
6. Se aaden al mismo tubo, 150 L de la solucin de neutralizacin (acetato potsico
3M, pH 4,8). Se agita con la mano por inversin del tubo (unas 10 veces). Se incuba
5 minutos a 4C.
Aislamiento de los plsmidos
7. Los agregados macromoleculares se precipitan por centrifugacin (15 minutos a
12.000 g y 4C), formndose un sedimento blanco de aspecto lechoso. El tubo se
traslada con cuidado a la mesa de trabajo.
8. Se retira (2 x 200 L) con cuidado el sobrenadante con el ADN plasmdico y se

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dispensa en un tubo limpio (previamente marcado).


9. Se aade 1 mL de etanol absoluto (4C) al tubo en el que hemos puesto la solucin
con el ADN plasmdico. Se mezcla con la mano por inversin del tubo (unas 10
veces). Se incuba 15 minutos a 4C.

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10. Se precipitan los plsmidos por centrifugacin (15 minutos a 12.000 g y 4C), se
retira (2 x 750 L) cuidadosamente el sobrenadante y se tira.
11. Se aaden al mismo tubo, 900 l de etanol al 70% (4C). Se mezcla suavemente
con la mano por inversin del tubo (unas 10 veces).
12. Se vuelven a precipitar los plsmidos por centrifugacin (10 minutos a 12.000 g y
4C), se retira cuidadosamente el sobrenadante y se tira.
13. Se da un pulso de centrfuga, se retira cuidadosamente el sobrenadante y se tira.
Nos quedamos con el precipitado de los plsmidos.
14. Se disuelve el precipitado de los plsmidos (aspirando y soltando el lquido varias
veces con ayuda de la micropipeta) en 50 L de tampn TE (pH 8,0), con
ribonucleasa A.
15. Se incuba a temperatura ambiente 5 minutos. Mantener la muestra a 4C

Resultados a documentar
1. Observe y documente los tipos de extraccin ADN total de cada uno de los mtodos.
2.

Observe y documente las comparaciones de ADN cromosmico y ADN plasmdico

3.

Compare los resultados de extraccin de ADN con otras metodologas realizadas.

Cuestionario
1. Qu mtodos existen para extraer y purificar ADN?
2. Por qu es necesario realizar la extraccin independiente de ADN cromosmico y
de ADN plasmdico?

3. Qu elementos y qu sustancias celulares pueden degradar el material gentico?


4.

Por qu es necesaria la solucin de neutralizacin en los procesos de extraccin

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y purificacin de ADN?

Preparacin de soluciones y reactivos.

Solucin isotnica GTE:


Glucosa 50 mM, Tris-HCl 25 mM pH 8,0, EDTA 10 mM pH 8,0.

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Solucin de lisis:
0,2 N NaOH, 1% SDS, preparar fresca antes de cada extraccin de ADN plamdico.

Solucin de neutralizacin:
Acetato potsico 3 M, pH 4,8.

TE pH 8,0 con Ribonucleasa A:


Tris-HCl 10 mM pH 8,0, EDTA 1 mM pH 8,0, Ribonucleasa A 0,5 g/L.

TAE:
Tris-Acetato 40 mM, EDTA 1 mM.

Bibliografa.
Ausubel FM, Brent R, Kingston RE, Moore DD, Seidman JG, Smith JA, Struhl K (eds)
(2005): Current Protocols in Molecular Biology. Vols 1 a 4. New York: Greene &
John Wiley (New York).
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Publishers. Massachusetts, EE.UU.
Birnboim HC, Doly J (1979) A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant
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Dundass N., N. K. Leos, M. Mitui, P. Revell y B. B. Rogers. 2008. Comparison of automated
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Stormer M., K. Kleesiek y J. Dreier. 2007. High-Volume Extraction of Nucleic Acids by
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Tokuda Gaku, Nathan Lo, Aya Takase, Akinori Yamada, Yoshinobu Hayashi and Hirofumi
Watanabe. Purification and partial genome characterization of the bacterial
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endosymbiont Blattabacterium cuenoti from the fat bodies of cockroaches BMC

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Cuantificacin de ADN en geles de agarosa.


