Metode moderne de

control microbiologic
al alimentelor
Suport Curs Masterat Anul I

Titular curs: Conf. dr. Marcel Avramiuc

Metodele de evaluare a populaiilor microbiene

Metode directe, care permit evaluarea concentraiei de celule sau a biomasei;
Metode indirecte, n care evaluarea se va face prin analiza unui parametru aflat n
corelaie cu coninutul de biomas (turbiditatea mediului cultivat, fluorescena,
impedana);
Metode culturale, care necesit o perioad de incubare pentru creterea
coloniilor i stabilirea rezultatului analizei;
Metode automatizate, "on line", care permit analiza direct a probelor din
fermentator, sau metode care necesit prelevarea aseptic de probe pentru analiz.

Tehnici de diluare
Serii liniare, n care concentraia de microorganisme descrete n progresie
aritmetic (de exemplu: 0.8/0.6/0.4/0.2) i care sunt puin utilizate;
Serii logartmice (diluii decimale), n care concentraia de microorganisme
descrete n progresie geometric (ex. 0,1/0,01/0,001/0,0001 etc.).
Pentru realizarea diluiilor decimale, ntr-un numr de eprubete sterile egal cu
numrul de diluii necesar a se efectua, se pipeteaz aseptic 9 cm3 de lichid de diluie (ser
fiziologic steril, ap distilat steril, mediu Ringer - pentru Escherichia coli).

Tehnici de concentrare
Sunt utilizate n special pentru punerea n eviden a microorganismelor
patogene;
Metode de mbogire, care presupun inocularea probei de analiz ntr-un mediu
favorabil pentru multiplicarea rapid a celulelor aflate n concentraii reduse n proba de
analizat i, dup termostatare n condiii optime de cultivare, se verific prezena sau
absena microorganismelor analizate, cu sau fr o determinare efectiv a concentraiei
de celule;
Metode de separare fizic sau fizico-chimic a celulelor prin filtrare,
centrifugare, floculare, sedimentare, n care se determin concentrarea celulelor pe
unitatea de volum, ceea ce asigur posibilitatea evidenierii lor ulterioare prin tehnici
directe sau culturale;
2

Metode de separare prin interaciuni hidrofobe-hidrofile, interaciuni ale

sarcinilor electrice, anticorp-antigen, cu lectine.

I. TEHNICI MODERNE DE ESTIMARE DIRECT A

NUMRULUI DE MICROORGANISME
Estimarea electronic a numrului de microorganisme
Aparatul de tip Coulter
funcioneaz

dup

urmtorul

principiu:
De o parte i de alta a unui
tub prevzut cu un orificiu calibrat
sunt dispui doi electrozi de platin
imersai ntr-un electrolit, ale cror
borne sunt conectate la tensiune
continu.
Prin aspiraia provocat la
partea superioar a tubului, celulele
aflate n exteriorul tubului trec pe rnd prin orificiu i deplaseaz o dat cu fiecare pasaj
un volum de electrolit egal cu cel al celulei. Aceasta provoac o cretere tranzitorie a
rezistenei circuitului, ceea ce genereaz un impuls electric a crui amplitudine este
proporional cu volumul celulei.
Impulsurile fiind de foarte scurt durat, aparatul permite numrarea unui numr
mare de celule, una cte una, ntr-un timp foarte scurt.
Este posibil i o clasificare a celulelor n funcie de de volumul lor.
Aceast tehnic, dei sofisticat, este considerat extrem de interesant i se aplic
cu succes pentru analiza suspensiilor de drojdii, realiznd simultan cu numrarea i
dimensionarea celulelor.
Rezultatele sunt reproductibile cnd se utilizeaz suspensii diluate de celule;
Sarcina electric a celulelor poate influena analiza conducnd la obinerea de
rezultate eronate;
3

 Aceast tehnic nu se poate aplica n cazul culturilor ce conin n suspensie, alturi

de celulele microorganismului cultivat, i particule solide.

Citometrie n flux
Permite numrarea i aprecierea strii fiziologice a celulelor, cnd detecia se
face prin msurarea fluorescentei emise de celulele n prealabil marcate cu un colorant
(fluorocrom).
Dup colorare, celulele sunt antrenate printr-un orificiu ngust i trec una cte
una prin faa unei surse luminoase.
Fluorescenta

emis

de

fiecare

microorganism

este

captat

printr-un

fotomultiplicator i analizat. Rezultatele sunt traduse pe o histogram care red numrul

de evenimente n funcie de intensitatea fluorescentei. Aceast histogram traduce deci
un profil al populaiei.
Adesea markerii colorani utilizai pot oferi diferite tipuri de rspunsuri:
Dac colorantul este un marker de viabilitate, din histogram se deduce numrul
de celule viabile i starea fiziologic a populaiei.
Dac histograma cuprinde net dou picuri este posibil numrarea separat a
microorganismelor dintr-o cultur mixt (de exemplu, streptococi i lactobacili).
Dac markerul este un anticorp se pot numra specific anumite microorganisme
dintr-o populaie heterogen.

Principiul de funcionare al citometrului n flux: a, b exemple de sisteme de detecie c

diagram de repartiie a dimensiunilor

Tehnica de microscopie n fluorescen i imunofluorescen

Tehnica de microscopie n fluorescen utilizeaz colorani specifici pentru
diferenierea celulelor vii de cele moarte.
Prin suspensionarea celulelor de drojdie n soluie diluat de albastru de metilen
cu citrat n preparat microscopic se vor putea diferenia celulele vii (incolore) de cele
moarte (colorate n albastru).
n mod similar, pot fi difereniate bacteriile vii de cele moarte dup colorare cu
acridin oranj.
Tehnica de microscopie n imunofluorescen permite detectarea unei categorii
particulare de microorganisme cu ajutorul anticorpilor specifici.

Tehnica DEFT Direct Epifluorescent Filter Technique

Cupleaz filtrarea prin membrane cu colorarea vital a celulelor. Se aplic n
cazul analizei microbiologice a produselor lichide (bere, vin, lapte).
Numrarea se realizeaz prin studiu microscopic, dup filtrarea produsului prin
membran (sau diluarea sa) i colorarea vital a celulelor.
Procedeul este rapid (10-20 min) i sensibil. Limita de detecie este de 104
microorganisme/cm3, utiliznd volume de probe de 100 cm3.
Numrarea se poate realiza cu un microscop optic obinuit dup colorare cu
albastru de metilen, albastru Loeffler sau amestec fucsin-albastru de metilen.
Rezultate mai bune se obin cnd numrarea se realizeaz cu un microscop cu
fluorescent sub lumin UV. n acest caz se utilizeaz colorani fluoresceni
(fluoresceina, primulina, auramina, acridin oranj, galben de acridin, acriflavina) ce
permit studiul la grosismente mici cu evidenierea celulelor vii i a celor moarte.

II. TEHNICI INDIRECTE (CULTURALE) DE EVALUARE A

NUMRULUI DE MICROORGANISME
A. metode de cultivare pe medii dense (metoda cultural Koch);
B. metode de cultivare n medii lichide (metoda titrului - metoda tuburilor
multiple; metoda diluiilor limit).
5

Dezavantaje: volum mare de munc, sunt necesare ustensile sterile i medii de

cultur adecvate, iar rezultatul analizei se obine dup un timp de termostatare necesar
dezvoltrii i multiplicrii celulelor, difereniat n funcie de natura microorganismelor (n
general: 3-5 zile/25...28C -pentru fungi; 2 zile/37C - pentru bacterii aerobe mezofile).

A. Numrarea microorganismelor prin cultivare pe medii dense

Const n inocularea unui volum cunoscut din suspensia de celule pe medii de
cultur solidificate, n plci Petri i, dup o perioad de cultivare n condiii optime, se
numr coloniile formate.
Rezultatul se exprim n:
numr de microorganisme [N/cm3 sau g] - n cazul microorganismelor care prezint
celule individuale, neasociate;
uniti formatoare de colonii (ufc) [ufc/cm3 sau g] n cazul microorganismelor la
care celulele formeaz asociaii (lanuri, pachete, pseudomiceliu).

Tehnici de cultivare i numrare a microorganismelor: a - prin

filtrare; b - prin diluare (sau inoculare n volume mari)

A. 1. Tehnica clasic de numrare prin cultivare pe medii dense,

n plci Petri
Metodologia de analiz presupune adoptarea a dou modaliti de inoculare a
celulelor n/pe mediul de cultur solidificat, n plci Petri, i anume:
a. inoculare n masa mediului solidificat, cnd 1 cm3 din fiecare diluie se
transfer cu cte o pipet steril n plci Petri sterile. Peste suspensia din fiecare plac se
repartizeaz cte o eprubet de mediu de cultur specific, cu agar (10-15 cm3), fluidificat
i temperat la 40...45C. Mediul se omogenizeaz cu suspensia din plac prin micri
orizontale, circulare ale plcii. Dup solidificarea mediului, prin termostatare n condiii
optime, se vor forma colonii att la suprafaa mediului ct i n profunzimea acestuia.
Acest mod de cultivare este cel mai favorabil pentru microorganismele facultativ
anaerobe, dar i microorganismele aerobe le tolereaz destul de bine. n cazul
microorganismelor anaerobe se recomand cultivarea n dublu strat, adic dup
nglobarea celulelor n mediu i solidificare, primul strat de mediu se acoper cu nc un
strat de mediu steril;
b. inoculare prin rspndirea celulelor pe suprafaa mediului solidificat - 0,1
cm3 prob diluat se transfer ntr-o plac Petri steril, n care, n prealabil, a fost
repartizat mediul de cultur cu agar. Suspensia se rspndete uniform pe ntreaga
suprafa a mediului de cultur cu ajutorul unui instrument special (de exemplu, spatul
Drigalski). Aceast tehnic prezint dezavantajul c unele celule pot s rmn ataate de
instrumentul de etalare, cu efecte negative asupra acurateei rezultatului analizei.
Pentru obinerea unor rezultate mai concludente se recomand inocularea a cte
dou plci n paralel pentru fiecare diluie analizat.

Numrarea indirect a microorganismelor prin cultivare pe medii

dense

Citirea i interpretarea rezultatelor

Dup termostatarea n condiii optime, apariia vizibil a coloniilor va depinde de
particularitile fiziologice ale microorganismelor cultivate i de condiiile de cultivare,
de obicei dup 48-72 h de cultivare.
n funcie de numrul de colonii evideniate n plcile din care s-a fcut
numrarea se va calcula numrul de microorganisme pe gram sau cm3 prob de analiz,
cu formula: ufc/cm3 (g) = n d
n care d este coeficientul de diluie corespunztor plcii din care s-a realizat
numrarea.
n cazul n care pentru aceeai diluie s-au inoculat cte dou plci n paralel, n
reprezint media aritmetic a coloniilor numrate n cele dou plci.
In cazul numrrii coloniilor punctiforme se pot folosi sisteme dotate cu surs de
lumin, lup pentru mrirea imaginii i un dispozitiv de marcare i nregistrare a
coloniilor numrate.

A.2. Utilizarea Petrifilmelor pentru analiza microbiologic

cantitativ i calitativ
"Petrifilms" - discuri n care mediul de cultur specific este deshidratat i
acoperit cu o folie din plastic. La inocularea a 1 cm3 suspensie de celule, apa coninut n
suspensie

rehidrateaz

mediul

prin

termostatare

este

posibil

creterea

microorganismelor. Exist diferite tipuri de Petrifilm pentru: numr total de

microorganisme, drojdii, bacterii coliforme.
Avantaje: reducerea timpului de analiz, reducerea preului de cost/prob,
creterea numrului de probe analizate, creterea calitii i mbuntirea substanial a
productivitii.
Tehnica de utilizare a Petrifilmelor

Tip Petrifilm
Petri film 3M bacterii aerobe

Caracteristici
determinarea numrului total de bacterii aerobe;
analiza este eficient prin prezena unui indicator care
coloreaz coloniile n rou
Petrifilm jM1'1 drojdii i determinarea numrului total de drojdii i mucegaiuri;
mucegaiuri
nu necesit adugarea de antibiotice sau acid tartric
Petrifilm
3M evideniere bacterii din familia Enterobacteriaceae;
Enterobacleriaceae
producerea de acid evideniat cu ajutorul unui
indicator de pH ce vireaz n galben;
evideniere formare gaz prin fermentaia heterolactic
a lactozei
Petrifilm 3M coliformi totali
evideniere coliformi totali;
analiza este nlesnit de prezena unui indicator care
coloreaz coloniile n rou;
filmul superior reine gazele rezultate prin fermentaia
substratului lactoz

Petrifilm 3M de nalt evideniere bacterii coliforme la diluii mari n probele

sensibilitate pentru evideniere de analizat - 1-2 celule/g;
bacterii coliforme - HSCC
permite inocularea a 5 cm' prob sau diluii ale
acesteia;
evaluare identic cu Petrifilm 3M coliformi totali
i fecali
Petrifilm 3M Escherichia coli dou teste n unul singur: evaluare cantitativ a
coliformilor fecali i a lui E. coli;
conine indicator P-glucuronidaz pentru evidenierea
lui E coli;
rezultate pozitive n 24-48 h:
nalt selectivitate
Petrifilm 3M coliformi 2000 dezvoltarea rapid a bacteriilor coliforme;
(P2000)
indicator depH foarte sensibil - evidenierea producerii
de acid chiar de la nceputul formrii coloniilor;
reducerea timpului de analiz prin asigurarea unei
creteri accelerate;
rezultate test prezumtiv n 6-14 h. cu confirmare n 1824 h
Kit HEC
evideniere serotipurile enteropatogene 0157: H7 E.
coli, care produc glucuronaze;
se bazeaz pe utilizarea membranei active ELISA, care
se pune n contact 2 min cu Petrifilmul; dup 18 h de
incubare testul pozitiv se evideniaz prin apariia petelor
gri pe membran;
analiz simpl, rapid i precis far echipament
special
Petrifilm 3M - teste de control al control mediu prin contact direct sau tergere;
mediului
metod simpl i eficient

Particulariti ale Petrifilmelor 3M

Tipuri de microorganisme
Caracteristici Bacterii aerobe mezofile Coliformi Escherichia Drojdii i mucegaiuri
totali
coli
Indicator
TTC
TTC
TTC
BCIP
Mediu
OGA+cIoram.clor
PCA
VRBL VRBL+BCIG
telr.
c
Temperatura
30C
30/44 C
30/44C
20/30C
Incubare
48/72 h
24 h
24 h
72/120 h
TTC clorur de trifenil tetrazoliu (culoarea vireaz spre rou datorit reducerii
de ctre microorganisme cu formare de formazan);
BCIP - brom cloro indoxil fosfat (indicator pentru fosfataz, produs in general
de drojdii i mucegaiuri; virajul culorii, precipitat bleu);

10

BCIG brom cloro indoxil glucuronid este indicator al glucuronidazei, pe

care o posed Escherichia coli; are loc virajul culorii precipitat bleu.

