Академический Документы
Профессиональный Документы
Культура Документы
(KCKT)
I. Tujuan Percobaan
Setelah melakukan percobaan ini, mahasiswa diharapkan dapat :
- Menjelaskan teori kromatografi cair kinerja tinggi
- Mengoperasikan alat kromatografi cair dengan baik dan benar
- Menganalisis suatu senyawa kimia baik secara kualitatif maupun kuantitatif dengan
menggunakan alat kromatografi cair tekanan tinggi
II. Alat dan Bahan yang digunakan
- Alat yang digunakan
Seperangkat alat Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
- Bahan yang digunakan
Larutan standar Cafein
Metanol
Aquabidest
III. Dasar Teori
HPLC (High Performance Liquid Chromatography) atau biasa juga disebut dengan
Kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) dikembangkan pada akhir tahun 1960-an dan awal
tahun 1970-an. Saat ini, HPLC merupakan teknik pemisahan yang diterima secara luas untuk
analisis bahan obat, baik dalam bulk atau dalam sediaan farmasetik.
SISTEM PERALATAN HPLC
Instrumentasi HPLC pada dasarnya terdiri atas: wadah fase gerak, pompa, alat untuk
memasukkan sampel (tempat injeksi), kolom, detektor, wadah penampung buangan fase
gerak, dan suatu komputer atau integrator atau perekam.
Diagram skematik sistem kromatografi cair seperti ini :
Wadah fase gerak harus bersih dan lembam (inert). Wadah pelarut kosong
ataupun labu laboratorium dapat digunakan sebagai wadah fase gerak. Wadah ini biasanya
dapat menampung fase gerak antara 1 sampai 2 liter pelarut.
Fase gerak atau eluen biasanya terdiri atas campuran pelarut yang dapat bercampur yang
secara keseluruhan berperan dalam daya elusi dan resolusi. Daya elusi dan resolusi ini
ditentukan oleh polaritas keseluruhan pelarut, polaritas fase diam, dan sifat komponenkomponen sampel. Untuk fase normal (fase diam lebih polar daripada fase gerak),
kemampuan elusi meningkat dengan meningkatnya polaritas pelarut. Sementara untuk fase
terbalik (fase diam kurang polar daripada fase gerak), kemampuan elusi menurun dengan
meningkatnya polaritas pelarut.
Fase gerak sebelum digunakan harus disaring terlebih dahulu untuk menghindari
partikel-partikel kecil ini. Selain itu, adanya gas dalam fase gerak juga harus dihilangkan,
sebab adanya gas akan berkumpul dengan komponen lain terutama di pompa dan detektor
sehingga akan mengacaukan analisis.
Elusi dapat dilakukan dengan cara isokratik (komposisi fase gerak tetap selama
elusi) atau dengan cara bergradien (komposisi fase gerak berubah-ubah selama elusi) yang
analog dengan pemrograman suhu pada kromatografi gas. Elusi bergradien digunakan
untuk meningkatkan resolusi campuran yang kompleks terutama jika sampel mempunyai
kisaran polaritas yang luas.
Fase gerak yang paling sering digunakan untuk pemisahan dengan fase terbalik
adalah campuran larutan bufer dengan metanol atau campuran air dengan asetonitril.
Untuk pemisahan dengan fase normal, fase gerak yang paling sering digunakan adalah
campuran pelarut-pelarut hidrokarbon dengan pelarut yang terklorisasi atau menggunakan
pelarut-pelarut jenis alkohol. Pemisahan dengan fase normal ini kurang umum dibanding
dengan fase terbalik.
2. Pompa
Pompa yang cocok digunakan untuk HPLC adalah pompa yang mempunyai
syarat sebagaimana syarat wadah pelarut yakni: pompa harus inert terhadap fase gerak.
Bahan yang umum dipakai untuk pompa adalah gelas, baja tahan karat, Teflon, dan batu
nilam. Pompa yang digunakan sebaiknya mampu memberikan tekanan sampai 5000 psi
dan mampu mengalirkan fase gerak dengan kecepatan alir 3 mL/menit. Untuk tujuan
preparatif, pompa yang digunakan harus mampu mengalirkan fase gerak dengan kecepatan
20 mL/menit.
Tujuan penggunaan pompa atau sistem penghantaran fase gerak adalah untuk
menjamin proses penghantaran fase gerak berlangsung secara tepat, reprodusibel, konstan,
dan bebas dari gangguan. Ada 2 jenis pompa dalam HPLC yaitu: pompa dengan tekanan
konstan, dan pompa dengan aliran fase gerak yang konstan. Tipe pompa dengan aliran fase
gerak yang konstan sejauh ini lebih umum dibandingkan dengan tipe pompa dengan
tekanan konstan.
