KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS (KLT)

Thin Layer Chromatography (TLC)

Banyak digunakan karena :
-sederhana, mudah difahami secara teknik
-waktu analisis relatif pendek, dpt diulangi setiap saat
-ekonomis
Mekanisme pemisahan :

- adsorpsi
- partisi

Fase diam (Stationary phase = sorbent = adsorbent = penjerap)

: Silika gel
: Alumina
: Selulosa

Silika gel :
- silika gel G sbg pengikat digunakan gypsum
- silika gel S sbg pengikat digunakan pati
- silika gel GF 254 ditambah gypsum dan senyawa
berpendar pada UV 254 nm
- silika gel H, Silika gel N [ tanpa pengikat ]
- silika gel tanpa pengikat ttp dengan seny.berpendar
- silika gel untuk keperluan preparatif

Alumina :
- alumina asam (pH 4), netral (pH 7), basa (pH 9).
- Pemberian kode seperti silika gel G.H.P.F.

Selulosa :
- serat 2-20 , serat asli (MN 300), mikrokristal (Avicel) utk
senyawa polar. Dengan atau tanpa senyawa fluorescence.

Pengertian Luminescence (berpendar)

Dibedakan :

Fluorescence ( 10-8 detik) seny organik

Phosphorescence ( > 10-8 detik ) seny anorganik

Indikator fluorescens organik code F366, UV366

Contoh:

- fluorescein dan garamnya

- rhodamin B dan rhodamin 6G
- morin, dll.

Indikator fosforesens anorganik

kode F254, UV254Zn cadmium sulfida hijau kuning
biru-seny timah strontium, kuning- uranil asetat, hijau kuning
manggan zn silikat
kode F254s alkali tanah wolframat biru pucat (untuk fasa
terbalik).

Fase gerak
-Interaksi polaritas (ik hidrogen dan konsep like dissolves like)
-Deret eluotropik
-Perkiraan polaritas campuran pelarut:
pcam = a.pa + b.pb + c.pc +
= fraksi volum
p= angka kepolaran (Rohrschneider dan Snyder)

Pelarut dengan harga P (Introduction to modern

Pelarut

Heksana
1-klorobutana
Isopropil eter
Metilen klorida
Tetrahidrofuran
Kloroform
Etanol
Etil asetat
aseton
Metanol
Asetonitril
Etilena glikol
DMSO
Air

0,1
1,0
2,4
3,1
4,0
4,1
4,3
4,4
5,1
5,1
5,8
6,9
7,2
10,2

liq.chrom.)

Pembuatan Pelat (lempeng) silika gel

+ 30 gram silika gel + air (sejumlah tertentu) diaduk homogen,
tak lebih 4 menit dimasukkan alat perata Stahl-Desaga atur
ketebalan (0,25-2,0 mm). Diratakan diatas 6 lembaran kaca
(20x20 cm). Keringkan di udara, kmd dimasukkan oven 100120oC selama 60 menit. Sejukkan dan simpan dlm eksikator.

Untuk keperluan preparatif dibuat sendiri

Untuk keperluan analitik & preparatif ada dipasaran
diatas lembaran kaca, plastik ataupun aluminium.
bermacam ukuran 20 x 20 cm, 10 x 20 cm dll.

Perbandingan fase diam dan cairan pembuatan pelat

1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.

Fase diam

Jenis cairan

Silika gel G/GF

Silika gel H
Alumina G
Alumina H
Kiselgur
Serbuk selulosa MN 300
Serbuk poliamid

Air
Air
Air
Air
Air
Air
Kloroform :
metanol=2:3

Perbandingan
Fase diam:cairan
( g : ml )
30 : 60-65
30 : 80-90
30 : 40
30 : 80-90
30 : 60-65
1:5
1: 9

Penyiapan dan Penotolan Sampel

- Pelarut sampel yang sesuai
- 1-20 l yang mengandung 50-100g 3-6mm
- Alat penotol : kapiler gelas, mycrosyringe
- overloaded Rf berubah dan bercak tidak simetri

Pengembangan (elusi)
- Bejana diisi fase gerak hingga kedalaman 0,5 cm jenuh
- Totolan (sdh kering) pada plate, dimasukkan bejana
- Totolan jangan tercelup fase gerak
- Batas yang dicapai gerak ditandai dg pensil lemah
- Didokumentasi profil kromatogramnya (Rf).

Macam Cara Pengembangan :

Pengembangan menaik (ascendent)
Pengembangan menurun (descendent)
Pengembangan berulang
Pengembangan mendatar
Pengembangan dua dimensi Pemisahan senyawa flavone Harbone
Pengembangan sirkular kromatotron

Pengamatan / mendeteksi / visualisasi bercak.

Secara langsung
Dengan perlakuan :
destruksi Pereaksi semprot, uap I2 75% tidak rusak
non-destruksi UV lamp

1.
2.
3.
4.
5.
6.

