INMUNOHISTOQUMICA

Introduccin

Son

tcnicas

de

inmunotincin

que

permiten

demostrar los antgenos presentes en las clulas o los

tejidos utilizando anticuerpos marcados.

Esta se basa en la capacidad de los anticuerpos para

unirse

especficamente

los

correspondientes

antgenos y la reaccin se hace visible slo si el

anticuerpo est marcado con una sustancia que
absorbe o emite luz o produce coloracin.

En

la

actualidad

la

utilizacin

de

las

tcnicas

inmunohistoqumicas va dirigida a:
1. Determinar la estirpe o diferenciacin de una neoplasia
2. Determinar el pronstico de la neoplasia
3. Diferenciar procesos neoplsicos benignos de malignos
4. Determinar la arquitectura molecular de un tejido
5. Detectar agentes infecciosos en las clulas o tejidos

Fundamento

El principio se basa en que el anticuerpo primario (negro)

reconoce el antgeno celular buscado. Sobre ste se aplica
un anticuerpo secundario (verde) que amplifica la seal y,
finalmente,

una

sustancia

coloreable

(avidina,

estreptavidina, en rojo) que permite la visualizacin de la

seal en el microscopio ptico.

Utilidad

Diagnstico

clasificacin

de

tumores

malignos

indiferenciados.

Identificacin de agente infecciosos en tejidos (virus,

bacterias, hongos, parsitos.)

Clasificacin de leucemias y linfomas.

Determinacin del origen de tumores metsticos.

Bases conceptuales

Inmunohistoqumica es toda tcnica que permite detectar in

situ antgenos por medio de anticuerpos especficos (de ah

inmuno),

empleando

para

ello

sistemas

de

deteccin

enzimtico (por eso histoqumica).

Tres

factores

son

responsables

del

gran

avance

inmunohistoqumica:
1.

Disponibilidad de gran nmero de anticuerpos

2.

Desarrollo de tcnicas de recuperacin antignica

3.

Aparicin de sistemas de deteccin muy sensibles

de

la

Antgeno

En inmunohistquica denominamos antgeno a la sustancia

que queremos detectar en una seccin tisular o frotis
celular.

Un eptopo o determinante antignico es la parte del

antgeno que induce la respuesta inmune. La parte del

anticuerpo que reconoce al antgeno se denomina paratopo.

Las molculas de pequeo tamao (menos de 10KDa) son

incapaces de inducir una respuesta inmune y se denominan
haptenos. Para adquirir carcter inmunognico los haptenos
requieren su acoplamiento a una protena transportadora
grande.

Esquema que representa en rojo la secuencia de un

determinante
Antignico continuo (arriba) y de un discontinuo
(abajo).

Tiroides marcado con un anticuerpo

antiparathormona,
que muestra tincin inespecfica del coloide tiroideo
obtenida al emplear tiroglobulina como
protena transportadora (40x)

Anticuerpo

Los anticuerpos o inmunoglobulinas (Ig) son glicoprotenas en

forma de Y sintetizadas por las clulas plasmticas.

Las

Ig

estn

constituidas

por

dos

pares

de

cadenas

polipeptdicas idnticas: un par de cadenas ligeras (k, ) y un

par de cadenas pesadas (, , , , ) que determinan la clase

de Ig: IgA, IgG, IgD, IgE e IgM.

Molculas de Ig formada por cadenas pesadas y cadenas

ligeras unidas entre s por puentes disulfuro.

Molcula de Ig en la que se especifican los

extremos
carboxilo-amino y amino-terminal.

Molcula de Ig digerida por papana que da lugar a 3

fragmentos: un fragmento
Fc (fragmento cristalizable) y dos Fab (Fragmentos
antigen binding)

Molcula de Ig digerida por pepsina que da lugar a dos

fragmentos: Fc y F(ab)

Ag + Ac

AgAc

Complejo de la IgM formado por 5 molculas de

Ig unidas por su Fc a un anillo pentagonal central.

El anticuerpo primario se une por medio de sus

fragmentos Fab al antgeno,
siendo reconocido su fragmento Fc por un
anticuerpo secundario.

La unin entre el paratopo de un anticuerpo y el eptopo de

un antgeno se realiza por medio de enlaces no covalentes.