3. Tempat penyuntikan sampel
Sampel-sampel cair dan larutan disuntikkan secara langsung ke dalam fase gerak
yang mengalir di bawah tekanan menuju kolom menggunakan alat penyuntik yang terbuat
dari tembaga tahan karat dan katup teflon yang dilengkapi dengan keluk sampel (sample
loop) internal atau eksternal.
JENIS HPLC
Pemisahan dengan HPLC dapat dilakukan dengan fase normal (jika fase diamnya
lebih polar dibanding dengan fase geraknya) atau fase terbalik (jika fase diamnya kurang non
polar dibanding dengan fase geraknya). Berdasarkan pada kedua pemisahan ini, sering
kali HPLC dikelompokkan menjadi HPLC fase normal dan HPLC fase terbalik.
Selain klasifikasi di atas, HPLC juga dapat dikelompokkan berdasarkan pada sifat fase diam
dan atau berdasarkan pada mekanisme sorpsi solut, dengan jenis-jenis HPLC sebagai berikut:
1. Kromatografi Adsorbsi
Prinsip kromatografi adsorpsi telah diketahui sebagaimana dalam kromatografi kolom
dan kromatografi lapis tipis. Pemisahan kromatografi adsorbsi biasanya menggunakan
fase normal dengan menggunakan fase diam silika gel dan alumina, meskipun
demikian sekitar 90% kromatografi ini memakai silika sebagai fase diamnya. Pada
silika dan alumina terdapat gugus hidroksi yang akan berinteraksi dengan solut.
Gugus silanol pada silika mempunyai reaktifitas yang berbeda, karenanya solut dapat
terikat secara kuat sehingga dapat menyebabkan puncak yang berekor.
2. Kromatografi fase terikat
Kebanyakan fase diam kromatografi ini adalah silika yang dimodifikasi secara
kimiawi atau fase terikat. Sejauh ini yang digunakan untuk memodifikasi silika adalah
hidrokarbon-hidrokarbon non-polar seperti dengan oktadesilsilana, oktasilana, atau
dengan fenil. Fase diam yang paling populer digunakan adalah oktadesilsilan (ODS
atau C18) dan kebanyakan pemisahannya adalah fase terbalik.
Sebagai fase gerak adalah campuran metanol atau asetonitril dengan air atau dengan
larutan bufer. Untuk solut yang bersifat asam lemah atau basa lemah, peranan pH
sangat krusial karena kalau pH fase gerak tidak diatur maka solut akan mengalami
ionisasi atau protonasi. Terbentuknya spesies yang terionisasi ini menyebabkan
ikatannya dengan fase diam menjadi lebih lemah dibanding jika solut dalam bentuk
spesies yang tidak terionisasi karenanya spesies yang mengalami ionisasi akan terelusi
lebih cepat.
3. Kromatografi penukar ion
KCKT penukar ion menggunakan fase diam yang dapat menukar kation atau anion
dengan suatu fase gerak. Ada banyak penukar ion yang beredar di pasaran, meskipun
demikian yang paling luas penggunaannya adalah polistiren resin.
Kebanyakan pemisahan kromatografi ion dilakukan dengan menggunakan media air
karena sifat ionisasinya. Dalam beberapa hal digunakan pelarut campuran misalnya
air-alkohol dan juga pelarut organik. Kromatografi penukar ion dengan fase gerak air,
retensi puncak dipengaruhi oleh kadar garam total atau kekuatan ionik serta oleh pH
fase gerak. Kenaikan kadar garam dalam fase gerak menurunkan retensi solut. Hal ini
disebabkan oleh penurunan kemampuan ion sampel bersaing dengan ion fase gerak
untuk gugus penukar ion pada resin.
4. Kromatografi Pasangan ion
Kromatografi pasangan ion juga dapat digunakan untuk pemisahan sampel-sampel
ionik dan mengatasi masalah-masalah yang melekat pada metode penukaran ion.
Sampel ionik ditutup dengan ion yang mempunyai muatan yang berlawanan.
Kromatografi Afinitas
Dalam kasus ini, pemisahan terjadi karena interaksi-interaksi biokimiawi yang sangat
spesifik. Fase diam mengandung gugus-gugus molekul yang hanya dapat menyerap
sampel jika ada kondisi-kondisi yang terkait dengan muatan dan sterik tertentu pada
sampel yang sesuai (sebagaimana dalam interaksi antara antigen dan antibodi).