Objetivo.
Estimar la concentracin de ADN por comparacin de la densidad de las bandas
en un gel de agarosa

Introduccin.
Existen una gran variedad de mtodos de extraccin y purificacin de ADN, la eleccin
del mtodo depender del origen de la muestra, del grado de pureza y calidad que se requiere
para su uso posterior.
Luego de la extraccin del ADN, son necesarias la cuantificacin y confirmacin de
la integridad de las molculas obtenidas. Si no es posible cuantificar el ADN por mtodos
espectrofotomtricos la estimacin de la concentracin se puede llevar a cabo mediante
su visualizacin en geles de agarosa.
Los geles de agarosa se preparan fundiendo agarosa en presencia del buffer
adecuado hasta que se logre una solucin transparente. La solucin fundida es puesta en
un molde donde gelifica. El gel forma una matriz cuya densidad est determinada por la
concentracin de agarosa. Cuando se aplica un campo elctrico a travs del gel, el ADN
migra hacia el nodo por los grupos fosfato que confieren carga neta negativa a estas
molculas. La velocidad de migracin de las molculas de ADN est en funcin de su
tamao, de la conformacin de la molcula, la concentracin de la agarosa y el voltaje
aplicado a la cmara de electroforesis.
Las molculas de ADN una vez que migraron en la matriz de agarosa pueden
visualizarse mediante tincin con diferentes colorantes siendo el ms comnmente utilizado
el bromuro de etidio. Este colorante se intercala en el ADN y al hacer incidir luz UV sobre
La estimacin de la concentracin de ADN se obtendr al comparar la fluorescencia emitida
por la muestra problema con la fluorescencia emitida por patrones de peso molecular.

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el gel de agarosa se emite una fluorescencia la cual es proporcional a la cantidad de ADN.

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Fig. 1 Cmara de electroforesis horizontal

Requerimientos:
Equipo

Material

Reactivos

Cmara de electroforesis 1 juego de micropipetas P1000, Solucin de Agarosa 1%


horizontal

P200 y P10

Fuente de Poder

Puntas

w/v
de

diferentes Marcador

capacidades (10, 200 y 1000 L)


Transiluminador

de

peso

molecular (100pb)
Solucin de bromuro de
etidio (10 mg/mL)
Buffer de carga
Buffer TAE 1X
Agua desionizada
Muestras de ADN

Protocolo.
1. Pesar 0.5 g de agarosa y mezclarla en un matraz de 250 mL con 50 mL de buffer

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33

TAE 1X. Fundir la solucin de agarosa en un horno de microondas (en intervalos de


30 segundos) hasta que la solucin se aprecie totalmente transparente.
2. Preparar la cmara de electroforesis con el peine adecuado en funcin del nmero
de muestras.

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3. Verter la solucin de agarosa en la cmara de electroforesis y permitir la
polimerizacin del gel.
4. Retirar el peine y adicionar buffer TAE 1X en el depsito de la cmara de
electroforesis
5. Colocar 2 L de las muestras problema de ADN y del marcador de peso molecular
conocido previamente mezcladas con 2 L de buffer de carga dentro de los pozos

Fig. 2 Esquema para la preparacin del gel de agarosa


6. Conectar la cmara de electroforesis a la fuente de poder e iniciar el corrimiento a
90V por un periodo entre 45 minutos a 1 hora
7. Preparar una solucin de bromuro de etidio a la concentracin (10 mg/mL) en un
volumen de 100 mL.
Precaucin: El Bromuro de Etidio es un mutagnico poderoso y txico. Evitar
inhalacin del polvo. Utilizar guantes al trabajar con soluciones de BrEt.

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34

8. Sumergir el gel en el bromuro de etidio por 10 segundos.


9. Enjuagar el gel en agua para eliminar el exceso de bromuro de etidio.
10. Colocar el gel sobre el transiluminador y encender la lmpara de luz UV colocando
la mampara de acrlico para proteccin contra la luz UV.