La unin es por tanto reversible, pudiendo disociarse durante los

lavados. Se trata de una reaccin de equilibrio expresada por:

Ag + Ac

AgAc

Tipos de anticuerpos:
Policlonales y Monoclonales.
Policlonales.
se

obtienen

por

extraccin

del

suero

de

un

animal

previamente inmunizado con el antgeno que se pretende

estudiar.

Obtencin de un anticuerpo policlonal.

La inyeccin de una protena extraa (Ag)
con diferentes epitopos da lugar a la sntesis
de Ig especficas para los mismos por parte
de las clulas plasmticas. El conjunto de esas
Ig constituyen un anticuerpo policlonal.

Ventajas

Una gran avidez por el antgeno.

Anticuerpo policlonal con diversos epitopos son

reconocidos por las correspondientes molculas Ig.

Una alta sensibilidad.

Reconocimiento de epitopos de un antgeno por

parte de un anticuerpo policlonal. Aunque uno de los
epitopos (azul) se altere, el antgeno ser rreconocido por
las Ig dirigidas contra los epitopos preservados.

Desventajas

Puede dar origen a reacciones cruzadas con otras

molculas.

Extraccin del suero del animal implica variaciones entre

diferentes

lotes,

con

el

consiguiente

problema

de

reproductibilidad.

El

mtodo

de

obtencin

tambin

implica

disponibilidad del anticuerpo sea limitada.

que

la

Monoclonales
Obtencin de anticuerpos monoclonales mediante la
tcnica de los hibridomas. Tras inmunizar al animal, se
fusionan clulas plasmticas procedentes del bazo con
clulas tumorales con el fin de obtener clulas hbridas que
sinteticen Ig especficas y que sean inmortales.

Una vez aislada la clula hibridada se proceder al cultivo de la misma,

comprobando la especificidad y afinidad del anticuerpo segregado por el
epitopo correspondiente.
Un anticuerpo idneo para immunoblotting no siempre funcionar bien en
inmunohistoqumica, y uno que funcione bien en cortes de congelacin no
tiene que necesariamente que hacerlo igual en cortes de parafina.

Ventajas

Especificidad, al reconocer el anticuerpo monoclonal un

nico epitopo.

Reproducibilidad,

ya

que

su

homogeneidad

intrnseca

impide que haya diferencias entre lotes.

Disponibilidad, puesto que la cantidad que puede obtenerse

de un anticuerpo monoclonal es prcticamente ilimitada.

Reconocimiento de epitopos lineales.

Desventajas

Menor sensibilidad que los anticuerpos policlonales, ya que

estos reconocen varios epitopos y los nonoclonales solo uno.

Posibilidad de obtencin de falsos negativo, ya que si el

epitopo reconocido se altera, podremos obtener un falso
negativo.

Menor estabilidad al pH y concentraciones salinas que los

anticuerpos policlonales.

Imposibilidad de eliminacin de reactividad cruzada en

caso de epitopos compartidos por dos o ms antgenos. En los
anticuerpos policlonales puede eliminarse mediante adsorcin
(cromatografa de afinidad).

Dilucin

Suelen presentarse liofilizados (generalmente 100 ul o 1 ml).

pH prximo al fisiolgico (7,0 7,2)

Contiene un preservante, generalmente azida sdica, que

evita el crecimiento bacteriano.

Un detergente que facilita la penetracin del anticuerpo y

disminuye la reactividad inespecfica.

Como regla general se expresa en 1ug/ml

La dilucin ptima de un anticuerpo ser aquella que proporcione la mxima
relacin seal/fondo, es decir, la mxima intensidad de tincin especfica y la
mnima tincin inespecfica.

Efecto prozona. Si concentramos excesivamente un

anticuerpo podemos obtener una disminucin de la seal o
un resultado negativo, debido a que la acumulacin de
molculas de Ig impide el acceso de las mismas a los
antgenos.

Campana de Gaus la zona 1 se debe al empleo del

anticuerpo demasiado diluido y la zona 2 se debe al empleo
del anticuerpo demasiado concentrado (efecto prozona)

Incubacin
La reaccin antgeno-anticuerpo tambin se ver influida por
el tiempo y la temperatura de incubacin.

En la tcnica manual es de 1 hora.

Los inmunoteidores automticos es entre 10-30 min.

La

temperatura

empleada

suele

ser

la

temperatura

ambiente (20-25C).

En casos de incubacin larga debe realizarse en cmara

hmeda.