Pelat klt diletakkan menghadap kebawah

Penutup kaca bawah
Bejana berisis fase gerak
Tuas berfungsi kapiler untuk merambatnya fase
gerak
Penutup dari kaca atas
Bejana berisi fase gerak saat penjenuhan dan
pengembangan

Macam pereaksi warna (semprot) dan penggunaannya

Pereaksi

Jenis Senyawa

Warna

1. Anilina ftalat
2. Anisaldehida dalam H2SO4, etanol, dan
bbro tetes asam asetat
3. Stibium klorida dlm CHCl3
4. 2,4-dinitrofenilhidrazin dlm HCl
5. Dragendorff

Gula mereduksi
Karbohidrat

Berbagai warna
Biru

Steroid, lipid alifatik

Aldehida, keton
Alkaloida,basa organik

Berbagai warna
Kuning merah
Jingga

6. Besi (III) klorida

7. Ninhidrin

Fenol
Asam amino

Berbagai warna
Biru

8. -DAB
-Diazotasi kmd dg N-1-naftiletilendiamin

Sulfa

Kuning-oranye
merah

* Introduction of chromatography Roy J. Gritteeer et al

Untuk keperluan mencari sistim KLT selain mencoba-coba, ada

bbrp literatur yg dpt membantu. Mis. buku :
E.G.C.Clarke, Judith Berle, MSc. (1974) :Isolation and
Identification of drugs, The Pharmaceutical Press, London.
: - ada 22 sistem KLT kode T1 sd T22.
- Tiap sistem camp fase gerak tertentu untuk mengelusi gol obat tertentu
fase diam : silika gel dengan ukuran 20 x 20 cm.
Diberikan nilai Rfnya.
: -Untuk sistem Kromatografi kertas kode P1 dan seterusnya
No

Sistem

Golongan Senyawa Obat

1.

T1

Basa Nitrogen (alkaloid)

2.

T2

Antihistamin & klordiazepoksida

3.

T3

Anti histamin

T4 dst

10

T10

Barbiturat

Fase gerak :
aseton 1bg
CHCl3 9 bg
Pengembangan : 10-17 cm
Visualisasi :
KMnO4 warna kuning, coklat, purple.
Pereaksi Zwikkers warna Pink atau hijau

11
12

T11
T12

Barbiturat
Barbiturat

-Fase gerak : lart. Ammoniak pekat 5, Benzen 75,

dan dioksan.

22

T22

Golongan
sulfa

Sampel dilartkan dlm aseton.

Fase gerak : CHCl3 1, Etanol 1, Heptana 1 dan air
1,5%
Kesetimbangan : 3 jam
Visualisasi : diazotasi dengan N-1
naftiletilendiamin (spray).

KLT digunakan untuk analisis :

1. Kualitatif
2. Kuantitatif
Analisis Kualitatif
-Adanya senyawa pembanding
Rf :

Rr :

jarak yg ditempuh senyawa sampel

Jarak yg ditempuh fase gerak
jarak yg ditempuh senyawa sampel
jarak yg ditempuh senyawa pembanding

HRf : 100 x Rf

Commercial TLC plate after development

in normal lighting.

Same TLC plate held under a UV lamp Note the appearance of additional spots.

dR
2
N = 16 ( --------- )
W
1 - Rf
k = ------------Rf

1 - dR/dM
k = ------------dR/dM
dM/dM - dR/dM
= -----------------------dR/dM
dM-dR
= -----------------dR

H
O

R1

R2

Fase gerak : T10

aseton 1bg
CHCl3 9 bg

Nama Senyawa

R1

R2

Barbital
(5,5-dietil as barbiturat)

C2H5-

C2H5-

Fenobarbital

C2H5-

Probarbital

C2H5-

Rf
0,22
0,24
0,24

H3C
HC

Siklobarbital

C2H5-

Amilobarbital

C2H5-

Butobarbital

C2H5-

H3C

0,32
0,33

CH3
CH2
C
H 3C H C
H2

H 3C

H2
C

C
H2

CH2

0,33

Obat golongan Sulfa : Sistem T22

Fase gerak : CHCl3 1, Etanol 1, Heptana 1 dan air 1,5%
H 2N

SO2

Nama senyawa

NH

Sulfadiazin

Rf

( 2-sulfanilamidopyrimidin)

0,47

N
N

Sulfamerazin
(2-sulfanilamido-4-metilpyrimidin)

0,57

N
CH3
CH3
N

Sulfadimidin

0,64

N
CH3

Analisis kuantitatif
- Ketepatan dan ketelitian kurang dibanding krom.gas & HPLC
Dibedakan ada 2 (dua) cara :
1. Bercak langsung diukur luasnya
2. Bercak dikerok kmd dilarutkan dlm pelarut yg sesuai.

1. Bercak langsung diukur luasnya (densitometri)

a. Tanpa menggunakan kurva baku
Purdy & Turter: akar luas bercak berbanding lurus dg log(10) berat
senyawa. Menghitung cara ini perlu adanya tetapan untuk tiap
senyawa pada sistim tertentu KLT
b. Menggunakan kurva baku
kadar
Y = bX + a

luas bercak

2. Bercak dikerok kmd dilarutkan dlm pelarut yg sesuai (dielusi)

timbul ralat karena pemindahan dan elusi.
- Posisi bercak ditentukan dengan Rf senyawa pembanding.
- Dikerok, diekstraksi secara kuantitatif labu takar.
- ditetapkan dengan cara yg sesuai mis : spektrofotometri.

KLT Preparatif
- sampel 50 mg- 1 gram
- sampel ditotolkan sbg pita / garis
- tebal optimum lapisan fase diam 1-1,5 mm
- visualisasi :
- non-destruktif
- destruktif sbg ditutupi
KLT kinerja tinggi (HPTLC)
- diameter fase diam dg distribusi sempit (5-10 m)