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11. Obtener una imagen del gel.
12. Comparar la densidad de la banda de ADN con las bandas del marcador de peso
molecular.
13. Y hacer la estimacin de la concentracin.

Resultados a documentar.
1. Observe y documente las caractersticas fsicas de la muestra de ADN a
cuantificar.
2. Observe y documente la ventaja de utilizar buffer de carga en este protocolo.

3. Documente algunas condiciones durante la electroforesis que puedan dificultar


la visualizacin de la muestra de ADN.

Cuestionario.
1. Menciones otros mtodos de cuantificacin de ADN.
2. Que otros colorantes hay para visualizar el ADN .
3. Qu ventajas tiene el Bromuro de etidio sobre otros colorantes.

Preparacin de soluciones y reactivos.

TAE 1X
Tris

2.42 g

EDTA

0.373g

Ac. Actico

0.572 mL

Aforar a 500 mL con agua desionizada y ajustar pH =8

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Buffer de carga
Azul de bromofenol

0.25%

Xileno cyanol FF

0.25%

Ficoll (Tipo 400)

15%

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Nota:
a. El Bromuro de Etidio tiene propiedades mutagnicas a concentraciones muy bajas,
(hasta 0.01 g/mL), por lo que se deben extremar las precauciones en su
manipulacin y realizar una gestin adecuada de los residuos generados.
b. La luz UV y/o radiacin UV es peligrosa y puede causar daos a la retina de los
ojos. Jams se debe ver directamente la luz UV desprotegida. La luz UV es tambin
mutagnica y carcinognica. Para minimizar el riesgo de exposicin, la fuente de luz
UV debe ser resguardada adecuadamente. Utilizar guantes protectores adecuados
al sostener materiales bajo una fuente de luz UV.

Bibliografa
Sambrook, J. y Russell, D. W. (2001). Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3 ed).

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Nueva York. USA: Cold Spring Harbor Laboratories Press.

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Cuantificacin de ADN por espectrofotometra


Objetivo.
Conocer la calidad y cantidad del ADN obtenido mediante la espectrofotometra.

Introduccin.
El espectrofotmetro se funda en la transmisin de la luz a travs de una solucin
para determinar la concentracin de un soluto presente en la misma. Cada molcula
absorbe la energa radiante a una longitud de onda especfica, a partir de la cual es posible
extrapolar la concentracin de un soluto en una solucin. Las protenas y los cidos
nucleicos absorben la luz en el intervalo ultravioleta, a longitudes de onda comprendidas
entre los 210 y los 300 nm, la absorbancia mxima de las soluciones de ADN y ARN
corresponde a 260. Dado que las soluciones de ADN y ARN absorben parcialmente la luz
a 280 nm y las que contienen protenas hacen lo propio a 260 nm, el cociente de los valores
obtenidos a 260 nm y a 280 nm (A 260/ A280) proporciona una estimacin del grado de pureza
de los cidos nucleicos. Los cocientes A 260/ A280 respectivos del ADN y el ARN puros son
aproximadamente de 1,8 y 2,0. Con un paso de luz de 10 mm y una longitud de onda de
260 nm, una absorbancia A = 1 corresponde aproximadamente a 50 g/ml de ADN
bicatenario, 37 g/ml de ADN monocatenario, 40 g/ml de ARN o 30 g/ml de
oligonucletidos.
Para cuantificar la cantidad de material obtenido despus de una extraccin de
cidos nucleicos o la sntesis qumica de un oligonucleico, se debe tomar una lectura a
longitudes de onda de 260 nm y 280 nm. La lectura a 260 nm permitir calcular la
concentracin de cidos nucleicos en la muestra.
Se toma como referencia que una O.D. (Densidad ptica), medida a 260 nm,
corresponde aproximadamente a:
150 g/ml de ADN de doble cadena,

320 g/ml cuando se trata de oligonucleotidos.