Tipuri de Petrifilme
1. Petrifilm pentru numrat bacterii aerobe i facultativ anaerobe

2. Petrifilm pentru numrat drojdii i mucegaiuri

Conine un mediu selectiv cu 2
antibiotice cu spectru larg, pentru suprimarea
creterii bacteriilor i BCIP (brom cloro
indoxil fosfat), ca indicator.

3. Petrifilm pentru numrat bacterii coliforme

Conine un mediu selectiv cu bil, lactoz i 2 indicatori: VR (rou violet) i TTC

11

4. Petrifilm pentru numrat E. coli, coliformi i necoliformi

Conine un mediu selectiv cu bil, lactoz i BCIG (brom cloro indoxil
glucuronid) ca indicator.

A.3. Evaluarea numrului de microorganisme dup filtrare prin

membran
Aceast metod se preteaz la analiza probelor lichide cu un coninut redus de
microoganisme, care nu conin compui ce produc colmatarea filtrului.
Pentru analiz, o cantitate controlat de lichid de analizat (1 - 10 cm3) se
transfer aseptic n rezervorul aparatului de filtrare, apoi lichidul se trece prin filtru (cu
pori mici, capabili s rein toate microorganismele), dup care membrana se ridic
aseptic cu o penset steril i se transfer ntr-o plac Petri steril n care n prealabil s-a
repartizat mediul de cultur adecvat, cu agar. In alte cazuri, mediul de cultur specific
este impregnat n membran i astfel, dup filtrare, membrana se plaseaz ntr-o plac
Petri steril.
Prin termostatare n condiii optime la suprafaa membranei se formeaz colonii
caracteristice, care se pot numra i analiza din punct de vedere morfologic.
Firme specializate produc i comercializeaz medii specifice i membrane
destinate analizei prin filtrare: Hach, Sartorius, Millipore.

A.4. Evaluarea numrului de microorganisme prin utilizarea

mediilor de imersie
Tehnici moderne prevd cultivarea microorganismelor pe lame de mediu cu
geloz sau benzi de hrtie impregnate cu medii adecvate.
12

Lamele cu medii de cultur gelozate se menin n tuburi speciale, sterile. In

momentul utilizrii se extrage aseptic lama din tub, se imerseaz n proba de analizat,
dup care se reintroduce n tubul steril i se termostateaz la temperatura optim de
cretere, specific microorganismelor analizate. Dup termostatare, 16-24 h pentru
bacterii i 3-4 zile pentru drojdii i mucegaiuri, se pot numra coloniile caracteristice care
s-au dezvoltat la suprafaa lamei.

Lame specializate pentru control microbiologic selectiv

Lame Hychech (Difco) (medii gelozate: PCA + PCA 0,01 TTC*) - destinate pentru
determinarea numrului total de microorganisme;
Lame pentru evidenierea bacteriilor din familia Enterobacteriaceae (geloz
tripticaz soia + VRBC geloz);
Lame pentru evidenierea selectiv a bacteriilor din genul Pseudomonas (mediu
specific cu geloz);
Lame pentru determinarea fungilor filamentoi (geloz tripticaz soia; tripticaz
soia cu TTC + geloz cu roz bengal i cloramfenicol .a.);
Lame Biokar - pentru numr total de coliformi; numr total de drojdii i mucegaiuri;
Lame Lactocult - pentru controlul microbiologic al laptelui;
Lame Microtest.

Benzile de hrtie impregnate cu medii selective (Dacto Strip)

Sunt alte sisteme comerciale pentru controlul microbiologic rapid i eficient al
alimentelor;
Se preteaz cel mai bine la controlul produselor lichide (industria laptelui);
Constau din benzi sterile de hrtie impregnate cu mediu specific, pentru care se
precizeaz: timpul necesar de meninere n contact cu proba de analizat; volumul de
lichid pe care l adsorb (0,1-1 cm3);
Pentru analiz, banda steril se imerseaz n lichidul de analizat, apoi se reintroduce
in ambalajul steril i se termostateaz in condiii optime.

13

B. Evaluarea numrului de microorganisme prin cultivare n

medii lichide
Prin inocularea celulelor n medii lichide i termostatare n condiii optime de
multiplicare se determina statistic numrul de microorganisme n funcie de observaiile
privind prezena sau absena creterii (determinare de uft - uniti formatoare de
turbiditate).
Creterea poate fi apreciat vizual, prin analiz turbidimetric, prin virajul culorii
mediului, formarea de gaz .a.

Avantajele utilizrii mediilor lichide

Este posibil analiza unor cantiti mari de produse, fapt extrem de important pentru
cercetarea, n special, a microorganismelor patogene;
Este posibil studiul unor proprieti fiziologice (producere de acid, formare de gaze
.a);
Permite cultivarea n condiii selective, specifice pentru un grup de microorganisme
ce trebuie determinat.

Metoda de cultivare n medii lichide se bazeaz pe dou tehnici de

analiz:
Metoda diluiilor limit - prin inoculare din proba de analizat i diluii decimale
succesive n cte o eprubet cu mediu de cultur adecvat i, dup termostatare
corespunztoare, prin analiza probelor se stabilete numrul de microorganisme, n
funcie de ultima diluie n care a fost observat creterea. Aceasta este o metod
semicantitativ i permite evaluarea orientativ a gradului de contaminare al produsului
de analizat;
Metoda

titrului

(metoda

tuburilor

multiple)

presupune

inocularea

microorganismelor prezente n proba de analiz i diluii decimale succesive, n mai

multe eprubete n paralel (2-5) cu mediu de cultur adecvat (9 sau 10 cm), Dup
termostatare n condiii optime se fac aprecieri asupra creterii i se stabilete numrul de
microorganisme prin analiza statistic a rezultatelor, folosind tabelul Mac Grady.

14

Metoda diluiilor limit

Metoda titrului (metoda tuburilor multiple)

a) Determinarea bacteriilor coliforme
Metoda include teste prezumtive i de confirmare, bazate, n primul rnd, pe
capacitatea bacteriilor de a fermenta lactoza cu producere de acid lactic, CO2, H2, n timp
de 48 ore la 35C.
Testul prezumtiv const n inocularea probei n mediu nutritiv BCLP (bulion de
carne cu lactoz i plutitor), mediu de mbogire favorabil nmulirii att a bacteriilor
coliforme ct i a altor bacterii care folosesc lactoza ca sursa de carbon.
Testul de confirmare, const n inocularea culturilor din eprubetele pozitive ale
testului prezumtiv pe medii selective BBLVP (bulion, bil cu lactoz, verde briliant i
plutitor) care inhib dezvoltarea bacteriilor nsoitoare i asigur nmulirea bacteriilor
coliforme.
Din grupul coliform, cel mai frecvent ntlnit este genul Escherichia cu specia
Escherichia coli, care indic o contaminare fecal recent.
15

a) Determinarea bacteriilor coliforme. Tehnica de lucru

Din prob i diluii succesive de inoculeaz cte 1ml n cte 3 eprubete cu BCLP.
Se termostateaz la 37C timp de 24-48 ore. Se nregistreaz eprubetele pozitive (mediu
tulbure, bule de gaz n plutitor, pH acid), iar eprubetele negative sunt din nou
termostatate timp de 24 ore i se nregistreaz din nou eprubetele pozitive.
Pentru confirmare, din eprubetele pozitive se recolteaz cte o ans i se
inoculeaz eprubete cu BBLVP; dup incubare la 37C timp de 48 ore, n condiiile n
care se produc din nou gaze n plutitor, tulburare, virajul culorii indicatorului verde
briliant de la verde la galben, nseamn c n apa (produsul analizat) sunt prezente
bacteriile coliforme.
Calcul i interpetare
Folosind metoda titrului, n funcie de numrul eprubetelor pozitive se stabilete
numrul caracteristic (NC), i din tabelul lui Mac Grady, corespunzator numrului
caracteristic se noteaz numrul probabil de microorganisme (NPM). Pentru a calcula
numrul probabil de coliformi/cm3 produs analizat, valoarea din tabel se nmulete cu
factorul de diluie corespunzator primei cifre din numrul caracteristic. Numrul de
coliformi admii n 100 ml ap, conform SR EN ISO 9308 -1/2004, este de 0.

Determinarea bacteriilor coliforme (Schem)

16

Tabelul Mac Grady

NC

NPM

NC

NPM

000

0,0

102

1,1

001

0,3

110

0,7

010

0,3

111

1,1

011

0,6

222

3,5

020

0,6

223

4,0

100

0,4

321

15,0

101

0,7

333

140

17

III. TEHNICI DE EVALUARE A CRETERII PRIN

DETERMINAREA GLOBAL A BIOMASEI
Pot fi aplicate att pentru evaluarea populaiilor aparinnd microorganismelor
unicelulare, dar mai ales n cazul microorganismelor filamentoase.
Biomasa microbian este recuperat, n general prin centrifugare (2000-4000 rot.,
10 min., la 4C), este splat de mai multe ori cu soluie 0,9% NaCl, pentru ndeprtarea
impuritilor din mediul de fermentaie, reinute o dat cu celulele, apoi uscat la
temperatura de 105C, pn la greutate constant.
Dezavantaje
Este puin sensibil;
Nu se aplic dect n cazul mediilor lichide fermentate n care microorganismele
sunt singurele particule n suspensie;
Nu se poate face distincie ntre biomasa vie i cea autolizat;
Coninutul de biomas nu reflect ntotdeauna gradul de multiplicare al celulelor.
De exemplu, n cazul mucegaiurilor, celulele cresc acumulnd intracelular substane de
rezerv i formeaz perei celulari groi fr s se produc diviziunea celular.

IV. ESTIMAREA CANTITII DE BIOMASA PRIN DOZAREA

UNOR CONSTITUENI CELULARI
Determinarea cantitativ a unor componeni aflai n concentraie aproximativ
constant n celulele microbiene ofer indicaii asupra evoluiei unei culturi.
Principiul acestor metode const n msurarea concentraiei unor componeni
celulari i, considernd aceasta aproximativ constant per celul, este posibil stabilirea
prin echivalen a concentraiei de biomasa.
Astfel de componeni sunt: proteine, acizi nucleici (ARN, ADN), ATP, NADH.
Celulele separate de mediul de fermentaie prin filtrare sau centrifugare sunt
splate pentru ndeprtarea impuritilor, apoi sunt supuse unor tratamente mecanice sau
fizice pentru eliberarea componenilor celulari i evaluarea acestora prin tehnici
standardizate de analiz.

18

Determinarea concentraiei proteinelor celulare

Creterea i multiplicarea celulelor este n dependen direct cu biosinteza de
proteine. Pentru evaluarea coninutului total de proteine sunt recomandate metodele
clasice: metoda biuretului, metoda Lowry, metoda Bradford, metoda Kjeldahl, sau
hidroliza proteinelor i dozarea aminoacizilor.
Metoda biuretului este cea mai recomandat n astfel de studii. Principiul
metodei const n formarea unui complex colorat ntre ionii de cupru i gruprile proteice
ncrcate cu sarcini negative.
Metoda Lowry se utilizeaz atunci cnd concentraia de celule n suspensia de
analizat este mic. Cantitatea de proteine se determin prin comparaie cu o curb etalon
cu albumina seric bovin.
Coninutul n proteine se poate exprima i prin dozarea azotului, utiliznd
metoda Kjeldahl (proteine = Nx 6,25).

Determinarea acizilor nucleici

Biomasa microbian are un coninut remarcabil, constant, de ADN.
Acest constituent este n general absent n ingredientele mediului de cultur, ceea
ce exclude eventualele interferene, dar, din pcate, determinarea sa este destul de
sofisticat, necesitnd tehnici de liz a celulelor, extracie, separare.
Pentru dozare se apeleaz la metode spectrofotometrice (= 260 nm) sau
colorimetrice ( = 600 nm) prin reacia cu difenilamin n prezen de acid percloric.
Studiul acizilor nucleici este utilizat mai mult pentru identificare.