Para acelerar la reaccin (alcanzar el equilibrio ms rpido)

y/o aumentar la seal pueden incubarse los anticuerpos a
37C.

Almacenamiento

Los anticuerpos mientras estn liofilizados no plantean

problema alguno de conservacin.

Los anticuerpos en forma lquida pueden almacenarse a

4C durante algunos meses o bien congelados (a -20C
o -80C) durante aos.

Los

anticuerpos

prediluidos

listos

para

usarse

se

almacenarse a 4C.

En el caso de anticuerpos congelados, deben evitarse los procesos

repetidos de congelacin-descongelacin del anticuerpo

Dividir el anticuerpo en alcuotas, de forma que

se descongele una nica alcuota de cada vez, la
cual ya no se vuelve a congelar.

Mezclar el anticuerpo con glicerol a partes

iguales. El glicerol es una sustancia inerte que
disminuye el punto de congelacin de forma
que tendremos en anticuerpo fro (a -20C),
pero no congelado, con lo que podemos usarlo
las veces que queramos sin necesidad de
alicuetarlo y sin que se altere.

Marcadores inmunohistoqumicos
MARCADORES

DE

ESTIRPE

EPITELIAL

CITOQUERIATINAS

Las citoqueratinas (CKs) constituyen el mayor grupo de

filamentos intermedios y son protenas filamentosas que,
junto con otros filamentos, forman el citoesqueleto de las
clulas eucariotas. Se clasifican numricamente del 1 al 20
segn su peso molecular (PM) y su punto isoelctrico.

Se distinguen dos grandes grupos de CKs: a) CKs de

epitelios simples (CK7, CK8, CK18, CK19, CK20); y b) CKs

de epitelios ms complejos, como el de la piel (CK5/6,
CK10, CK14, CK15).

MARCADORES DE DIFERENCIACIN MESENQUIMAL

VIMENTINA (V9)

La vimentina est presente prcticamente en todas las

clulas embrionarias y clulas mesenquimales. En la piel se
expresa en los melanocitos de la unin dermo-epidrmica,
fibroblastos, dendrocitos, vasos sanguneos y linfticos,
msculo liso de la dermis y los adipocitos de la hipodermis.

En oncologa, la expresin de vimentina se ha demostrado

en

todo

tipo

de

sarcomas,

melanomas,

carcinomas

fusocelulares y algunos no fusocelulares, mesoteliomas y

gliomas.

Citoesqueleto de filamentos

Fibroblastos y clulas endoteliales

MARCADORES DE DIFERENCIACIN MUSCULAR

DESMINA

La desmina es un filamento intermedio que se encuentra en

las clulas de origen muscular, ya sea esqueltico, cardaco
o liso, as como en fibroblastos submesoteliales se identifica
tanto tumores benignos (leiomiomas, rabdomiomas) como
malignos (leiomiosarcomas, rabdomiosarcomas).

MARCADORES DE DIFERENCIACIN
NEUROENDOCRINA - LA ENOLASA O HIDRATASA.

La enolasa o hidratasa de fosfopiruvato es una enzima que

cataliza

la

transformacin

de

2-fosfo-D-piruvato

fosfoenolpiruvato. Se expresa principalmente en neuronas,

clulas neuroendocrinas, clulas ganglionares del tracto
gastrointestinal y fibras nerviosas. Es positiva en tumores

gliales, neurales y neuroendocrinos (carcinoma microctico

de pulmn, tumor de Merkel, tumor de Wilms y tumor
carcinoide)

PRESERVACIN Y PROCESAMIENTO DE LAS

MUESTRAS
TIPOS DE MUESTRA
Muestras citolgicas

Cultivos celulares.

Frotis o extensiones.

Cytospins

Citologa monocapa en medio lquido

Bloques celulares

Muestras histolgicas

Estudio de rganos o tejidos tras:

Congelacin
Inclusin en parafina
Corte mediante vibratomo

FIJACIN

Consiste en la estabilizacin de las protenas tisulares

mediante la penetracin, a travs de la fase acuosa de las
clulas, de ciertos productos qumicos llamados fijadores.

Su objetivo es detener su metabolismo celular, inactivar las

enzimas

lisosmicas

eliminar

los

microorganismos,

conservando la morfologa celular lo ms parecida posible al

estado vivo.
Temperatura,
pH
Duracin
Tiempo transcurrido desde la extraccin del tejido
Tamao de la muestra

Fijadores reticulantes o aditivos.

