umat, 08 Juni 2012

PEMERIKSAAN ELISA

Sejarah
Sebelum

pengembangan

ELISA,

satu-satunya

pilihan

untuk

melaksanakanimmunoassay adalah radioimmunoassay , teknik menggunakan radioaktif antigen atau

antibodi berlabel. Dalam radioimmunoassay, radioaktivitas memberikan sinyal, yang menunjukkan
apakah suatu antigen tertentu atau antibodi hadir dalam sampel. Radioimmunoassay pertama kali
dijelaskan dalam kertas oleh Rosalyn Sussman Yalow dan Salomo Berson diterbitkan pada tahun
1960. Sebuah mikrobiologi menggunakan enzim suatu Linked tes Assay (ELISA) immunosorbent,
dalam rangka untuk mengembangkan metode untuk deteksi cepat antigen p24 HIV dalam sampel
darah.
Karena radioaktivitas menimbulkan ancaman kesehatan potensial, alternatif yang lebih aman
itu dicari. Sebuah alternatif yang cocok untuk radioimmunoassay akan mengganti sinyal nonradioaktif di tempat sinyal radioaktif. Ketika enzim (sepertiperoksidase ) bereaksi dengan substrat
yang sesuai (seperti ABTS atau 3,3 ', 5,5'-tetramethylbenzidine ), perubahan warna terjadi, yang
digunakan sebagai sinyal. Namun, sinyal tersebut harus dikaitkan dengan keberadaan antibodi atau
antigen, yang mengapa enzim harus dihubungkan dengan antibodi yang sesuai. Proses
menghubungkan secara independen dikembangkan oleh Stratis Avrameas dan GB Pierce.

[6]

Karena

itu perlu untuk menghilangkan antibodi atau antigen terikat dengan mencuci, antibodi atau antigen
harus tetap ke permukaan wadah; yaituimmunosorbent telah harus dipersiapkan. Sebuah teknik
untuk mencapai hal ini diterbitkan oleh Wide dan Jerker Porath pada tahun 1966. [7]
Pada tahun 1971, Petrus Perlmann dan Eva Engvall di Universitas Stockholm di Swedia, dan
Anton Schuurs dan Bauke van Weemen di Belanda mandiri makalah yang disintesis pengetahuan ini
ke dalam metode untuk melakukan EIA / ELISA.

ELISA (singkatan bahasa Inggris: Enzyme-linked immunosorbent assay) atau

'penetapan kadar imunosorben taut-enzim' merupakan ujiserologisyangumum
digunakan di berbagai laboratoriumimunologi. Uji ini memiliki
beberapakeunggulan seperti teknik pengerjaan yang relatif sederhana,
ekonomis, danmemiliki sensitivitas yang cukup tinggi. ELISA diperkenalkan pada
tahun 1971oleh Peter Perlmann dan Eva Engvall untuk menganalisis adanya
interaksiantigen denganantibodidi dalam suatu sampel dengan
menggunakanenzimsebagai pelapor (reporter label) (Lequin, 2005).
Teknik ELISA merupakan teknik kuantitatif yang sangat
s e n s i t i f , penggunaannya sangay luas, memerlukan peralatan yang sedikit,
reagen yangdiperlukan sudah tersedia dan dijual secara komersial dan sangat

mudah didapat.Tes ELISA dapat digunakan untuk mendeteksi antigen

maupun antibodiPemeriksaan ELISA dapat digunakan untuk mendeteksi
antibodi dalam tubuhmanusia maupun hewan. Terdapat berbagai teknik dalam
pemeriksaan ELISA.
Metode ELISA (enzym-linked immunosorbent assay)
Metode dalam penelitian dengan Berdasarkan : Ikatan spesifik antara antigen (Ag)
antibody(Ab) terdiri dari :
1. Teknik Qualitatif : Tiap berikatan pada Ag spesifik
2. Teknik Quantitatif : Jumlah Ikatan Ag-Ab ditentukan dengan nilai absorbansi.
Macam sistem metode yang digunakan dalam elisa :
- Direct
- Indirect
- Sandwich
- Capture