Kromatografi jenis ini dapat digunakan untuk mengisolasi protein (enzim) dari
campuran yang sangat kompleks.
Asam-asam
kaboksilat;
asam-asam
lemak;asamasam fosfat
p-nitrobenzil-N,Ndiisopropilisourea
(PNBDI); 3,5dinitrobenzil-N,Ndiisopropilisourea
(DNBDI); p-bromofenasil
bromida (PBPB)
3,5-dinitrobenzil klorida
(DNBC); 4dimetilaminiazobenzen-4sulfinil (Dabsyl-Cl); 1naftilisosianat (NIC-1).
p-nitrobenziloksiamin
hidroklorida (PNBA); 3,5dinitrobenziloksiamin
hidroklorida (DNBA);
Alkohol
Aldehid;
keton
Amin
primer
Amin
primer (1o)
dan
sekunder
(2o)
Asam-asam
amino
(peptida)
3,5-dinitrobenzil klorida
(DNBC); N-suksinimidilp-nitrofenilasetat (SNPA);
N-suksinimidil-3,5dinitrofenilasetat
(SDNPA); 4dimetilaminiazobenzen-4sulfinil (Dabsyl-Cl); 1naftilisosianat (NIC-1).
4-dimetilaminiazobenzen4-sulfinil (Dabsil-Cl)
Dansil hidrazin
Fluoresamin
o-ftalaldehid (OPA)
7-kloro-4-nitrobenzo2-oksa-1,3-diazol
(NBD-Cl); 7-fluoro4-nitrobenzo-2-oksa1,3-diazol (NBD-F);
Dansil klorida
Fluoresamin
o-ftalaldehid (OPA)
7-kloro-4-nitrobenzo2-oksa-1,3-diazol
(NBD-Cl); 7-fluoro4-nitrobenzo-2-oksa1,3-diazol (NBD-F);
Derivatisasi ini dapat dilakukan sebelum analit memasuki kolom (pre-column derivatization)
atau setelah analit keluar dari kolom (post-column derivatization).
V. Analisa Data
Pada praktikum kali ini, kami melakukan praktikum kromatografi cair kinerja
tinggi. Pada kali ini larutan standar yang digunakan adalh kafein dengan konsentrasi
larutan sebanyak 15 ppm. Run time yang digunakan pada proses pengamatan adalah
selama 6 menit. Kromatografi cair kinerja tinggi adalah suatu metode pemisahan dari
analit berdasarkan perbedaan interaksi pada fasa diam dan fasa geraknya. Sehingga akan
didapatkan waktu retensi.
Pada praktikum kali ini, larutan yang menjadi fasa geraknya adalah methanol dan
aquabidest dengan perbandingan 60 : 40. Sedangkan waktu retensi yang didapat pada
percobaan adalah 4,933 ment. Yang menjadi kendala pada percobaan ini adalah alat
kromatografi cair kinerja tinggi tidak terdeteksi pada komputer sehingga harus dilakukan
restart berulang kali.
VI. Kesimpulan
Dari percobaan yang dilakukan dapat disimpulkan bahwa :
- Waktu retensi yang didapat pada konsentrasi cafein 15 ppm adalah pada menit ke4,933 menit
Daftar Pustaka
Tim Penyusun Laboratorium. Panduan Praktikum Kimia Analitik Instrumen. Kromatografi
cair kinerja tinggi.Politeknik Negeri Sriwijaya
https://arnisfarida.wordpress.com/tag/kromatografi-cair-kinerja-tinggi/
Diakses pada 10 Oktober 2015
http://lansida.blogspot.co.id/2010/07/hplc-kromatografi-cair-kinerja-tinggi.html
Diakses pada 10 Oktober 2015
LAPORAN TETAP
PRAKTIKUM KIMIA ANALITIK INSTRUMEN
KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI
Di Susun Oleh :
Kelompok 1
Ade Dwi Oktaviani
0614 3040 0288
Elvera Marliani
0614 3040 0292
Indah Nirmala Sari
0614 3040 0295
M.Faisal Juliansyah
0614 3040 0301
Rubik Makmuroh
0614 3040 0304
Surti
0614 3040 0308
A. Lutfi Fuadi
0614 3040 1219
Instruktur : Ir. Hj. Erwana Dewi, M.Eng
Gambar Alat