Se trata de fijadores muy penetrantes que actan por

formacin

de

puentes

metilo

(CH=CH)

entre

los

aminocidos. La formacin de puentes se ve favorecida a

pH fisiolgico.

Es necesario emplear una cantidad de fijador abundante ya

que se va incorporando progresivamente al tejido.

Se recomienda emplear un volumen de fijador de al menos

4 veces mayor que el volumen de la muestra.

Hay fijadores reticulantes como por ejemplo: Formaldehdo

o aldehdo frmico y Paraformaldehdo

Ventajas de los fijadores reticulantes

Buena preservacin de la morfologa.

Penetracin rpida (24 48h)

Buenos estabilizantes de protenas.

Esterilizan las muestras.

Econmicos.

Inconvenientes de los fijadores reticulantes

El formol representa un riesgo para la salud ya que es

txico y carcingeno. Puede producir irritacin de ojos,
nariz, garganta y piel, bronquitis, alteraciones neurolgicas,

e incluso cncer de faringe, cavidad nasal y senos.

Alteracin del paraformaldehdo tras su dilucin, ya que no

contiene estabilizantes.

Fijadores precipitantes o coagulantes

Inducen la precipitacin o coagulacin de las protenas.

Etanol (CH3CH2OH)

Se emplea frecuentemente para citologas y cultivos celulares.

Metanol (CH3OH)

Permiten una fijacin molecularmente respetuosa.

Ventajas de los fijadores precipitantes

Buena preservacin de la antigenicidad.

Estabilidad.

Penetracin rpida.

No requieren el empleo de recuperacin antignica.

Carecen de los efectos txicos del formol.

Inconvenientes de los fijadores precipitantes.

Fijadores mediocres en cuanto a la preservacin morfolgica (retraccin celular).

Provocan un endurecimiento de las muestras (dificultad al corte).

Mezclas fijadoras.

Con el empleo de las mezclas se tratan de aunar las

ventajas de diferentes fijadores, compensando los puntos
dbiles de cada uno.

B5 (formaldehdo, cloruro de mercurio y acetato sdico) y

el Zenker son tiles para la fijacin de rganos linfoides y
hematopoyticos

por

la

excelente

morfologa

que

se

obtiene.

Paraformaldehido-glutaraldehdo, pequeas cantidades a

otros fijadores mejoran la preservacin tisular. Se emplea
en inmunocitoqumica ultraestructural.

Carnoy, fija bin los ncleos.

Metacarn, consigue una menor retraccin de los tejidos.

Protocolos de fijacin
Muestras citolgicas

En etanol de 96 durante un tiempo de 20 minutos a

temperatura ambiente.

Muestras histolgicas

La fijacin ideal para IHQ ser el que logre el mejor balance

entre una buena morfologa y una buena antigenicidad. La
fijacin histolgica se lleva a cabo en formol al 10%
(formaldehdo al 4%) durante 24 horas.

El formaldehdo en forma de metilenglicol penetra en el

tejido aproximadamente 1mm/h.

En muestras pequeas un mnimo de 6 h es suficiente.

A fin de estandarizar el procesamiento, se recomienda fijar

todo tipo de muestras durante 24 horas.

Si

acortamos

la

fijacin,

se

acaba

provocando

una

postfijacin.

Debe evitarse tambin la sobrefijacin de las muestras no

sobrepasando las 48 h, ya que de lo contrario se reducir la

antigenicidad al enmascarar los epitopos.

Linfoma en ganglio linftico. A) Con CD20 se tie bien

la periferia, pero no la zona central debido a una fijacin
inadecuada (4x). B) Con MIBI, sin embargo, se observa
tincin exclusiva de la zona central menos fijada (4x).

CONGELACIN

El frio provoca una detencin de todos los procesos

biolgicos y un endurecimiento de la pieza, la dureza en un
parmetro importante para la obtencin de cortes. Una
congelacin homognea constituye uno de los mejores
medios de preservacin de la morfologa celular.

Agentes criognicos

Nitrgeno lquido (-196C)

Isopentano

enfriado en nitrgeno lquido (-160C) o en

bao isotrmico (-50C).

Protocolos de congelacin

En

general

las

muestras

se

congelarn

sumergindolas

en

isopentano a -50C o a -160C durante 1 minuto. Para la mayora

de las muestras es suficiente la congelacin a -50C.