Determinarea coninutului de ATP

Evaluarea biomasei microbiene prin determinarea coninutului de ATP tinde s
se generalizeze.
ATP-ul este un constituent normal al celulelor vii, fiind un intermediar important
al metabolismului celular cu rol n metabolismului energetic.
Principiul metodei de determinare a ATP-ului se bazeaz pe emisia luminoas
produs prin oxidarea luciferinei la oxiluciferin, reacie catalizat de ctre enzima
luciferaz n prezen de ATP.
19

Aceast emisie, care poate fi msurat spectrofotometric, este obinut n cteva

secunde, conform ecuaiei:
ATP + luciferina + O2

oxiluciferin + AMP+ PPi + CO2 + lumina

Msurarea bioluminescenei se realizeaz la = 562 nm cu ajutorul unor aparate

speciale (fluorimetre).
Variaia coninutului de ATP al microorganismelor este n funcie de specie i de
starea fiziologic, cu factori de variaie de la 1 la 10. Se consider coninutul mediu de
ATP n celule microbiene ca fiind aproximativ 5x 10-16 g ATP/celul (= 1 mg ATPg-1
substan uscat biomas).
Dezavantaje
Metoda este laborioas mai ales dac se au n vedere dificultile de extracie a
ATP-ului din celulele microbiene;
Tehnica de analiz a ATP-ului nu ofer rezultate corespunztoare n cazul unor
populaii heterogene ce conin celule de vrste variabile;
Se aplic cu succes pentru studiul culturilor pure n sisteme continue de fermentaie;
Pentru rezultate mai concludente se recomand corelarea coninutului n ATP cu
numrul de celule.

Msurarea spectrofotometric a fluorescentei

Aceasta poate fi emis de anumii componeni celulari, care au abilitatea de a
reemite lumina absorbit prin modificarea lungimii de und.

20

Compuii care emit fluorescent (fluorofluori) cu importan pentru

evaluarea populaiilor microbiene

Relaia dintre fluorescent i concentraia compusului care emite

fluorescent
Dac fiecare celul conine o concentraie intracelular aproximativ constant a
unuia din fluorofluorii prezentai n tabelul 7.5. concentraia de celule se poate determina
n funcie de fluorescenta emis, msurat spectrofotometric, conform curbei

Principiul msurrii fluorescentei unei culturi

Dintre compuii fluorofluori, cel mai adesea se recurge la NADH, care emite
fluorescent la 460 nm, cnd este excitat n lumin la lungimea de und = 340 nm. n
forma oxidat (NAD+) coenzima nu are fluorescen. n cursul creterii celulare,
cantitatea de NADH crete n raport direct proporional cu multiplicarea celulelor,
permind astfel evaluarea concentraiei de biomas.

21

Factori care influeneaz fluorescena

pH, temperatura, prezena unui agent antispumant, modificri ale activitii
metabolice a celulelor determinate, spre exemplu, prin limitarea oxigenului. Pentru
msurare se lucreaz ntotdeauna cu celule vii, cu o stare fiziologic constant.
Aceast metod de analiz permite evaluarea celulelor vii, este relativ specific,
sensibil i exact, dar aplicarea sa este recomandat pentru evaluarea populaiilor ce
conin celule cu vrste i stri fiziologice constante (culturi continue, sincrone). n
practica industrial fluorescenta se msoar "on line" direct n bioreactor.

Determinarea coninutului de chitin i ergosterol

Metoda este recomandat pentru estimarea biomasei fungilor filamentoi.
Chitina, polimer de N-acetil-D-glucozamin, este un constituent major al
pereilor hifali i nveliurilor sporale. Ea este prezent n exoscheletul insectelor, dar
lipsete din compoziia bacteriilor i alimentelor. Astfel, prin determinarea cantitativ a
coninutului de chitin din mucegaiuri se poate estima indirect cantitatea de biomas.

22

V. TEHNICI TURBIDIMETRICE I NEFELOMETRICE DE

EVALUARE A CRETERII MICROORGANISMELOR
V.1. Metoda comparativ
Const n compararea turbiditii unei suspensii de celule cu turbiditatea unor
etaloane cu albumin. De exemplu, turbiditatea unei suspensii de bacterii de 5-109
bacterii/cm3 corespunde unei suspensii cu o concentraie de 0,5 g/dm3 albumin.
Aceast metod este mai puin precis i se utilizeaz de obicei n studii
comparative.

V.2. Metoda turbidimetric

Tehnica permite stabilirea concentraiei de celule n funcie de absorbana
suspensiei de celule, care se determin cu ajutorul unui spectrofotometru sau
nefelometru.

Principiul metodei
Similar cu legea Beer-Lambert exist o proporionalitate ntre absorbanta culturii
(densitatea optic) i concentraia de celule n suspensie, conform relaiei:
A=IC,

n care: A este absorbanta, msurat la = 600 nm; - coeficient de

extincie ''celular, C - concentraia celulelor n suspensie.

n funcie de substana uscat a masei celulare i de absorbana culturii,
comparativ cu mediul de cultur steril considerat ca referin, poate fi trasat o curb
etalon A = f (biomas substan uscat)
Aceast corelaie este valabil pn la o valoare limit a absorbantei, variabil n
funcie de: aparatul de msur, lungimea de und, natura suspensiei .a.

23

Corelaia absorban-biomas substan uscat

Aplicabilitate
Aceast metod rapid este valabil n cazul microorganismelor unicelulare
dezvoltate n medii definite i limpezi. Prezena de particule n suspensie, altele dect
celulele microbiene, perturb evident msurtorile.
Tehnica nu se preteaz ntotdeauna pentru evaluarea creterii microorganismelor
filamentoase.
Se poate aplica pentru msurri n sistem continuu ("on line"), pe tot parcursul
desfurrii procesului fermentativ, graie punerii la punct a unor biofotometre
sterilizabile cu funcionare continu.
Exist aparate care msoar turbiditatea n microplac, cum este de exemplu
analizorul Bioscreen-Labsistem.

Metoda nefelometric
Permite msurarea luminii difuze i ofer informaii asupra dimensiunilor celulelor
i concentraiei lor n suspensii lichide.
n practica de laborator se prepar etaloane nefelometrice din sulfat de bariu; ntr-o
serie de 10 eprubete egale se repartizeaz o soluie de clorur de bariu 1%, n cantiti
progresiv crescnde de la 0,1 cm3 Ia 1 cm3 .
n fiecare eprubet se completeaz apoi volumul pn la 10 cm3, cu o soluie de acid
sulfuric 1%.
24

 Opacitatea format de sulfatul de bariu rezultat din reacie corespunde n prima

eprubet unei concentraii bacteriene de 3108 celule/cm3; etalonul urmtor corespunde la
o concentraie de 6108 celule/cm3; al treilea etalon, la 9108 celule/cm3.
n momentul utilizrii, eprubetelor care conin etaloanele li se omogenizeaz
coninutul.

VI. ESTIMAREA CANTITII DE BIOMAS PRIN

EVALUAREA ACTIVITII METABOLICE A CELULELOR
Prin activitatea metabolic a celulelor, compoziia mediului de cultur se
modific considerabil pe tot parcursul desfurrii procesului fermentativ.
n paralel cu acumularea de biomas se produce un consum al nutrienilor,
oxigenului i amoniacului, formarea produilor de metabolism i de asemenea se degaj
cldura rezultat prin reacii catabolice exergonice.
Tehnicile de analiz nu sunt aplicabile dect n condiii bine definite: faza
exponenial de cretere, temperatur, mediu de cultivare adecvate. Modificrile strii
fiziologice ale celulelor conduc la activiti variabile care nu sunt ntotdeauna corelate cu
cantitatea de biomas.
Aceste metode asigur n primul rnd evaluarea strii metabolice a celulelor i, n
mai mic msur, determinarea concentraiei de biomas.

VI.1. Msurarea luminescenei naturale Ia bacterii

Unele bacterii aparinnd genurilor Alternomonas, Photobacterium, Vibrio .a.,
prezint o luminescen natural.
n general, aceast luminescen este emis ca urmare a reaciei:
FMNH2 + RCHO + O2
Msurarea

luminii

FMN + H2O + RCOOH + lumin ( = 490 nm)

emise

se

realizeaz

prin

numrarea

fotonilor

fotomultiplicare. Aceasta permite ntr-o oarecare msur aprecierea numrului de

microorganisme.

25

VI.2. Studiul proprietilor fizico-chimice ale mediului de

fermentaie
Potenial redox
pH
Vscozitate
Cantitate de cldur degajat

Formarea de CO2

Impedana

Potenialul de oxido-reducere - rH
Numeroase microorganisme modific potenialul oxido-reductor al mediilor de
cultur utiliznd oxigenul i elibernd substane reduc-toare ca urmare a activitii lor
reductazice.
Intensitatea i viteza de modificare a potenialului redox depind de numrul i
natura microorganismelor, de activitatea metabolic, de natura mediului de cultur i de
condiiile de mediu (aerare, agitare, temperatur) etc.
Tehnici de evaluare a activitii reductazice se aplic n prezent pentru aprecierea
numrului de microorganisme vii din lapte, carne, sucuri
Principiul metodelor bazate pe studiul potenialului oxido-reductor
Acestea se bazeaz pe msurarea timpului necesar pentru virajul culorii unui
indicator redox, timp care este n direct concordan cu numrul de microorganisme vii
din proba de analizat. De exemplu, un numr de 106 bacterii produc reductaze care
determin decolorarea unei soluii de albastru de metilen dup o or, ca urmare a trecerii
albastrului de metilen din forma oxidat, colorat n albastru, la un leucoderivat incolor.
Aceast metod nu este specific i, n general, este utilizat pentru aprecierea
numrului total de bacterii vii.
Cei mai utilizai indicatori redox sunt: resazurina, albastru de metilen, clorura de
trifeniltetrazoliu (TTC).

26

Resazurina este un indicator redox care i schimb culoarea de la albastru violet

spre roz i incolor, n funcie de potenialul de oxido-reducere. Cu albastru de metilen
reducerea se traduce prin virarea culorii indicatorului de la albastru la incolor, iar n cazul
clorurii de trifeniltetrazoliu culoarea variaz de la incolor la rou-violet.
Indicatori redox utilizai pentru aprecierea numrului total de bacterii

Determinarea pH - ului
Ca urmare a activitilor metabolice, microorganismele determin frecvent
modificarea pH-ului mediului de cultur prin formare sau consum de acizi organici,
producerea de compui alcalini sau ca efect al schimburilor ionice.
Atunci cnd aceste modificri pot fi corelate cu creterea, este posibil estimarea
concentraiei de biomas. Modificarea pH-ului mediilor de cultur este n general sesizat
senzorial prin virajul culorii unui indicator de pH. Nivelul de detecie al acestei metode
este foarte sczut.
Se prefer s se realizeze dozarea titrimetric cu determinarea: aciditii totale i
volatile (aciditate Dornic la lapte); alcalinitii totale (alcalinitate brut); azotului bazic
total, volatil (ABVT).

27

Evaluarea vscozitii mediului

Ca urmare a evoluiei proceselor metabolice celulare pe parcursul fermentaiei se
produc modificri ale proprietilor reologice ale mediului fermentativ.
Modificarea vscozitii mediului fermentativ poate constitui un criteriu de
evaluare a creterii. Aceasta se poate datora fie consumului unui nutrient (de exemplu
glicerol), fie acumulrii de produi de fermentaie (poliglucide: xantan, dextran .a.), sau
ca urmare a creterii concentraiei de celule.
Exist n prezent vscozimetre pentru un domeniu larg de msurare a
vscozitii, care pot face msurtori on line".
n cazul vscozitilor foarte mari, nu s-a realizat pn un prezent un instrument
de precizie pentru msurarea acestora.

Determinarea CO2
Sunt cunoscute n prezent mai multe tehnici de evaluare a coninutului de CO2
rezultat ca urmare a activitii metabolice a microorganismelor.
Una dintre metode se bazeaz pe msurarea conductivitii ntr-un mediu cu
geloz i KOH n care este captat CO2 rezultat prin fermentaie.
Prin nlocuirea progresiv a ionilor hidroxil cu ioni carbonat, mai slabi
conductori, se reduce conductivitatea mediului.
Aceast tehnic se utilizeaz n special pentru evaluarea numrului de drojdii,
Clostridium tyrobutyricum, coliformi totali, Escherichia coli etc.

Msurarea impedanei
Impedana electric Z, sau conductana mediului de cultur, se modific prin
dezvoltarea celulelor microbiene pe parcursul desfurrii procesului fermentativ, ca
urmare a transformrii moleculelor electric neutre n molecule ionizante, cu att mai
rapid cu ct microorganismele se dezvolt mai repede.
Modificarea impedanei variaz n funcie de: concentraia de celule i tipul
microorganismului, mediul de cultur, temperatur, modul de msurare, frecvena
semnalului aplicat, proprietile suprafeei i geometria electrodului i distana dintre
electrozi.