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240 g/ml de ARN o de ADN de cadena sencilla

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La proporcin de la lectura entre 260 y 280 (OD 260/OD280) proporciona una
estimacin de la pureza del cido nucleico. Es as como preparaciones puras de ADN tienen
OD 260/OD280 de 1.8. Cuando se trata de ARN el valor OD 260/OD280 es muy cercano a
2.0. Si hay contaminacin con protenas o fenol u otras soluciones empleadas durante la
extraccin, el valor de la proporcin es menor a 1.8 y no es posible cuantificar de manera
precisa el DNA.

Requerimientos.
Equipo

Material

Reactivos

Microcentrifuga

Cubeta de cuarzo

Tris HCl, EDTA

Espectrofotmetro

Puntas estriles

Agua desionizada estril

Vrtex

Gradilla

Solucin TE

Micropipeta

Tubos
Guantes, material de limpieza

Protocolo.
1. Tomar el ADN en estudio y realizar una dilucin 1/10 en buffer TE. Preparar1ml de
esta dilucin.
2. Colocar la solucin de ADN en la cubeta de cuarzo. Esta cubeta debe haber sido
previamente lavada con 1 ml de extran diluido, agua destilada y purgada con
solucin TE. Si es necesario, adicionar etanol absoluto para lograr su completo
secado.
3. En otra cubeta colocar como solucin blanco, el TE si el ADN fue rehidratado con

4. Realizar la medicin a 260 nm y a 280 nm.

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este buffer o agua destilada, si fue esta la solucin de hidratacin.

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5. Para determinar pureza, se utiliza la razn ADN/protenas. La abundancia de
protenas residuales en el extracto se determina midiendo A280nm.
6. Realizar los clculos respectivos, utilizando la siguiente ecuacin para estimar la
biomasa de la muestra:
g/ml de ADN = (A260 X Factor dilucin X 50 g ADN/ml)
7. Estimacin de ADN total:
g ADN/ml g = (A260X 20 X 50g ADN/ml) / (vol. muestra (ml g))

Resultados a documentar
1. Observe y documente los datos de la estimacin de ADN total de cada una de las
muestras
2.

Observe y documente las comparaciones de pureza de ADN.

3.

Documente los resultados mediante grficas de las absorbancias obtenidas de la


(s) muestra (s) de DNA;

4.

Compare los resultados de cuantificacin de ADN con otras metodologas


realizadas.

Cuestionario.
1. Por qu considera, que es necesario realizar la estimacin de la concentracin del ADN
aislado?
2. Por qu se debe realizar una dilucin de la muestra antes de medir la D.O. en el
espectrofotmetro?
3. Por qu slo se toma en cuenta la D.O. a 260 nm en la estimacin de la concentracin
del ADN? Qu informacin nos provee la D.O. a 280 nm?
4. Compare sus resultados (Concentracin de ADN y relacin de pureza D.O.260:D.O.280)

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con los del resto del grupo.aAbs260 Abs280 Abs260/Abs280

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Bibliografa.
Catlogos y fichas tcnicas 2012 de las casas comerciales: Invitrogene, Promega, Biorad,
Biologend, Bioline, Roche.
Lizcano Losada F.

2005. Fundamentos moleculares en medicina. Manual Moderno.

Universidad de la Sabana.
Solano F. G., Mrquez C M.P., Shuler I. 2009. Optimizacin de la extraccin de ADN de

Passiflora ligularis para el anlisis por medio de marcadores moleculares.


Universitas Scientiarum 14 (1) 16-22.
Vargas R., Rangel L.F. Caola E. A., Rodriguez J. E. L., Kilger J.C., Bastidas G. A.E. 2006.
Deteccin y cuantificacin de niveles de ADN circulante en suero humano utilizando

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40

espectrofotometra UV-Visible. Rev. Colombiana de Fsica 38(2) 946-949.

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Extraccin por kit de ARN bacteriano.