Una congelacin directa en nitrgeno lquido conlleva la formacin

de cristales de hielo con importante alteracin de la morfologa de
las fibras musculares.

Almacenamiento de las muestras

Las muestras congeladas son almacenadas hasta su utilizacin a

una temperatura de:

-196C (nitrgeno lquido)

-20C o 80C (congelador)

Seccin

Las muestras se cortan a 5 micras en un criostato y las secciones

se

recogen

en

portaobjetos

tratados

con

poli-L-lisina

aminopropiltrietoxisilano.

Las cargas electrostticas positivas resultantes en el portaobjeto

interactan con las cargas negativas de las protenas atrayndolas.

El pretratamiento de los portaobjetos asegura la adherencia del

corte,

evitando

su

desprendimiento

rotura

durante

su

recuperacin antignica y la incubacin en los diferentes pasos de

la tcnica de inmunohistoqumica.
Almacenamiento de los cortes

Los cortes pueden almacenarse congelados a -20C o -80C hasta

el momento de realizar la tcnica de inmunohistoqumica.

PROCESAMIENTO EN PARAFINA
Inclusin

La inclusin en parafina tiene por objetivo transformar el material biolgico

semilquido en otro slido, homogneo y duro, de esta forma es posible la
realizacin de cortes finos preservando la muestra.

Deshidratacin

Para conseguir una buena inclusin es necesaria una deshidratacin perfecta

de las piezas y la eliminacin de todo resto de alcohol. La deshidratacin se
realiza mediante baos de alcohol a concentraciones crecientes (el alcohol es
miscible en agua y la sustituye).

Aclaramiento

Se emplea un disolvente del medio de inclusin que a su vez se mezcle con

el alcohol. La parafina no es miscible con el alcohol por lo que este debe ser
reemplazado por un lquido intermediario tal como el xilol o sustitutivos.

Inclusin

El medio de inclusin ms comnmente utilizado es la parafina.

Seccin

Los bloques de parafina se cortan a 4 micras y las secciones

se recogen en portaobjetos tratados. Al recogerse las

secciones en el bao termosttico deben eliminarse todos

los pliegues, que podran ocasionar artefactos de tincin.

Las secciones se secan a 60C durante una hora o a 45C

durante toda la noche.

Los pliegues impiden la realizacin de lavados adecuados,

con retencin de cromgeno en los mismos (4x)

Desparafinado

Las preparaciones se desparafinan con xilol o sustitutivos (se

recomienda realizar 2 pasos de 5 min cada uno)

Hidratacin

La hidratacin se lleva a cabo con etanol de concentracin

decreciente (Realizamos pasos de 3 min en etanol de 100, 96 y
70).

Almacenamiento de los cortes

Si la tcnica no va a realizarse inmediatamente se omiten los dos

pasos

anteriores,

aunque

debe

tenerse

en

cuenta

que

el

almacenamiento de los cortes de parafina produce prdida de

antigenicidad por inestabilidad de los epitopos.

La prdida de antigenicidad se produce por fotooxidacin y

desecacin de los tejidos.

Amgdala
teida
con
K167/MIB-1.A)
Tras
almacenamiento del corte de parafina durante un mes a 20C antes de la realizacin de la tcnica se observa una
intensa inmunotincin (20x) B) En un corte seriado
mantenido a temperatura ambiente durante el mismo
tiempo, la intensidad es claramente menor (20x)

SECCIN MEDIANTE VIBRATOMO

Ventajas

No precisa deshidratacin ni inclusin en parafina.

No es necesario desparafinar ni rehidratar las secciones antes de la reaccin

inmunohistoqumica.

No se emplea altas temperaturas ni tratamientos qumicos agresivos que

puedan producir prdida de antigenicidad.

Menor nmero de artefactos.

Inconvenientes

Las secciones son delicadas y su manejo es ms difcil.

Las secciones son ms gruesas que las secciones de parafina lo que puede
dificultar la penetracin de los anticuerpos.

La adhesin de las secciones a los portaobjetos son laboriosas y se

dificultadas por su elevado grosor.

RECUPERACIN ANTIGNICA

La

fijacin

mediante

agentes

reticulantes

formaldehdo de enlaces de hidroximetileno,

como

el

puede hacer

que los epitopos queden enmascarados, es decir, que sean

inaccesibles a los anticuerpos.