28

Se msoar modificarea impedanei mediului pe parcursul dezvoltrii culturii,

Za, comparativ cu un mediu martor de referin, Zref. Variaia impedanei se calculeaz
cu formula:

Aplicabilitate
Metoda este rapid i permite analiza unui numr mare de probe, dar nu permite
evaluarea numrului de celule vii, iar n cazul culturilor de drojdii i mucegaiuri nu se
produc modificri mari ale conductanei mediului, deoarece prin metabolismul lor se
produc puine molecule ionizabile.
Aceast metod este utilizat pentru analiza crnii, a laptelui, iar pragul de detecie
este de aproximativ 106 -107 celule/cm3.
Aparatele utilizate pentru astfel de determinri sunt cunoscute sub denumirea
comercial: Bactometru-Bactomatic (Meriuex); Bactobridge (TEM, CS); Bactrac (SyLab/Foss Electric): Malthus (Tacussel); Rabbit (Whitler-AES); ESP (Difco) .a

VI.3. Evaluarea consumului de substrat i formare de produi de

metabolism
Creterea i multiplicarea celulelor microbiene ntr-un mediu adecvat au ca
rezultat consumul de substrat i formarea produilor de metabolism.
Dac biomasa este produsul principal al fermentaiei, atunci, prin msurarea
consumului de substrat se poate determina concentraia de biomas. Astfel, substana
uscat solubil a mediului se regsete n substana uscat a biomasei.
n acest caz, se poate urmri cinetica creterii i multiplicrii celulelor prin
analiza densimetric sau refractometric a mediului fermentativ. La microorganismele
aerobe, folosirea surselor de C, N, O sau minerale, reprezint indicii ale creterii culturii.
Evaluarea consumului de substrat i formarea produilor de metabolism se poate
realiza prin:
Dozarea chimic
29

 Evaluarea activitii unor enzime

Dozarea n flux continuu
Msurarea direct a schimburilor de gaze
Tehnici radiometrice

Dozarea chimic
Determinarea cantitativ a produilor de fermentaie care au legtur direct cu
creterea: CO2, etanol, acid acetic, ergosterol (n cazul mucegaiurilor) .a., ofer
informaii asupra evoluiei culturii i pot fi corelai cu creterea.
Prin cromatografie de nalt performan a fost posibil cuantificarea foarte fin a
cineticii formrii substanelor volatile n timpul fermentaiei i corelarea acestora cu
creterea celulelor. De exemplu, aplicnd aceast metod a fost posibil stabilirea
corelaiei dintre cinetica producerii aldehidei acetice i cinetica creterii celulelor de
Streptococcus salivarius ssp. thermophilus.

Evaluarea activitii unor enzime

Testele se refer la dozarea de compui din mediul de fermentaie (substrat sau
produi de fermentaie), care pot fi determinai prin evaluarea activitii unor enzime. n
prezent, firme specializate (ex. compania Boehringer) comercializeaz numeroase kituri
de dozare, i anume:
teste pentru msurarea n UV a unui cofactor oxidat
(NAD

NADH + H+): aldehida acetic - aldehid dehidrogenaza; acid acetic -

citrat sintetaza, malat dehidrogenaza, lactic dehidrogenaza;

teste colorimetrice: acid ascorbic - ascorbat oxidaza; acid gluconic - gluconat
kinaza; acid glutamic - diaforaza, glutamat dehidrogenaza;
Prin cromatografie gaz-lichid se poate determina cantitativ metanolul eliberat din
pectin de ctre pectinesterazele fungice i prin aceasta se poate estima indirect cinetica
creterii culturii fungice.

Dozarea n flux continuu (Flow Injection Analysis - FIA)

Aceste tehnici automatizate permit dozarea a unor compui (alcooli, glucide,
uree, oxigen, fosfat .a.) prin metode chimice, biochimice, spectrofotometrice i anume:
30

Sistemul FIA Enviroflow (Tecator/Perstorp) permite determinarea, prin analiz

spectrofotometric, n flux continuu, a substraturilor sau produilor rezultai din
activitatea metabolic a microorganismelor din ap i diferite alimente;
Cromatografa n faz gazoas i cromatografa n faz lichid (HPLC) permit
dozarea unei game largi de compui. Prin cromatografie n faz gazoas se pot determina:
etanolul, ali alcooli, acizii volatili, acetoina, hidrocarburile, CO2. Cromatografa n faz
lichid permite evidenierea: glucidelor, etanolului, acizilor organici, aminoacizilor,
hidrocarburilor, fosfailor, antibioticelor;
Biosenzorii sunt instrumente de msur a concentraiei unei game variate de
compui sau de determinare a numrului de celule dintr-o populaie de micro-organisme.
Biosenzorii sunt utilizai pentru: controlul proceselor biotehnologice industriale, controlul
calitii produselor alimentare (detectarea concentraiei unor substane utile: glucide,
acizi organici, alcooli, aminoacizi, nitrai, ioni metalici; detectarea contaminrii cu
microorganisme - Salmonella, Listeria, Staphylococcus), monitorizarea parametrilor
mediului nconjurtor:
Alte metode utilizate pentru dozarea compuilor chimici sunt: rezonana
magnetic nuclear (RMN) - pentru dozarea etanolului, compuilor cu azot, ionilor
fosfat; analiza n infrarou (IR) - pentru alcooli, CO2; analiz paramagnetic determinarea oxigenului; spectrometrie de mas (SM) - pentru alcooli, amoniu, oxigen;
absorbia atomic - pentru metale.

Msurarea direct a schimburilor de gaze

Se poate realiza printr-o tehnic manometric cu ajutorul aparatului clasic
Warburg sau cu ajutorul unui oximetru Gilson.
Se consider c intensitatea acestor schimburi este direct proporional cu
mrimea unei populaii de celule, dar aceast corelaie este mult influenat de starea
fiziologic a celulelor .

Tehnici radiometrice
Tehnica de analiz const n cultivarea celulelor pe un substrat radioactiv, dup
care se msoar radioactivitatea mediului, prin analiza unui compus marcat (de exemplu,
31

se determin cantitatea de

14

CO2 rezultat din metabolizarea

14

C glucoza). Aceste tehnici

sunt complexe i, n prezent, puin utilizate.

TEHNICI DE STUDIU I IDENTIFICARE A

MICROORGANISMELOR
Identificarea unui microorganism se poate realiza numai dup ce a fost izolat n
cultur pur. Tehnicile utilizate sunt numeroase, variate i specifice in funcie de natura
microorganismelor
microorganismelor

studiate
se

(bacterii,

realizeaz

pe

baza

drojdii,

mucegaiuri).

caracterelor

Identificarea

morfologice

(culturale,

microscopice), fiziologice (biochimice), sexuale, imunologice, genetice, lizotipice i de

patogenitate.

I.1 Studiul microscopic al microorganismelor

Cu ajutorul preparatelor microscopice se pot studia forma i dimensiunile
celulelor unor elemente de structur, starea fiziologic i se pot evidenia tinctorial
anumite proprieti ale microorganismelor.
Examenul microscopic ncepe ntotdeauna prin realizarea unui preparat ntre
lam i lamel (umed), care se analizeaz cu obiective uscate, cu grosisment x 10 i x 40.
Acest examen permite diferenierea culturilor de drojdii i mucegaiuri de cele de bacterii.
n

cazul

microorganismelor

eucariote

(drojdii,

mucegaiuri)

examenul

microscopic n stare vie, n preparate umede, permite un studiu eficient al caracterelor

morfologice, studiul unor particulariti privind modul de reproducere i dimensionarea
n plan orizontal a celulelor.
n cazul bacteriilor, utilizarea preparatelor umede pentru studiul morfologic nu
este eficient din cauza dimensiunilor lor extrem de reduse. Cu excepia unor studii de
evideniere a mobilitii, bacteriile se studiaz numai in preparate uscate i colorate
(colorarea simpl, colorare diferenial, colorare de structuri celulare: capsule, cili.
incluziuni .a).
Dimensionarea n plan orizontal a celulelor microbiene
Msurtorile n plan orizontal permit stabilirea, pe cale microscopic, n mod
indirect, a dou din dimensiunile celulei (lungime - lime), prin intermediul unei scri
32

arbitrare - micrometru ocular, etalonat pentru grosismentul de lucru al microscopului

prin intermediul micro-metrului obiectiv (scara etalon).
Pentru msurare se folosesc de preferin preparate umede n care suspendarea
celulelor se face n soluie de 0,1% geloz, pentru a evita deplasarea celulelor.
Micrometrul ocular i Micrometrul obiectiv
Micrometrul ocular este un disc de sticl n centrul cruia se afl o scar gradat
cu lungimea de 10 mm, divizat n 100 de diviziuni. Se monteaz n interiorul ocularului
prin deurubarea lentilei superioare i se sprijin pe diafragma ocularului. n cazul n care
liniile scrii nu se vd distinct, se potrivete distana optim prin deplasarea diafragmei
din tub i se nurubeaz din nou lentila frontal a ocularului.
Micrometrul obiectiv este o lam de sticl dreptunghiular n centrul creia se
afl un cerc cu contur uniform n care este gravat scara de 1 mm mprit n 100 de
diviziuni egale. O diviziune a micrometrului obiectiv este egal cu 10 m.
Mod de dimensionare
Se plaseaz lama micrometrului obiectiv pe msua microscopului i se caut
imaginea scrii etalon cu obiectivul cu grosisment x10 i apoi cu cel x45; prin
manevrarea platinei se face suprapunerea celor dou scri. Se noteaz cte diviziuni ale
micrometrului obiectiv se suprapun exact peste un numr de diviziuni ale micrometrului
ocular. Cunoscnd c o diviziune real a scrii etalon este egal cu 10 m, se calculeaz
coeficientul micrometric, care stabilete corespondena dintre cele dou scri:

unde: C este coeficientul micrometric; N numrul de diviziuni

pe micrometrul obiectiv; n numrul de diviziuni ale micrometrului ocular care se cuprind
n N
Dup stabilirea coeficientului micrometric, n locul scrii etalon, pe msua
microscopului se aeaz preparatul care conine celulele de dimensionat. Cu ajutorul
scrii, prin rotirea ocularului sau prin deplasarea platinei, se determin numrul de
diviziuni ale celulelor (pentru lungime/lime). Pentru obinerea dimensiunilor reale ale
celulelor dimensionate, numrul de diviziuni citite cu ajutorul micrometrului ocular se
multiplic cu coeficientul micrometric stabilit anterior.
33

I.2 Studiul caracterelor culturale

Caractere culturale ale microorganismelor n diverse tipuri de culturi
a - forma coloniilor: punctiform (1); circular
(2); ondulat (3); lobat (4); erodat (5); filamentoas
(6); rizoidal (7); plisat cu striaiuni radiale (8); plisat
cu striaiuni concentrice (9); form de fus n masa de
geloz (10);
b -profilul coloniilor: plat (1): bombat (2);
convex (3); n form de dom (4); umbonat (5):
c -culturi pe geloz nclinat (inoculare
linear): biomasa invadeaz ntreaga suprafa (1);
cretere filiform (2); cretere ondulat (3); cretere
difuz (4); cretere rizoidal sau arborescent (5);
d - culturi prin nepare n medii cu gelatin;
filiform (1); perlat (2); ondulat (3); arborescent (4):
lichefiere cratiform (5); lichefiere stratiform (6);
lichefiere sub form de sac (7): lichefiere total (8);
e culturi pe mediu lichid: sediment (1): tulburare (2); pelicul sub form de inel
(3), voal (4).

II. STUDIUL PROPRIETILOR BIOCHIMICE I

FIZIOLOGICE ALE MICROORGANISMELOR
II.1. Stabilirea tipului de metabolism energetic
Viaa celulei microbiene n condiii compatibile oferite de mediul ambiant este
determinat de caracterele genetice care i imprim un anumit metabolism, determinat de
totalitatea reaciilor biochimice catalizate secvenial de enzimele celulei vii, prin care se
asigur transferul de mas i energie ntre celul i mediul ambiant.
Importana general a metabolismului energetic n viaa microorganismelor, a
surselor de energie, a donatorilor de electroni sau de hidrogen i a acceptorului final de

34

electroni, a determinat utilizarea acestora drept criterii de clasificare i nomenclatur a

principalelor tipuri de metabolism.
n funcie de natura acceptorului final de electroni, microorganismele pot
prezenta trei tipuri de metabolism energetic.

Respiraia aerob
Este procesul n cursul cruia reaciile chimice productoare de energie necesit
prezena oxigenului molecular ca acceptor final de electroni.
Procesul este dependent de oxigenul din aer, avnd ca produse finale CO2 i H2O.
Respiraia aerob este foarte avantajoas din punct de vedere energetic pentru
celula microbian, de aceea, atunci cnd urmrim obinerea de celule n cantiti mari
(drojdie comprimat) sau obinerea de substane intracelulare, cultivarea se face n
condiii de aerare.
Respiraia aerob este dependent de cantitatea de oxigen din aer, iar carbonul
din compusul organic se regsete n dioxidul de carbon.
Microorganismele aerobe dispun de o caten respiratorie diversificat, n
componena creia intr dehidrogenaze: citocromi, citocrom-oxidaze, oxidaze.
Numeroase bacterii pot oxida hidrogenul (Pseudomonas), amoniacul pn la NO2
(Nitrosomonas), sulful i H2S pn la sulfat (Thiobacillus) sau fierul Fe2+ la Fe3+
(Thiobacillus ferooxidans) cu rol important n circuitul natural al elementelor.