Objetivo.
1. Extraer ARN de clulas procariotas utilizando un procedimiento comercial as como
adquirir conocimiento bsico para el manejo y cuidado del ARN extrado

Introduccin.
La mayora de protocolos para extraccin de ARN estn basados en el mtodo
descrito por Chomezynski y Sacchi, el cual se basa en el aislamiento de este cido nucleico
empleando fenol-cloroformo e isotiocianato de guanidina. Cada uno de estos componente
juega un papel especfico: el cido tiosanato de guanidina es sumamente fuerte y tiene un
alto poder denaturalizante; el fenol, al estar acidificado, provoca que el ADN se acumule en
la interfase entre la fase acuosa y la del fenol, dejando al ARN en la fase acuosa. Debido a
su estructura qumica el ARN es una molcula muy frgil que puede romperse por accin
de los grupos 2-OH (altamente reactivos) adyacentes al esqueleto de ribosa-fosfato.
La mayor dificultad para la obtencin de preparaciones de ARN es que la mayora
de las ARNasas, que degradan nuestras molculas de inters, son enzimas muy estables
y activas no requiriendo cofactores para su funcionamiento. Una pequea cantidad de las
mismas que permanezca como contaminante en nuestra preparacin puede constituir un
verdadero problema. Por lo que es importante tratar las muestras con ADNasas libres de
ARNasas.
Existen paquetes comerciales para estabilizacin de muestras de ARN de
compaas como QIAGEN, Ambion y RNA-works, que en general funcionan con una mezcla
de anticuerpos especficos para ribonucleasas, inhibidores de ribonucleasas y/o contienen
compuestos que neutralizan a los grupos 2-OH (como es el caso de RNA-works). Nosotros
el desarrollo de esta prctica.

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emplearemos el Kit comercial ZR Fungal/Bacterial RNA Micropipet (Zymo Research) para

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Requerimientos:
Equipo
Microcentrfuga

Material

Reactivos

Tubos eppendorf de 1.5mL

ZR

Fungal/Bacterial

RNA

Micropipet (Zymo Research) (3)


Vrtex

Micropipetas

de

varios MgSO4 7H2O 10 mM

volmenes
Campana de Flujo Puntas
Laminar

azules,

estril
amarillas

y Etanol 95-100%

blancas
Asa bacteriolgica
Mechero

Protocolo.
1. Un da previo a la prctica se inocula una colonia de clulas de E. coli en 5 mL de
caldo LB usando el antibitico respectivo. Incubar a 37C toda la noche con
agitacin.
2. Al da siguiente resuspender en MgSO47H2O 10 mM estril las clulas bacterianas
que crecieron el da anterior en los tubos eppendorf. Agitar en vrtex y centrifugar a
mxima velocidad. Decantar.
3. Resuspender las clulas en 800 L en RNA Lysis Buffer y transferir la mezcla a un
tubo ZR Bashing Bead Lysis.
4. Ensamblar el dispositivo anterior en un tubo Bead beater y centrifugar 1 minuto a
12,000 x g
5. Transfiera 400 L del sobrenadante a una columna Zymo-Spin IIIC adaptada a un
tubo de coleccin (Collection tube) y centrifugue a 8,000 x g por 30 segundos

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42

(guarde el flujo recolectado en el tubo de coleccin).


6. Aada 0.8 volmenes de etanol 95-100% y mezcle bien en el vrtex.
7. Transfiera la mezcla a una columna Zymo-spin IC colocada previamente dentro de
un tubo de coleccin.

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8. Aada 400 L de RNA Prep Buffer a la columna. Centrifugar a 12,000 x g por 1
minuto. Deseche el flujo recolectado y colocar la columna Zymo-spin IC dentro del
mismo tubo de coleccin.
9. Aadir 800 L de RNA Wash Buffer a la columna. Centrifugar a 12,000 x g por 30
segundos. Deseche el flujo recolectado y colocar la columna Zymo-spin IC dentro
del mismo tubo de coleccin. Repetir este paso con 400m L de RNA Wash Buffer.
10. Centrifugue la columna Zymo-spin IC a 12,000 x g por 2 minutos. Y asegurarse de
remover todo el wash buffer.
11. Remover la columna Zymo-spin IC del tubo de coleccin y colocarla dentro de un
tubo eppendorf de 1.5 mL libre de ADNasas/RNAasas (estril).
12. Aadir 6 L de DNAase/RNAase-Free water directamente a la

matriz de la

columna y dejar en reposo por 1 minuto.