METODE PEMERIKSAAN ELISA

ELISA diperkenalkan pada tahun 1971 oleh Peter Perlmann dan Eva Engvall untuk
menganalisis adanya interaksi antigen dengan antibodi di dalam suatu sampel dengan
menggunakan enzim sebagai pelapor. telah digunakan sebagai alat diagnostik dalam
bidang medis, patologi tumbuhan, dan juga berbagai bidang industri. Dalam
pengertian sederhana, sejumlah antigen yang tidak dikenal ditempelkan pada suatu
permukaan, kemudian antibodi spesifik dicucikan pada permukaan tersebut,
sehingga akan berikatan dengan antigennya.
Antibodi ini terikat dengan suatu enzim, dan pada tahap terakhir,
ditambahkan substansi yang dapat diubah oleh enzim menjadi sinyal yang dapat
dideteksi. Dalam ELISA fluoresensi, saat cahaya dengan panjang gelombang
tertentu disinarkan pada suatu sampel, kompleks antigen/antibodi akan
berfluoresensi sehingga jumlah antigen pada sampel dapat disimpulkan berdasarkan
besarnya fluoresensi.
Penggunaan ELISA melibatkan setidaknya satu antibodi dengan spesifitas
untuk antigen tertentu. Sampel dengan jumlah antigen yang tidak diketahui
diimobilisasi pada suatu permukaan solid (biasanya berupa lempeng mikrotiter
polistirene), baik yang non-spesifik (melalui penyerapan pada permukaan) atau
spesifik (melalui penangkapan oleh antibodi lain yang spesifik untuk antigen yang
sama, disebut sandwich ELISA). Setelah antigen diimobilisasi, antibodi pendeteksi
ditambahkan, membentuk kompleks dengan antigen.
Antibodi pendeteksi dapat berikatan juga dengan enzim, atau dapat dideteksi
secara langsung oleh antibodi sekunder yang berikatan dengan enzim melalui
biokonjugasi. Di antara tiap tahap,plate harus dicuci dengan larutan deterjen
lembut untuk membuang kelebihan protein atau antibodi yang tidak terikat. Setelah
tahap pencucian terakhir, dalam plate ditambahkan substrat enzimatik untuk
memproduksi sinyal yang visibel, yang menunjukkan kuantitas antigen dalam
sampel. Teknik ELISA yang lama menggunakan substrat kromogenik, meskipun

metode-metode terbaru mengembangkan substrat fluorogenik yang jauh lebih

sensitive.

Prinsip metode ELISA

mereaksikan antibodi dan antigen secara spesifik, perbedaannya ada pada
substrat ( zat yang digunakan untuk mendeteksi suatu hasil reaksi ) yang digunakan.
Pada ELISA, hasil reaksi akan memunculkan warna yang bisa diukur dengan alat
yang disebut Colorimetri. Pada Fluorescence, hasil reaksi berupa pendaran cahaya
yang terbaca oleh fluoresensi, sedangkan pada Chemiluminescence hasil reaksi
berupa pendaran kimiawi yang terbaca oleh Chemiluminescent.

Jenis Pemeriksaan ELISA

Langkah-langkah "tidak langsung" ELISA mengikuti mekanisme di bawah ini:

Sebuah solusi buffer dari antigen yang akan diuji untuk ditambahkan ke
setiap sumur dari lempeng mikro , di mana ia diberi waktu untuk mematuhi
plastik melalui interaksi biaya.

Sebuah
solusi
non-protein
bereaksi,
seperti bovine
serum
albumin atau kasein , ditambahkan untuk memblokir setiap permukaan
plastik di sumur yang masih dilapisi oleh antigen.

Selanjutnya antibodi primer ditambahkan, yang mengikat secara khusus

terhadap antigen lapisan tes yang baik. Antibodi primer ini juga bisa dalam
serum donor akan diuji untuk reaktivitas terhadap antigen.

Setelah itu, sebuah antibodi sekunder yang ditambahkan, yang akan mengikat
antibodi primer.. Antibodi sekunder ini sering memiliki enzim yang melekat
padanya, yang memiliki efek yang dapat diabaikan pada sifat pengikatan
antibodi.