Respiraia anaerob
Este procesul prin care substratul este transformat pn la CO2, iar e- sunt cedai
prin procesul de oxidare unor compui anorganici acceptori.
Este ntlnit la bacteriile strict anaerobe, cnd acceptorul de electroni sau
hidrogen este un compus anorganic. Aceste bacterii obin o cantitate mic de energie i
pot crete n absena oxigenului molecular, Ia un potenial de oxidoreducere de -0,2; -0,3
V.
innd cont c mediile ce vin n contact cu O2 au un potenial redox de +0,2;
+0,4 atunci cnd pH = 7, pentru a asigura dezvoltarea anaerobilor, n mediu se adaug
substane cu caracter reductor ca tioglicolat de Na, cistein, sulfura de Na. Substanele
35

reductoare permit meninerea unui potenial de oxido-reducere sczut. Pentru cultivarea

anaerobilor se pot folosi i vase speciale numite anaerostate n care O2 este legat chimic,
sau cultura se menine n atmosfer de gaze inerte (CO2, N2).

Fermentaia
Este un proces n care reaciile chimice productoare de energie necesit prezena
unor compui organici ca acceptori finali de electroni.
Metabolismul oxidativ anaerob poate fi ntlnit i la microorganisme facultativ
anaerobe. Aceste microorganisme au capacitatea de a crete aerob utiliznd oxigenul din
aer (respiraie aerob) sau anaerob, folosind compui organici ca acceptori finali ai
electronilor.
Microorganismele facultativ anaerobe, n condiii aerobe, i adapteaz
echipamentul enzimatic pentru procese de oxidare pn la produii finali, utiliznd
preferenial oxigenul cnd este disponibil, datorit cantitii mai mari.

Tipuri de comportamente difereniate ale microorganismelor

Aerobe - sunt dependente de oxigenul din aer, se dezvolt la suprafaa lichidelor,
a mediilor solide. Oxigenul servete ca acceptor final de electroni transportai prin catena
respiratorie;
Facultativ anaerobe - nu necesit oxigen pentru cretere, dar cresc mai bine n
prezena sa. Se dezvolt bine n medii lichide n care solubilitatea oxigenului din aer este
mai redus;
Aerotolerante anaerobe - nu necesit O2 pentru cretere i cresc la fel de bine n
prezena sau absena sa (ex. Enterococcus fecalis, Lactobacillus plantarum).
Microorganismele incluse n aceste tipuri pot produce superoxid dismutaz i
catalaz care catalizeaz reaciile:

Microaerofile - se dezvolt la distan mic de suprafaa mediului de cultur

cnd concentraia n oxigen este de 2-10%;
Strict (obligat) anaerobe - nu tolereaz oxigenul i mor n prezena acestuia,
deoarece nu pot descompune apa oxigenat cu efect distructiv asupra celulei. Nu pot
36

obine energie prin respiraie propriu-zis i folosesc fermentaia i respiraia anaerob n

acest scop (ex. bacterii butirice, metanogene).

II.1.1 Tehnici de studiu al tipului de metabolism energetic

n eprubete (8 x 180 mm) se repartizeaz
cte 10-15 cm3 mediu de cultur, BCA + glucoz i
se sterilizeaz. n momentul utilizrii, mediul se
fluidific prin nclzire pe baie de ap i apoi se
tempereaz la 42...45C. Urmeaz inocularea n strii
n profunzimea masei de gel, cu ajutorul unei pipete
Pasteur. Pipeta se introduce pn la partea inferioar
a eprubetei, apoi se ridic ncet pentru inocularea
uniform (cu 3-4 picturi suspensie celule) a
mediului de cultur. Dup rcire i solidificare
mediul se termostateaz corespunztor. n funcie de particularitile de cretere n raport
cu necesarul de oxigen, microorganismele sunt ncadrate n 4 categorii principale: strict
aerobe (a), strict anaerobe (b), aerotolerante anaerobe (c), microaerofile (d).

II.1.2 Evidenierea metabolismului oxidativ i fermentativ

Determinarea produselor rezultate prin metabolismul celulei microbiene (acizi,
alcooli, enzime .a.) prezint interes practic n scopul stabilirii condiiilor optime de
mediu pentru creterea randamentului n produsul cu importan economic, la selectarea
unor microorganisme nalt productive.
n funcie de particularitile metabolice i de condiiile de cultivare,
microorganismele au capacitatea de a metaboliza n mod diferit substratul cu formare de
acizi, CO2 i ap (metabolism oxidativ), sau acizi, alcooli i gaze (CO2, H2) (metabolism
fermentativ anaerob).
Evidenierea tipului de metabolism se va face prin punerea n eviden a
produilor finali de metabolism, n special formarea de gaze, care n cazul
metabolismului fermentativ se concretizeaz n: acumulare de gaz n tub Durham (mediu
lichid), formarea de alveole de gaz (n mediu cu geloz). n cazul respiraiei aerobe, prin
dezvoltarea microorganismelor la suprafaa mediului de cultur, CO2 format este eliberat
n mediul nconjurtor.
37

Pentru evidenierea tipului de metabolism se utilizeaz dou metode principale.

A. Metoda bazat pe studiul pH-ului

Se aplic n general pentru studiul bacteriilor, care prin fermentaie produc acizi
i uneori gaze.
Pentru cultivare, se utilizeaz un mediu semisolid care conine un indicator de
pH.
nainte de utilizare, mediul se fluidific pe baie de ap, apoi se adaug soluie de
glucoza astfel nct concentraia final n mediu s fie de 0,1% i se solidific din nou.
Pentru analiz se utilizeaz cte dou eprubete de mediu care se inoculeaz prin
nepare cu firul exact n zona central a tubului de gel.
n una din eprubete se acoper suprafaa mediului cu 1 cm3 ulei de parafin steril.
Dup termostatare corespunztoare, se examineaz eprubetele i se noteaz
virarea culorii indicatorului i eventual formarea de gaz
Posibile rezultate
Acidifiere la suprafaa mediului din eprubeta fr parafin;
Absen modificri n eprubeta cu parafin - metabolism oxidativ;
Absen acidifiere sau formare de gaz; uneori crete alcalinitatea n eprubeta cu
parafin- metabolism inactiv sau "inert";
Acidifiere n ambele eprubete cu sau fr formare de gaz; modificarea poziiei
dopului de parafin - metabolism fermentativ.
Dup inoculare i termostatare rezultatele se interpreteaz astfel:
absen formare gaz; absen acidifiere sau alcalinizare mediu; uneori acidifiere
mediu fr formare de gaz - metabolism oxidativ sau "inert";
acidifiere cu formare de gaz; formare gaz fr acidifiere; uneori acidifiere fr
formare de gaz - metabolism fermentativ (bacterii).

B. Metoda bazat pe evidenierea producerii de gaz

Se utilizeaz frecvent n cazul drojdiilor, dar i pentru anumite bacterii.
Pentru analiz se utilizeaz un mediu lichid, ce conine o surs de carbon
asimilabil i un indicator de pH.
38

Mediul se repartizeaz n eprubete cu tub Durham i se sterilizeaz.

Cele mai utilizate medii sunt: pentru drojdii - mediul Wieckerman; pentru
bacterii - bulion de carne cu lactoz (BCL), bulion de carne - lactoz - bil - verde
briliant (BLBV).
Studiul potenialului oxidativ sau fermentativ al microorganismelor
a - cultivare pe mediul Hugh l Leifson:
metabolism oxidativ (1); metabolism inactiv sau
inert n raport cu substratul (2); metabolism
fermentativ (3, 4, 5);

b - cultivare pe mediul

Wickerham: metabolism oxidativ sau inert (1, 2);

metabolism fermentativ (3, 4).

II.1.3 Evidenierea capacitii unor microorganisme de a cataliza

procese de respiraie anaerob
Punerea in eviden a acestei capaciti se poate realiza prin procedeele
urmtoare:
Reducerea nitrailor i nitriilor
Reducerea compuilor cu sulf

Reducerea nitrailor i nitriilor

Reducerea nitrailor de ctre
microorganisme se poate realiza prin
mecanisme moleculare, cu semnificaie
diferit

pentru

microorganismele

efectoare:
A) denitrificarea sau reducerea
dezasimilatorie adevrat;
B) reducerea asimilatorie.
Produii finali ai reducerii pot
fi:

N2

cazul

procesului

de

denitrificare (tip A) sau NH3 n cazul

39

procesului de reducere asimilatorie (tip B).

Reducerea compuilor cu sulf

Reducerea sulfailor (SO42-) se studiaz foarte puin.
Reducera sulfiilor (SO32-) se evideniaz prin cultivare pe medii care conin
sulfii i o sare a unui metal solubil (n general fier sau, uneori, bismut sau plumb).
Bacteriile anaerobe sunt de multe ori capabile s utilizeze sulfiii ca acceptori de
hidrogen. Caracterul sulfito-reductor se evideniaz prin cultivare pe bulion de carne sau
bulion de carne cu extract de drojdie la care se adaug, dup sterilizare, 0,4% sulfit de
sodiu i cteva picturi de citrat de fier (sau alaun de fier). Dup inoculare i termostatare
corespunztoare, reducerea sulfitului se evideniaz prin apariia petelor negre date de
sulfur. Se pot utiliza i alte medii precum: bulion-lactoz-sulfit; geloz Wilson Blair.
Reducerea tiosulfatului (S2O32-) se studiaz prin cultivarea microorganismelor pe
bulion de carne sau bulion de carne cu extract de drojdie cu adaosul unei sri de fier, sau
pe mediul geloz cu acetat de plumb, prin adugarea unei picturi de 10 % tiosulfat de
sodiu.
Producerea de H2S este caracteristic i microorganismelor care au capacitatea de
a produce reducerea sulfailor i sulfiilor prezeni n mediul de cultur. Din grupul
microorganismelor sulfito-reductoare fac parte bacteriile anaerobe din genul
Clostridium (Cl. sporogenes, CI. perfringens .a.).
Prin cultivare, n condiii strict anaerobe, pe mediii specifice ce conin sulfat de
fier, timp de 10-14 zile, testul este pozitiv cnd la baza vasului de cultivare se formeaz
un sediment de sulfur de fier de culoare neagr.

II.1.4 Evidenierea puterii reductoare

Punerea n eviden a capacitii reductoare a unor microorganisme se realizeaz
prin cultivare pe medii specifice n prezena indicatorilor redox: albastru de metilen,
clorur de trifenil tetrazoliu (TTC) sau tinctur de turnesol. Reacia de reducere este
catalizat de reductazele produse de celulele vii. Reducerea este certificat de schimbarea
culorii probei.
Pentru studiul streptococilor se recomand utilizarea mediului Sherman - lapte cu
0,1% albastru de metilen. n aerobioz se produce reoxidarea albastrului de metilen cu
40

oxigenul din aer, cu eliberare, n cazul unei aerri puternice, de ap oxigenat. n aceste
condiii se dezvolt numai microorganismele catalazo-pozitive.
Prin reducere, clorura de trifenil tetrazoliu (TTC) i modific culoarea de la
glbui la rou-brun ca urmare a apariiei formazanului (punerea n eviden a
streptococilor fecali sau a entero-bacteriilor).
Reducerea turnesolului se evideniaz prin decolorare indicatorului, reacie
utilizat pentru studiul bacteriilor lactice, prin cultivare pe lapte turnesolat.

II.1.5 Evidenierea enzimelor respiratorii

Punerea n eviden a enzimelor respiratorii se face, n special, prin:
Evidenierea producerii de oxidaze
Evidenierea producerii de catalaz
Studiul inhibiiei enzimelor respiratorii

Evidenierea producerii de oxidaze

Oxidazele microbiene au proprietatea de a cataliza reacia de oxidare a unui
substrat organic, n prezena oxigenului din aer. Substratul utilizat este soluie 1% oxalat
de N-dimetil parafenilen diamin. Acest compus este incolor n forma redus i se
coloreaz n rou-violet cnd trece n forma oxidat. Se mai poate utiliza clorhidrat de
tetrametilen parafenilen diamina, care d o coloraie purpurie.
Analiza permite evidenierea global a potenialului oxidazic (oxidazo pozitiv) al
unei tulpini, fr a putea evidenia prezena unor oxidaze particulare.
Pentru studiu se utilizeaz o cultur tnr aflat pe mediul cu geloz, utiliznd
diferite tehnici de analiz.
Tehnica de pulverizare a reactivului Mac Lead se poate aplica pentru coloniile
dezvoltate pe medii dense, n cutii Petri. Se utilizeaz o soluie proaspt de reactiv, care
se pulverizeaz pe suprafaa culturii. Coloniile oxidazo-pozitive se vor colora n rou n
cteva minute. Pentru a evita pierderea culturii, se face imediat repicarea culturii de
interes, deoarece reactivul are o aciune toxic asupra celulelor.