13. Centrifugar a 10,000 x g por 30 segundos para eluir el ARN de la columna.
14. El ARN puede ser usado inmediatamente o puede almacenarse a -70C
15. Etiquetar el tubo eppendorf con el nmero del equipo.

ZR

Fungal/Bacterial

RNA MicroPrep TM.

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Diagrama:

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Resultados a documentar.
1.

Observe y documente las caractersticas fenotpicas del cultivo tanto en placa como
en tubo.

2.

Observe y describa el paso del protocolo que se debe cuidar para evitar que el ARN
se contamine y se degrade.

3.

Documente el rendimiento y calidad de la muestra obtenida mediante la utilizacin


de un kit comercial y comprela con el rendimiento obtenido utilizando un protocolo
no comercial.

Cuestionario
1.

Mencione tres ventajas y desventajas de utilizar kit comercial o protocolo tradicional


para extraer ARN.

2.

Investigue algunos pasos a considerar para que durante la electroforesis de ARN se


impida la degradacin de la muestra.

3.

Investigar en que pruebas de Biologa molecular se puede utilizar el ARN purificado.

Bibliografa
Chomczynski P. and Sacchi. (1987). Anal Biochem. 162:156.
Falcn L.I. y Valera A. (2007). Las Herramientas Moleculares (quinta parte). Extraccin de
cidos nucleicos: Captulo 16. Ecologa Molecular. Luis E. Eguiarte, Valeria Souza
y Xitlali Aguirre (Compiladores).

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ZR Fungal/Bacterial RNA MicroPrep TM. Instruction Manual. Zymo Research.

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Conclusin del manual.


Las metodologas de purificacin y anlisis de cidos nucleicos son bsicas e
importantsimas en cualquier procedimiento de Biologa Molecular, por lo que este manual
ser de gran ayuda al estudiante que se inicia en desarrollar habilidades y destrezas en la

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materia.

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Manual de Prcticas de Laboratorio de Introduccin a la Biologa Molecular I

Bibliografa General.
Ausubel FM, Brent R, Kingston RE, Moore DD, Seidman JG, Smith JA, Struhl K (eds)
(2005): Current Protocols in Molecular Biology. Vols 1 a 4. New York: Greene &
John Wiley (New York).
Avise J. C. 2004. Molecular markers, natural histori and evolution. Sinauer Associates, Inc.
Publishers. Massachusetts, EE.UU.
Balbs P. (2010). De la Biologa molecular a la Biotecnologa (2da. edic). Mxico: Trillas.
Bert Vogelstein and David Gillespiet. (1979). Preparative and analytical purification of ADN
from agarose. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76(2): 615-619.
Birnboim HC, Doly J (1979) A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant
plasmid ADN. Nucleic Acids Research 7: 1513-1523.
Catlogos y fichas tcnicas 2012 de las casas comerciales: Invitrogene, Promega, Biorad,
Biologend, Bioline, Roche.
Chomczynski P. and Sacchi. (1987). Anal Biochem. 162:156.
Debra A. Dederich, Geoffrey Okwuonu, Toni Garner, Amanda Denn, Angelica Sutton,
Michael Escotto, Ashley Martindale, Iliver Delgado, Donna M Muzny, Richard A
Gibbs and Michael L. Metzker. (2002). Glass bead purification of plasmid template

ADN for high throughput sequencing of mammalian genomes. Nucl Acds research
30(7): 1-5.
Dundass N., N. K. Leos, M. Mitui, P. Revell y B. B. Rogers. 2008. Comparison of automated
nucleic acid extraction methods with manual extraction. Journal of Molecular
Diagnostics 10: 311-316.
Etienne Joly. (1996). Purification of DNA Fragments from Agarose Gels Using Glass
Beads. Basic ADN and RNA Protocols. Methods Mol Biol. 58: 237-240.