Sebuah substrat untuk enzim ini kemudian ditambahkan. Seringkali,

perubahan warna substrat ini pada reaksi dengan enzim. Perubahan warna
menunjukkan bahwa antibodi sekunder telah terikat antibodi primer, yang
sangat menyiratkan bahwa donor memiliki reaksi kekebalan terhadap antigen
uji. Hal ini dapat membantu dalam pengaturan klinis, dan dalam R & D.

Semakin tinggi konsentrasi antibodi primer yang hadir dalam serum, semakin
kuat perubahan warna. Seringkali spektrometer digunakan untuk
memberikan nilai kuantitatif untuk kekuatan warna.

Enzim bertindak sebagai penguat, bahkan jika hanya sedikit enzyme-linked tetap terikat antibodi,
molekul enzim akan menghasilkan banyak molekul sinyal. Dalam keterbatasan akal sehat, enzim
dapat terus menghasilkan warna tanpa batas waktu, tetapi yang lebih utama antibodi hadir dalam
serum antibodi donor lebih sekunder + enzim akan mengikat, dan warna lebih cepat akan

berkembang.. Kelemahan utama dari ELISA tidak langsung adalah bahwa metode imobilisasi antigen
non-spesifik, ketika serum digunakan sebagai sumber antigen tes, semua protein dalam sampel bisa
tetap berpegang pada pelat mikro dengan baik, konsentrasi begitu kecil analit dalam serum harus
bersaing dengan protein serum lainnya ketika mengikat ke permukaan baik. Sandwich atau langsung
ELISA memberikan solusi untuk masalah ini, dengan menggunakan "menangkap" antibodi spesifik
untuk antigen tes untuk menariknya keluar dari campuran molekul serum itu.
ELISA dapat dijalankan dalam format kualitatif atau kuantitatif. Hasil kualitatif memberikan
hasil positif atau negatif sederhana (ya atau tidak) untuk sampel. Cutoff antara positif dan negatif
ditentukan oleh analis dan mungkin statistik. Dua atau tiga kali standar deviasi (kesalahan yang
melekat dalam tes) sering digunakan untuk membedakan positif dari sampel negatif. Dalam
kuantitatif ELISA, densitas optik (OD) dari sampel dibandingkan dengan kurva standar, yang
biasanya pengenceran serial solusi dikenal-konsentrasi dari molekul target. Sebagai contoh, jika
sebuah sampel uji mengembalikan OD 1,0, titik pada kurva standar yang memberi OD = 1,0 harus
dari konsentrasi analit yang sama sebagai sampel Anda.
Gambar untuk hak tersebut termasuk penggunaan antibodi sekunder terkonjugasi untuk enzim,
meskipun, dalam arti teknis, hal ini tidak diperlukan jika antibodi primer adalah konjugasi enzim.
Namun, penggunaan konjugasi antibodi sekunder-menghindari proses yang mahal untuk
menciptakan enzim-linked antibodi untuk setiap antigen yang satu mungkin ingin mendeteksi.
Dengan menggunakan antibodi enzyme-linked yang mengikat wilayah Fc dari antibodi lain, antibodi
ini enzyme-linked yang sama dapat digunakan dalam berbagai situasi. Tanpa lapisan pertama
antibodi "menangkap", setiap protein dalam sampel (termasuk protein serum) dapat menyerap
kompetitif ke permukaan piring, menurunkan jumlah antigen amobil. Penggunaan antibodi spesifik
dimurnikan untuk melampirkan antigen ke plastik menghilangkan kebutuhan untuk memurnikan
antigen dari campuran yang rumit sebelum pengukuran, menyederhanakan uji, dan meningkatkan
spesifisitas dan sensitivitas pengujian tersebut.

DAFTAR PUSTAKA

http://moko31.wordpress.com/2011/06/28/tinjauan-tentang-elisa/

: http://id.shvoong.com/exact-sciences/bioengineering-and-biotechnology/2113282-metodeelisa-enzym-linked-immunosorbent/#ixzz1dla9xpCX