41

Evidenierea producerii de catalaz

Catalaza este enzima care catalizeaz reacia de descompunere a apei oxigenate
formate prin activitatea metabolic a microorganismelor.
Pentru evidenierea activitii catalazice se depun pe o lam o pictur din
suspensia de celule de analizat i o pictur soluie proaspt de ap oxigenat (10
volume). Celulele au activitate catalazic cnd n scurt timp se observ degajarea de bule
de gaz, prin formare de spum. Reacia se poate verifica i ntr-o suspensie dens de
celule sau direct pe mediu solidificat, cnd coloniile formate la suprafaa mediului se
acoper cu 2-3 picturi ap oxigenat. La suprafaa coloniilor catalazo-pozitive se va
evidenia degajarea de bule de gaz cu formare de spum mai mult sau mai puin
abundent, n funcie de potenialul catalazic al microorganismelor.
La unele bacterii lactice poate s se evidenieze un fals efect catalazo-pozitiv.
Pentru confirmare se realizeaz un test cu benzidin.
Dintr-un amestec format din 0,5 cm3 reactiv (cu benzidin) + 0,5 cm3 H2O2 (4
volume) se depun cteva picturi pe o cultur aflat pe mediu solidificat. Apariia unei
coloraii albastru nchis confirm prezena catalazei.

Studiul inhibiiei enzimelor respiratorii

Se utilizeaz testul de inhibiie cu cianur. Cianura inhib enzimele respiratorii
implicate n secvenele cilor metabolice terminale. Microorganismele care posed aceste
enzime nu se pot dezvolta ntr-un mediu cu KCN. Mediile recomandate pentru acest test
sunt: Buttiaux, Braun sau Mller, pH =7,5.
Dup preparare, mediul se repartizeaz n eprubete, se sterilizeaz i se rcete,
apoi se adaug 0,5 cm3 soluie apoas 0,5% cianur de potasiu, pH=7,5. Celulele
recoltate cu o ans, dintr-o cultur n vrst de 24 h, se inoculeaz n mediul astfel
pregtit, apoi, dup 48 h de termostatare n condiii optime, se examineaz creterea
microorganismelor.
Se apreciaz: KCN (+) - microorganisme dezvoltate n condiiile testate;
KCN (-) - absen cretere.

42

II.2 Studiul capacitii microorganismelor de a metaboliza glucidele

Pentru identificarea microorganismelor, este important s se studieze i
capacitatea lor de a se dezvolta pe anumite medii selective de diagnosticare sau prin
urmrirea potenialului de metabolizare a unor compui introdui n mediul de cultur al
microorganismului studiat.
II.2.1 Asimilarea glucidelor simple - auxanograma
Pentru identificarea microorganismelor organotrofe se stabilesc glucidele care le
favorizeaz creterea, atunci cnd acestea reprezint unica surs de carbon prezent n
mediul de cultur. Dintre acestea mai frecvent se utilizeaz: arabinoza, xiloza, glucoza,
fructoza, galactoza, zaharoza, maltoza, lactoza. Prin metabolizarea specific a acestor
substane se pot forma acizi organici, gaze, aldehide i cetone.
II.2.2 Studiul potenialului de hidroliz al amidonului
Unele microorganisme (bacterii i mucegaiuri) sunt capabile s sintetizeze
hidrolaze extracelulare de tipul i amilaze, glucoamilaze, care pot hidroliz enzimatic
amidonul pn la produse cu greuti moleculare din ce n ce mai mici, i anume
eritrodextrine, acromo-dextrine, maltoz, glucoza, ce pot fi utilizate de microorganisme
drept surse de carbon i energie. Pentru punerea n eviden a acestor proprieti se
folosete un mediu nutritiv (BCA sau MMA) cu 0,2% amidon solubil. Dup sterilizare,
mediul se repartizeaz n plci Petri i dup solidificare, cu firul inoculat n suspensia de
celule se inoculeaz "n punct" sau se traseaz o linie de-a lungul diametrului plcii.
Dup 7-10 zile se observ vizual hidroliza amidonului dup zona clar aflat n jurul
coloniei sau n jurul liniei de inoculare. Zona devine mai evident prin adugarea n plac
a unei soluii de Lugol. n acest caz amidonul nehidrolizat va cpta culoare albastr,
zona de formare a dextrinelor o culoare roie-brun, iar zona n care amidonul este
complet hidrolizat va rmne incolor. Determinarea semicantitativ a activitii
amilolitice a diferitelor microorganisme se poate realiza prin stabilirea raportului ntre
diametrul zonei n care s-a produs hidroliza complet a amidonului i diametrul coloniei
microorganismului de studiat, n condiii determinate de timp i temperatur de
termostatare.

43

II.2.3 Studiul fermentaiei alcoolice

Pentru studiul fermentaiei alcoolice i al factorilor care condiioneaz viteza de
fermentare a glucidelor fermentescibile se folosesc culturi pure de drojdii aparinnd
genului Saccharomyces.
Pentru obinerea inoculului, celulele de drojdie din eprubeta cu cultur pur, pe
must de mal-agar nclinat, se transfer n must de mal lichid (baloane cu 25 cm3 mediu)
i se termostateaz 24 h la 25...30C.
Inoculul obinut se transfer, n proporie de 2-4 %, cu o pipet steril n 3 vase
de fermentare ce conin 150 cm3 must de mal cu aceeai concentraie sau must de
struguri cu 20% zahr, prevzute cu ventile de fermentaie.
Dup montarea ventilului de fermentaie, sterilizat separat de vasul ce conine
mediul, n ventil se introduce, prin orificiul superior, un volum redus (2-3 cm3) de acid
sulfuric concentrat. Acesta va permite eliminarea dioxidului de carbon rezultat in timpul
fermentaiei i va reine vaporii de ap i alte substane volatile.
Dup cntrirea iniial a fiecrui vas, la o balan cu precizie, acestea se
termostateaz la 30C, timp de 3 zile. La intervale de 6, 24, 48, 72 ore se face agitarea
mustului pentru eliminarea CO2 format, apoi se cntrete fiecare vas i se calculeaz
prin diferen cantitatea medie de CO2 degajat.
II.2.4 Studiul fermentaiei lactice
Fermentaia lactic este un proces anaerob prin care substratul hidrocarbonat este
metabolizat sub aciunea echipamentului enzimatic al bacteriilor lactice n acid lactic ca
produs principal al fermentaiei.
n cazul bacteriilor lactice homofermentative, pe lng acid lactic se acumuleaz
i produse secundare: acid acetic, alcool etilic, glicerol, CO2.
II.2.5 Studiul fermentaiei butirice
Fermentaia butiric este un proces strict anaerob, prin care substratul
hidrocarbonat (amidon, dextrine, lactoz, glucoza .a) este metabolizat n condiii neutre
de pH, sub aciunea enzimelor elaborate de bacterii din genul Clostridium, n acid butiric,
CO2 i H2 ca produse principale.

44

II.3 Studiul metabolismului compuilor cu azot

II.3.1 Evidenierea potenialului microorganismelor de a hidroliza ureea
Hidroliza ureei este realizat de un grup numeros de microorganisme capabile s
produc enzima ureaz.
Ele aparin eubacteriilor (genurile: Achromobacter, Bacillus, Clostridium,
Corynebacterium, Pseudomonas), actinomicetelor i fungilor filamentoi, urobacteriilor
(caracterizate prin rezisten la concentraii mari de uree i pH alcalin i prin capacitatea
de a elibera cantiti mari de NH3).
Din grupul urobacteriilor fac parte o serie de bacterii precum: Bacillus probatus,
Bacillus freudenreichii, Urobacillus paslearii, Urobacillus miquellii. Sarcina ureae,
Micrococcus ureae, Planosarcina ureae .a.
Conversia ureei la NH3, sub aciunea ureeazei decurge conform reaciilor:
CO(NH2)2 + 2H2O

(NH4)2CO3

2NH3 + CO2 + H2O

Evidenierea producerii de ureaz este sesizat calitativ, ca urmare a creterii

alcalinitii, printr-un indicator de pH. Cultivarea se realizeaz pe medii lichide specifice:
mediul Ferguson (uree-idol); mediul Stuart (care conine rou de fenol). n cazul
microorganismelor ureazo-pozitive, culoarea mediului vireaz n rou.
II.3.2 Studiul activitii de proteoliz (hidroliza gelatinei i a cazeinei)
Bacteriile de putrefacie i majoritatea fungilor produc enzime proteolitice
extracelulare i determin degradarea substraturilor bogate n protide. Pentru
determinarea activitii de proteoliz se folosesc metode calitative i cantitative bazate pe
hidroliza enzimatic a gelatinei sau a unor protide mai complexe (cazein, ovalbumin).

Hidroliza gelatinei
n funcie de potenialul lor de biosintez a enzimelor proteolitice, microorganismele pot fi capabile s produc lichefierea gelatinei (bacterii, fungi filamentoi),
sau sunt lipsite de aceast proprietate (drojdii).
Dup inocularea culturii de studiat, prin nepare n tub de mediu drept (bulion de
carne cu gelatin-BCG sau must de mal cu gelatin-MMG), n eprubete, i termostatare

45

la temperatura de 20C, la o periodicitate de 48 h, pe un interval de 2 sptmni, se

descrie modul n care s-a produs lichefierea gelatinei, pentru culturile gelatinazo-pozitive.
Pentru determinri semicantitative se recomand utilizarea mediului Frazier (cu
4% gelatin). Dup inocularea "n punct" a celulelor aparinnd microorganismului de
testat, pe suprafaa mediului Frazier repartizat n plci Petri i termostatare la 37C, timp
de 24-48 h (pentru bacterii de putrefacie), sau la 25...28C, timp de 3 zile (pentru
mucegaiuri), se inund placa cu soluie de clorur mercuric.
n aceste condiii, n jurul coloniilor aparinnd microorganismelor cu activitate
gelatinolitic apare o zon clar, transparent, n contrast cu zona opac n care gelatina
nu a fost hidrolizat.

Hidroliza cazeinei
Studiul capacitii microorganismelor de a produce hidroliza cazeinei se
realizeaz prin cultivare pe diferite medii cu lapte. Laptele, prin coninutul su n lactoz,
cazein, vitamine i sruri minerale, reprezint un mediu optim pentru dezvoltarea
bacteriilor care pot produce fermentarea lactozei, proteoliza cazeinei sau ambele
transformri.
Prin inoculare '"n punct" pe medii solidificate cu agar ce conin i 10% lapte i
termostatare n condiii optime de cretere, coloniile cu activitate cazeinolitic vor
prezenta n jurul lor o zon clar, comparativ cu restul mediului care este opac. Apariia
zonei clare se datoreaz hidrolizei cazeinei din imediata vecintate a coloniilor ca urmare
a producerii de proteaze extracelulare de ctre microorganismele cu activitate
cazeinolitic.
Mediile conin drept indicator de pH, purpur de brom crezol, pH la valoarea 7,3.
Modificarea culorii indicatorului, caracteristic unui pH acid, denot acidifiere
asociat cu coagularea laptelui ca urmare a fermentrii lactozei i formrii de acid lactic.
Cnd microorganismele de studiat produc proteoliza cazeinei, pH-ul rmne
neutru sau devine alcalin, cu modificarea specific a culorii indicatorului n domeniul
alcalin de pH.
n stadii avansate de proteoliza are loc peptonizarea laptelui.

46

II.3.3 Metabolismul aminoacizilor

Formarea amoniacului
Amoniacul poate s rezulte n urma dezaminrii aminoacizilor prezeni n mediul
de cultur al microorganismului de studiat. Acesta este parial folosit drept surs de azot,
iar excesul se elimin i poate fi evideniat pe cale chimic. Pentru evidenierea
producerii de amoniac, drept medii de cultur se recomand apa peptonat sau un mediu
lichid care conine un aminoacid special (de exemplu, bulion-arginin). Mediul se
repartizeaz n eprubete, se sterilizeaz i se inoculeaz cu celulele aparinnd
microorganismului de studiat. Dup termostatare n condiii oprime, producerea de
amoniac este evideniat prin reacia de culoare cu reactivul Nessler (cteva picturi),
cnd proba capt culoare galben-oranj.

Producerea de H2S
Sub aciunea unor microorganisme asupra aminoacizilor ce conin sulf n
molecul (metionin, cistin, cistein), prezeni n mediul de cultur, are loc eliberarea de
H2S. Aceast proprietate se poate pune n eviden prin cultivarea microorganismelor n
mediu de bulion de carne cu pepton repartizat n eprubete i sterilizat. Dup inocularea
mediului cu o suspensie de celule, ntre dopul de vat i gtul eprubetei se introduce o
band de hrtie steril mbibat n soluie 10% acetat de plumb, astfel nct s nu ating
suprafaa mediului. Se recomand ca dopul eprubetei s se acopere cu o folie din plastic
pentru a evita evaporarea rapid a gazului care se formeaz. Durata cultivrii este 7-10
zile. Eliberarea de H2S se evideniaz prin nnegrirea hrtiei, ca rezultat al formrii
sulfurii de plumb (PbS).
O alt metod de evideniere a H2S eliberat de ctre microorganisme const n
cultivarea acestora pe un mediu specific, care conine proteine i sulfat de fier: mediul
pepton-fier-agar, mediul Mossel, mediul Lingby cu geloz. Mediul cu agar repartizat n
eprubete se sterilizeaz la 0,5 atm. i se nclin sau se pstreaz ca atare, sub form de tub
de gel. Cu firul ncrcat cu celule se aplic striuri la suprafaa mediului (pentru
microorganisme aerobe), sau inocularea se realizeaz n profunzimea tubului de gel drept
(pentru microorganisme anaerobe, facultativ anaerobe sau microaerofile). Prin creterea

47

biomasei, o dat cu eliberarea de H2S, are loc nnegrirea mediului ca rezultat al formrii
sulfurii de fier.