Pgina

46

Falcn L.I. y Valera A. (2007). Las Herramientas Moleculares (quinta parte). Extraccin de
cidos nucleicos: Captulo 16. Ecologa Molecular. Luis E. Eguiarte, Valeria Souza
y Xitlali Aguirre (Compiladores).

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Manual de Prcticas de Laboratorio de Introduccin a la Biologa Molecular I


Green M.R. y Sambrook J. (2012). Molecular cloning: A Laboratory Manual (4ta edic).
Woodbury, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press.
Hamid Kheyrodin1 and Khosro Ghazvinian. (2012). ADN purification and isolation of
genomic ADN from bacterial species by plasmid purification system. African J
Agricult Research 7(3): 433-442.
Karl-Heinz Esser1, Dr. Wolfram H. Marx2 and Prof. Dr. Thomas Lisowsky. (2005). Nucleic
acid-free matrix: Regeneration of ADN binding columns. Biotechniques. 39(2): 270271.
Lizcano Losada F.

2005. Fundamentos moleculares en medicina. Manual Moderno.

Universidad de la Sabana.
Madigan M.T., Martinko J.M., Bender K.S., Buckley D. H.,, Stahl D. A. y Brock T. (2015).
Brock Biologa de los microorganismos (14ava edic). Madrid, Espaa: Pearson.
Marko M.A., R. Chipperfield, H.C. Birnboim. (1982). A procedure for the large-scale isolation
of highly purified plasmid ADN using alkaline extraction and binding to glass powder.
Analyt Biochem 121(2): 382387.
Osamu Yamada, Toshiya Matsumoto, Masahiro Nakashima, Shinobu Hagari,Toshio
Kamahora, Hiroshi Ueyama, Yuichiro Kishi, Hidetoshi Uemura, Takashi Kurimura.
(1990). A new method for extracting ADN or RNA for polymerase chain reaction. J
Virolog Methods. 27(2): 203209.
Sambrook, J. y Russell, D. W. (2001). Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3 ed).
Nueva York. USA: Cold Spring Harbor Laboratories Press.
Solano F. G., Mrquez C M.P., Shuler I. 2009. Optimizacin de la extraccin de ADN de

Passiflora ligularis para el anlisis por medio de marcadores moleculares.


Universitas Scientiarum 14 (1) 16-22.
Stormer M., K. Kleesiek y J. Dreier. 2007. High-Volume Extraction of Nucleic Acids by
Magnetic Bead Technology for Ultrasensitive Detection of Bacteria in Blood

Tokuda Gaku, Nathan Lo, Aya Takase, Akinori Yamada, Yoshinobu Hayashi and Hirofumi
Watanabe. Purification and partial genome characterization of the bacterial

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Components. Clinical Chemistry 53: 104110.

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endosymbiont Blattabacterium cuenoti from the fat bodies of cockroaches BMC
Research Notes 2008, 1:118p.
Valter de Oliveira L.F., da Luz Wallau G., Silva Loreto E.L. (2009). Isolation of high quality
ADN: a protocol combining rennet and glass milk. Electronic J Biotech 12(2)
http://www.ejbiotechnology.info/index.php/ejbiotechnology/article/view/v12n2-4/709
Vargas R., Rangel L.F. Caola E. A., Rodriguez J. E. L., Kilger J.C., Bastidas G. A.E. 2006.
Deteccin y cuantificacin de niveles de ADN circulante en suero humano utilizando
espectrofotometra UV-Visible. Rev. Colombiana de Fsica 38(2) 946-949.
ZR Fungal/Bacterial RNA MicroPrep TM. Instruction Manual. Zymo Research.

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Zymo Research. (2014). Manual intructivo del kit Quick-gDNA MiniPrep

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