II.4 Studiul metabolismului lipidic

Activitatea lipazic (esterazic) a microorganismelor poate fi pus n eviden
prin:
Cultivarea "n punct" pe un mediu solidificat cu adaos de ulei de msline steril
(nainte de repartizarea n plci Petri). n mediu se adaug 0,006 % albastru de Victoria.
Tulpinile cu activitate lipolitic vor fi puse n eviden prin prezena n jurul coloniilor a
unui precipitat de culoare albastru-deschis, dat de acizii eliberai n mediu;
Cultivarea "n punct" pe mediu solidificat cu adaos de tributirin - prin aceasta,
tulpinile lipazo-pozitive vor prezenta n jurul coloniilor o zon clar. n acest caz, se pot
utiliza i variante de mediu de cultur cu adaos de compui indicatori. De exemplu, dac
mediul conine albastru Evans, n jurul coloniilor cu activitate lipazic va aprea o zon
clar, comparativ cu restul mediului de culoare albastr. Dac n compoziia mediului de
cultur se utilizeaz un indicator de pH (de exemplu, rou de fenol), n jurul coloniilor
tulpinilor active va aprea o zon cu coloraie galben ca urmare a acidifierii produse de
acidul butiric format;
Studiul activitii lecitinazice - se face utiliznd un mediu cu glbenu de ou. n
geloz nutritiv obinuit se adaug o soluie (5-10%) de glbenu de ou n ser fiziologic
steril. Mediul se repartizeaz n plci Petri sterile i dup solidificare celulele
microorganismelor de studiat se inoculeaz "n punct" pe suprafaa mediului. Dup
termostatare n condiii optime de cretere, tulpinile cu activitate lecitinazic vor prezenta
n jurul coloniilor o zon opac.

III. STUDIUL ALTOR PROPRIETI FIZIOLOGICE

GENERALE
III.1 Evidenierea mobilitii celulelor
Mobilitatea celulelor, n special n cazul bacteriilor, se poate evidenia prin
examen microscopic direct (n preparat umed n pictur suspendat) sau prin examen
cultural.
48

Pentru examenul cultural se folosesc medii semisolide speciale cu geloz. Pentru

studiu, celulele sunt inoculate n mediu cu firul drept, iar dup termostatare
corespunztoare mobilitatea se apreciaz n funcie de potenialul de invadare, mai mare
sau mai redus, al mediului de cultur.
Se poate utiliza, de asemenea pentru studiul mobilitii, mediul cu manitol, slab
solidificat, care poate conine nitrai i un indicator de culoare ce permite evidenierea
degradrii manitolului prin virajul culorii de la rou la galben.

III.2

Studiul

comportamentului

microorganismelor

medii

hipertonice (halofilia, osmofilia)

Pentru evidenierea capacitii unor microorganisme de a se dezvolta n medii cu
concentraii ridicate de sare sau zahr, se recomand cultivarea lor n medii lichide sau
solidificate, cu adaos de pn la 60 % glucoza sau zaharoz (pentru microorganisme
osmofile) i pn la 10% NaCl (pentru microorganisme halofile). Capacitatea de
dezvoltare pe astfel de medii se verific dup o perioad de termostatare, la temperatura
optim de cretere, specific microorganismelor testate.

III.3 Stabilirea domeniului de temperaturi eugenezice pentru

dezvoltarea microorganismelor
Domeniul

general

al

temperaturilor

eugenezice

pentru

majoritatea

microorganismelor cu implicaii n industria alimentar este situat ntre 0 i 75C i este

mai extins n limite extreme de - 34...250C, n cazul archebacteriilor.
Pentru analiz, se prepar un mediu nutritiv lichid, optim pentru cretere, care se
repartizeaz n eprubete i se sterilizeaz. n momentul utilizrii, se inoculeaz mai multe
eprubete n paralel, cu aceeai concentraie de celule n stare activ a microorganismelor
de studiat, apoi eprubetele se plaseaz n termostate reglate la intervale apropiate de
temperaturi n domeniul eugenezic. De exemplu, pentru microorganisme mezofile la: 20;
30; 37; 42; 48C.
Dup 48 h de cultivare se analizeaz turbidimetric gradul de dezvoltare al culturii
i se apreciaz cu:
0

= cretere absent;

= cretere slab;
49

++ = cretere bun;
+++ = cretere foarte bun.
Aceste rezultate permit stabilirea temperaturii optime i a temperaturilor limit
de dezvoltare.

III.4 Evidenierea capacitii de sporogenez a bacteriilor

Prezena endosporilor bacterieni se poate pune n eviden prin pasteurizarea unei
suspensii de celule, timp de 10 min, Ia 70...80C, cnd sunt distruse toate formele
vegetative ale bacteriilor, n timp ce endosporii supravieuiesc prin acest tratament.
Creterea bacteriilor dup acest tratament presupune prezena sporilor. Se recomand
cultivarea pe medii care induc sporularea, nainte de tratamentul termic.
Evidenierea endosporilor bacterieni se poate realiza i prin examen microscopic
direct. Sporii bacteriilor, aparinnd genurilor Bacillus, Clostridium, prezint anumite
particulariti citologice care i difereniaz de celula vegetativ.
n preparat microscopic sporii se pot evidenia prin studiul celulelor vii sau prin
metode de colorare diferenial.
n frotiurile clasice fixate i colorate simplu sau dup metoda Gram, endosporii
nu se coloreaz, ei putnd fi observai n celul sub form de incluziune necolorat, n
timp ce exosporium se coloreaz.
Prin metode speciale de colorare (nclzire n prezen de colorani) se produce
colorarea att a sporilor ct i a citoplasmei, iar dup splare cu ap citoplasma se
decoloreaz, n timp ce sporii rmn colorai deoarece rein puternic colorantul.

III.7 Studiul rezistenei microorganismelor la antibiotice sau la ali

compui cu efect inhibitor
Rezistena microorganismelor fa anumite antibiotice este un caracter frecvent
utilizat n studii de taxonomie i de asemenea prezint un interes deosebit pentru industria
de biosintez.
Microorganismului testat se cultiv pe un mediu de cultur lichid sau solidificat
care conine antibioticul sau compusul cu aciune inhibitoare, sterilizat prin filtrare i
adugat, n momentul inoculrii, n mediul de cultur steril. Dup termostatare n condiii

50

optime, se apreciaz gradul de dezvoltare al culturii i, n funcie de acesta, sensibilitatea

sau rezistena microorganismului.
Prin metode semicantitative se poate evalua gradul de inhibare, precum i
concentraia care determin un efect microbiostatic sau microbicid.
Mediile de cultur recomandate pentru astfel de determinri au n compoziie
glucoza (0,5%), la care se adaug i alte ingrediente, n funcie de microorga-nismul
testat (bacterii, drojdii etc.), iar tehnica se numete antibiogram.

III.8 Teste rapide pentru studiul caracterelor biochimice ale

microorganismelor
n prezent, firme specializate comercializeaz "seturi pachet" de teste pentru
caracterizarea biochimic a microorganismelor, ceea ce permite identificarea la nivel de
specie ntr-un interval de timp mult mai scurt, comparativ cu metodele clasice.
Exemplu: Sistemul API 20C, format din 20 microtuburi (capsule mici) dispuse n
serie, este destinat studiului caracterelor biochimice ale drojdiilor i conine 20
microtuburi, dintre care:
8 microtuburi sunt destinate studiilor de fermentaie, coninnd fiecare cte un
glucid fermentescibil (glucoza, galactoz, maltoz, zaharoz, lactoz, rafinoz, trehaloz
i melibioz) i purpur de brom crezol ca indicator de pH;
11 microtuburi servesc studiilor de asimilare a glucidelor (aceleai ca la teste de
fermentaie plus inozitol i celobioz), precum i un tub martor pentru interpretarea
rezultatelor;
1 microtub servete Ia testarea rezistenei la actidion.
Celulele de studiat sunt inoculate mai nti ntr-un mediu de baz, fr substana
test, apoi o cantitate mic de mediu inoculat se transfer aseptic n fiecare microtub. n
funcie de caz, analiza rezultatelor se face dup 4-48 h. Profilurile biochimice sunt
interpretate cu ajutorul unor tabele sau cataloage analitice.

IV. METODE IMUNOLOGICE

Imunologia const n studiul relaiilor dintre substanele strine unui organism
superior (antigeni) i aprtorii specifici ai acelui organism (anticorpi). Antigenii sunt
macromolecule cu compoziie chimic diferit care au situsuri active. Microorganismele
51

conin numeroase tipuri de antigeni, de natur bine definit, care caracterizeaz fiecare
specie i uneori unele varieti (serotipuri).
n cadrul metodele imunologice de analiz a microorganismelor sunt incluse
urmtoarele categorii de tehnici:
Tehnici principale de analiz
Tehnici imuno-enzimatice
Principiul metodelor imunologice
Atunci cnd un antigen ptrunde n organismul gazd, induce formarea
anticorpilor specifici (puterea antigenic). Aceast reacie se produce in vivo dar i in
vitro. Manifestrile unei astfel de reacii sunt variabile:
un antigen molecular (element microbian sau toxin) reacioneaz cu un anticorp
printr-o reacie de precipitare sau neutralizare;
bacterie, care conine un ansamblu de antigeni, reacioneaz cu anticorpii printr-o
reacie de precipitare.
Reacia antigen-anticorp realizat in vitro permite, n cazul unor analize, s se
identifice antigenul, deci un microorganism necunoscut, cu ajutorul anticorpului cunoscut
sau s se identifice un anticorp necunoscut, n cazul unei mbolnviri, i microorganismul
responsabil de aceasta cu ajutorul antigenilor cunoscui.
Aceste reacii sunt utilizate i n taxonomia microorganismelor i pentru
realizarea unor analize microbiologice. De obicei, se pun n eviden antigenii, utiliznd
fie anticorpi "naturali" policlonali (obinui de la animale: iepure, cal .a), fie anticorpi
monoclonali, cu specificitate nalt, obinui prin inginerie genetic (hibridoame).

IV.1 Tehnici principale de analiz

Precipitarea sau aglutinarea n mediu lichid se bazeaz pe reacii care au loc n
prezena antigenilor i anticorpilor specifici, prin interaciunea dintre situsurile active.
Precipitarea are loc n cazul unor antigeni moleculari (de exemplu toxine). Aglutinarea
are loc n cazul unei legturi dintre anticorp i un antigen particular (aglutinare simpl
sau direct, numit i aglutinare activ sau omogen).

52

Reacia n tub sau test inel (ring - test) utilizeaz un tub capilar care conine un
ser (anticorp), la care se adaug antigenul. n zona de contact se formeaz un precipitat
floconos (n form de inel). Testul anticorp Brucella utilizeaz antigen colorat (fig. a)
Reacia pe lam sau plac. Reaciile de precipitare sau aglutinare se pot realiza
pe lam sau pe microplac de titrare (fig. b). Citirea se poate face vizual sau automatizat.
Microplcile sunt folosite pentru evidenierea i dozarea anticorpilor i toxinelor prin
utilizarea diluiiior. Pentru evidenierea celulelor se folosesc lame sau microplci care
permit efectuarea de teste multiple cu o serie de anticorpi.
Reacii imunologice de baz
a - reacia n tub (ringtest): test simplu n capilar (1); test
cu antigen colorat (2);
b - reacia pe lam (se
observ o aglutinare n pictura din
dreapta);
c - tipuri de anticorpi
utilizai: anticorpi nemarcai (1);
anticorpi

marcai

direct

(2);

anticorpi marcai indirect (3);

d

inhibiie

prin

hemaglutinare: hematie i antigen

(1); competiie fa de anticorpi
ntre antigenii purtai de hematii i
antigenii de detectat (2).

IV.1 Tehnici principale de analiz

Reacia n eprubet. Se amestec antigenii cu anticorpii n eprubete i se observ
apariia unei precipitri sau aglutinri. Pentru dozri cantitative de antigeni sau anticorpi
se realizeaz diluii i se analizeaz probele turbidimetric sau nefelometric ( = 350-400
nm).

53

Sisteme particulare. Atunci cnd se utilizeaz un suport pe care se fixeaz

anticorpul are loc o precipitare sau aglutinare pasiv. Suportului are natur diferit (bile
de latex, hematii, particule magnetice). De exemplu, testul de aglutinare "Spectate" (RP
Diag, Rhne-Poulenc) permite evidenierea prezenei bacteriilor din genul Salmonella.
Anticorpii sunt imobilizai pe microbile de latex care se coloreaz diferit n funcie de
tipul de anticorpi. Rezultatele sunt interpretate n funcie de culoarea obinut. Teste
similare, de aglutinare pe latex, sunt utilizate pentru confirmarea prezenei bacteriilor din
genurile: Staphylococcus, Escherichia, Listeria, Campylobacter, Legionella.

IV.1 Tehnici principale de analiz

Imunofluorescena. Marcajul fluorescent al anticorpului permite vizualizarea
antigenului. Metoda direct utilizeaz antigen i anticorp marcat specific. Metoda
indirect utilizeaz un anticorp specific i o antiglobulin. n cazul utilizrii
microscopului cu epifluorescen, preparatul se coloreaz cu ajutorul unui marker
specific fluorescent. Astfel, se pot distinge cu uurin celulele fluorescente de altele.
Aceast metod permite evaluarea cantitativ a celulelor aparinnd unei tulpini sau
evidenierea contaminanilor. Derivat de la aceast metod de analiz au fost puse la
punct tehnici de nalt performan, i anume: FPIA - Fluorescence Polarization
Immunoassay, FETI - Fluorescence Excitation Transfer Immunoassay .a.
Tehnici de separare a antigenilor i anticorpilor. Pentru separarea antigenilor
sau anticorpilor se apeleaz n prezent la tehnici de imuno-afinitate. Exist sisteme
comerciale pentru analize de nalt specificitate. De exemplu, sistemul RP Diag (RhnePoulenc) permite detectarea i extracia aflatoxinelor i ochratoxinei prin utilizarea
anticorpilor monoclonali, reinui pe coloan (Aflascan. Aflaprep, Ochraprep). Metodele
de extracie i solvenii utilizai variaz n funcie de produs, i anume: metanol : ap pentru lapte: cloroform - pentru produse solide .a. Detectarea se face n UV, prin
fluorescen.
Alte tehnici: tehnica ELIFA - Enzyme Linked Immunofiltration Assay - pentru
separarea antigenilor; separare prin utilizarea particulelor magnetice sistemele Vicam,
Dynal .a.

54

IV.2 Tehnici imuno-enzimatice

Sunt n prezent cele mai moderne tehnici de analiz utilizate pentru identificarea
microorganismelor.
Metoda ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay) este metod modern,
precis, uor de utilizat, care are la baz tehnici imuno-enzimatice.

Principiul metodei ELISA i variante

Anticorpul se fixeaz pe un suport solid (microplac, bile, tub), analiza putnduse realiza n 2 sisteme:
a) n sistem heterogen, cnd anticorpul se imobilizeaz pe suport;
b) n sistem omogen, cnd reacia antigen-anticorp se opune reaciei enzimatice.

Metoda ELISA n sistem heterogen (a, b, c, d) i omogen (e)

55

a - tehnica direct simpl (anticorpi marcai); b - tehnica indirect simpl

(anticorpi + anticorpi antianticorpi marcai); c - tehnica tip sandwich (direct); d tehnica prin competiie; e - tehnica in sistem omogen, reacia antigen-anticorp se
opune reaciei enzimatice.

Sisteme ELISA de identificare a microorganismelor

Sistemul Tecra 3M
Utilizeaz metoda tip sandwich. n capsulele n care se afl anticorpii se
introduce un eantion de prob, tratat termic 15 min la 100C, pentru extracia
antigenilor.
Dup termostatare i splare se adaug anticorpul conjugat unei enzime (de
exemplu, peroxidaz); urmeaz din nou splare, adugarea substratului i o nou
termostatare.
Testul este pozitiv, n cazul prezenei antigenilor, prin apariia culorii verde.
Acest sistem se utilizeaz pentru identificarea serotipurilor de Listeria i Salmonella.

Sistemul Kit HEC

Utilizeaz o combinaie ntre testul ELISA i detectare pe Petrifilm. Tehnica
permite identificarea serotipurilor enteropatogene de E. coli 0157 H7.
Metoda se bazeaz pe utilizarea unei membrane active ELISA care este pus n
contact timp de 2 min. cu un Petrifilm, care a fost termostatat timp de 18 h. Testul este
pozitiv cnd pe membran apar pete de culoare gri.
Exemple de sisteme ELISA de identificare a microorganismelor

Sistemul Organon-Teknika (AES), Sistemul Transia i Sistemul

VIDAS
Sistemul Organon-Teknika (AES) este utilizat pentru identificarea serotipurilor
bacteriilor din genurile Listeria (Listeria Tek ELISA) i Salmonella (Salmonella Tek
Elisa). Identificarea se realizeaz datorit unei peroxidaze conjugate, prin utilizarea ca
substrat a tetrametilenbenzidinei (TMB).

56

Sistemul Transia utilizeaz microplci sau tuburi. Antigenii sunt extrai prin
nclzire la 100C, timp de 10-20 min. Pentru identificarea bacteriilor din genurile
Listeria i Salmonella se folosete metoda sandwich. Anticorpul conjugat este legat de o
peroxidaz, iar substratul este tetrametilenbenzidina (TMB). Pentru mbogire, nainte
de testarea imunologic, se recomand precultivarea pe mediul UVM sau Oxford , pentru
bacteriile din genul Listeria, i n ap peptonat tamponat urmat de o cultivare pe
mediul Rappaport-Vasiliadis, pentru bacteriile din genul Salmonella.
Sistemul VIDAS este utilizat pentru identificarea bacteriilor: Listeria
monocytogenes, Salmonella, Escherichia coli 0157, Campylobacter i a enterotoxinelor
stafilococice.
Teste ELISA pentru identificarea toxinelor i a altor metabolii
Pentru majoritatea toxinelor i a altor metabolii produi de microorganisme, n
prima etap se impune extracia acestora prin metode complexe.
Firme specializate produc i comercializeaz kituri pentru identificarea:
enterotoxinelor stafilococice A, B, C1, C2, C3, D, E; aflatoxinelor B1, G1, G2, M1;
zearenonei; ochratoxinei A; antibioticelor .a.

V. ALTE METODE DE IDENTIFICARE A

MICROORGANISMELOR
Studiul potenialului patogen al microorganismelor
Sunt analizate enzimele care produc patogenitate i se evideniaz pericolul
toxicogen al microorganismelor.
Studiul enzimelor care determin patogenitatea. Enzimele care produc
patogenitate sunt de mai multe tipuri.
Hemolizinele sunt enzime care produc liza hematiilor. Ele sunt puse n eviden
prin cultivarea microorganismelor pe medii solidificate cu snge (de miel sau de cal). n
mediul cu geloz se adaug 20-25 picturi de snge, apoi se omogenizeaz, se
repartizeaz n plci Petri i, dup solidificarea microorganismului, se inoculeaz n strii.
Dup termostatare corespunztoare, se analizeaz aspectul suprafeei din jurul coloniilor,
care poate fi:
zon verzuie, dat de methemoglobin (hemoliz );
57

 zon clar, ca urmare a eliberrii hemoglobinei (hemoliz );

fr modificri (absen hemoliz).

Studiul enzimelor care determin patogenitatea

Coagulazele sunt enzimele care coaguleaz plasma i mpiedic fagocitoza.
Dup cultivarea microorganismelor, pe medii specifice (de exemplu, pentru bacterii din
genurile Staphylococcus, Streptococcus), timp de 24 h, se recolteaz 0,5 cm3 cultur, care
se transfer ntr-o eprubet de hemoliz, dup care se adaug 0,5 cm3 plasm de iepure
diluat (1:5). Amestecul se termostateaz la 37C i se examineaz din or n or, timp de
24 h. Coagularea se examineaz comparativ cu o prob martor (0,5 cm3 cultur + 0,5 cm3
ser fiziologic steril).
ADN-azele (enzime care distrug materialul nuclear al celulelor) se evideniaz
prin cultivare pe un mediu specific care conine ADN. Mediul se repartizeaz n plci
Petri i se inoculeaz "n punct" cu celulele de studiat. Dup termostatare
corespunztoare, hidroliza ADN-ului este evideniat prin vaporizare cu acid clorhidric
1N. Prezena unei zone clare n jurul coloniilor certific un test pozitiv. Acidul poate fi
nlocuit cu o soluie de albastru de toluidin 0,1% i n acest caz developarea unei zone
de culoare roz n jurul coloniilor certific un test ADN-az pozitiv.

Evidenierea producerii de toxine

Pentru evidenierea potenialului toxicogen al microorganismelor sunt utilizate
mai multe metode.
Metode chimice se aplic n special pentru evidenierea toxinelor cu greutate
molecular redus, specifice microorganismelor eucariote.
Metode generale presupun n prim faz extracia i purificarea toxinelor. Pentru
identificarea i dozarea lor se apeleaz la metode cromatografice, chimice sau prin
fluorescen. De exemplu, pentru dozarea aflatoxinelor se realizeaz mai nti extracia
cu soluie metanolic, urmat de separare prin cromatografie de afinitate cu anticorpi
monoclonali (anti B1, B2, G1). Dup eluie cu metanol, dozarea aflatoxinelor se realizeaz
prin msurarea fluorescenei, dup reacia cu SFB (Solution Fluorometry with
Bromine).

58

Metode imunologice se utilizeaz tehnica ELISA sau tehnica de aglutinare n

mediu lichid.
Tehnicile actuale de evideniere a patogenitii microorganismelor utilizeaz
sondelor moleculare sau studiul secvenelor de cromozoni i al plasmidelor implicate n
imprimarea acestui caracter.

VI. STUDIUL SENSIBILITII MICROORGANISMELOR FA DE

FAGI (LIZOTIPIA)
Studiul acestui caracter prezint un deosebit interes, mai ales n cazul bacteriilor.
n funcie de caracterele lor, unele bacterii sunt sensibile la bacteriofagi (de exemplu:
bacterii ale genurilor: Enterobacter, Vibrio, Pseudomonas, Bacillus, Lactobacillus .a),
care le atac n mod specific, producnd liza celulelor.
Lizotipia reprezint capacitatea bacteriofagilor de a ataca n mod specific
anumite biotipuri (tulpini) aparinnd unor specii de bacterii (lizotipuri). Cercetrile de
acest tip sunt realizate de laboratoare specializate, iar tehnica de studiu cea mai utilizat
este tehnica dublului strat.
Pe suprafaa unui mediu solidificat, n prealabil inoculat cu microorganismul de
testat, se etaleaz o suspensie ce conine bacteriofagi. Prezena unor zone de liz a
celulelor, dup o perioad de termostatare, denot o reacie pozitiv fa de bacteriofagi
specifici.

VII. TEHNICI GENETICE PENTRU IDENTIFICAREA

MICROORGANISMELOR
VII.1 Determinarea dimensiunii genomului
Dimensionarea genomului poate fi realizat fie direct, prin extracia ADN-ului i
dozarea sa pe cale chimic sau biochimic, fie indirect, n urma studiului
denaturrii/renaturrii moleculei de ADN. Reacia de refacere a moleculei de ADN
respect o cinetic de ordinul al doilea, conform relaiei:

59

n care: C0 este concentraia iniial de ADN; C - concentraia de ADN la timpul

t; t - timpul de analiz. Se consider c exist o corelaie ntre factorul C0t i mrimea
genomului.
Aceast metod se utilizeaz pentru identificarea bacteriilor i a virusurilor.

VII.2 Compoziia acizilor nucleici

Compoziia n nucleotide poate reprezenta un criteriu taxonomic important
pentru caracterizarea i identificarea microorganismelor. Raportul AT/GC permite
caracterizarea la nivel de specie. Dup liza celulelor se extrage ADN-uI, se purific, iar
dup hidroliz, bazele azotate sunt dozate prin metode chimice, biochimice sau
cromatografice.

VII.3 Determinarea cariotipului (CFP - Chromosome Finger Printing)

Cariotipul definete natura i numrul de cromozomi. El se poate determina
direct, prin examen microscopic, n timpul diviziunii celulare, dup colorarea celulelor
(lucru destul de dificil de realizat n cazul microorganismelor), precum i prin extracia
materialului nuclear i analiza lui n cmp pulsant, pe gel de agaroz (tehnica CHEF
Clamped Homogeneous Electric Field). Acest tratament permite separarea cromozomilor
n funcie de dimensiuni, apoi ei sunt vizualizai cu ajutorul razelor UV, dup tratare cu
bromur de etidium.

VII.4 Hibridarea ADN-ului. Variante

A. Utilizarea sondelor genetice
Stabilirea omologiei ADN/ADN bazat pe hibridare constituie o metod eficient
pentru identificarea microorganismelor la nivel de specie. n funcie de gradul de
omologie, se poate stabili apartenena microorganismelor dup cum urmeaz:
>80% - biotipuri ale aceleiai specii;
30-80% - specii care aparin aceluiai gen;
< 30% - microorganisme ncadrate n genuri diferite.
Pentru a realiza identificarea microorganismelor pe aceast cale se apeleaz la
mai multe tehnici, i anume:
Tehnica de baz, care utilizeaz filtru de celuloz;
Hibridarea n soluie;
60

 Hibridarea in situ n plac Petri;

Separarea pe coloan de hidroxiapatit;
Cartografia S1 (S1 nucleas mapping);
Tehnica PCR (Polymerase Chain Reaction).
n general, tehnica manipulrilor cuprinde urmtoarele etape:
depunerea microorganismelor pe un suport solid (filtru) sau inocularea pe un mediu
solidificat n plac Petri;
liza celulelor, denaturarea ADN-ului, fixarea lanului monocatenar;
utilizarea unei sonde marcate i cuplarea sa cu lanul monocatenar.
B. Evideniere prin autoradiografie
Se produc i se comercializeaz diferite kituri care aplic metodele de hibridare
de tip sandwich, n care se folosesc sonde de capturare i sonde semnal. De exemplu,
sistemul Genetrak, care permite identificarea bacteriilor: Listeria monocytogenes,
Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Yersinia enterocolitica, Salmonella sp.,
Campylobacter sp. .a.
De asemenea, se mai pot utiliza diferite tehnici de nalt performan, care permit
identificri la nivel de biotip:
Electroforez n cmp pulsant PFCE (Pulse Field Gel Electrophoresis);
Polimorfism de restricie a ADN-ului - RFLP (Restriction Fragment Length
Polymorphism).

61