Esquema en el que se observa que el epitopo

(circulo verde) de la protena (rojo) queda
enmascarado por una red de enlaces (azul),
impidiendo el acceso del anticuerpo.

Tras recuperacin antignica los

enlaces se rompen y el epitopo queda
accesible al anticuerpo

RECUPERACIN ENZIMTICA

La digestin enzimtica induce una rotura de enlaces cruzados que facilita

el acceso del anticuerpo primario al antgeno.
Los parmetros a tener en cuenta en la digestin enzimtica son:

Tipo de enzima, en donde esta est relacionada con el tipo de epitopo

a desenmascarar.

Concentracin de la enzima, va a depender de la enzima que se

emplee.

Temperatura, la temperatura suele ser a 37C, pero con algunas otras

enzimas pueden trabajarse a temperatura ambiente.

Tiempo de incubacin, de 5 a 30min.

El problema ms grave de esta tcnica es la sobredigestin del tejido,

ya que provoca una gran alteracin morfolgica.

RECUPERACIN TRMICA

La recuperacin trmica actuara mediante la rotura de

enlaces

cruzados

intramoleculares

intermoleculares

producidos por la fijacin con formol. La fijacin con formol

induce la formacin de puentes metilo o enlaces cruzados

entre el epitopo y protenas prximas, producindose una
interferencia esfrica.

MTODOS DE DETECCIN

La localizacin antgeno-anticuerpo a nivel tisular

exige la unin de anticuerpos a marcadores que
permitan su deteccin. Estos marcadores pueden ser
fluorescentes o enzimticos.

La

tcnica

de

visualizacin
microscopio

inmunofluorescencia

directa
de

del

permite

fluorocromo

fluorescencia,

mientras

en
que

la
un
la

inmunohistoqumica exige el revelado de la enzima

antes

de

su

convencional.

visualizacin

mediante

microscopa

MTODOS DE CONJUGACIN
Mtodo de conjugado directo

En este mtodo el marcador va

conjugado directamente al anticuerpo
primario.

Los inconvenientes de este mtodo son:

Necesidad de conjugacin de la enzima a cada anticuerpo primario,
lo que resulta complejo y costoso.
El anticuerpo primario debe ser empleado a una alta concentracin.

Mtodo conjugado indirecto

En este caso el marcador va conjugado a un anticuerpo

secundario

Las ventajas de este mtodo son las siguientes:

Simplificacin de la conjugacin, ya que solo hay conjugar un
anticuerpo (el secundario).
Versatilidad, ya que el anticuerpo conjugado puede emplearse
para detectar mltiples anticuerpos primarios

MTODO DEL PUENTE

El anticuerpo primario y el anticuerpo anti-peroxidasa

quedan unidos por un anticuerpo puente que reconoce el
fragmento Fc de ambos anticuerpos.

Las ventajas de este mtodo son:

Eliminacin del proceso de conjugacin con la enzima, ya que
esta se acopla por unin inmunolgica.
Incremento de la sensibilidad.

MTODO DEL COMPLEJO PEROXIDASA ANTIPEROXIDASA (PAP)

Se diferencia del mtodo puente en que la 3 capa consiste

en un complejo formado por anticuerpos anti-peroxidasa
que se une a 3 molculas de peroxidasa.

Ventajas:
Tamao pequeo, que no crea problemas para la unin de los
anticuerpos.
Fcil de obtener en forma purificada.
Enzima estable.
Amplio rango de cromgenos utilizables.

MTODO DE LA FOSFATASA ALCALINA ANTIFOSFATASA ALCALINA (APAAP)

Este mtodo es similar al mtodo del puente, pero en este caso la
peroxidasa es sustituido por la fosfatasa alcalina

Consta de un anticuerpo primario (verde), un anticuerpo

secundario de unin (rojo) y un anticuerpo anti-fosfatasa
alcalina (azul) que se une a 2 molculas de enzima (rosa, FA)

METODO DEL COMPLEJO AVIDINA-BIOTINA (ABC)

la unin entre avidina y biotina se realizada mediante enlaces
covalentes y representa una de las uniones qumicas ms

frecuentes que se conocen.

Unin avidina-biotina. La avidina (azul) tiene 4 puntos de

unin a la biotina (naranja)

Biotina conjugada. La biotina se une al anticuerpo por

medio de un brazo, que facilita la unin de mltiples
molculas de biotina. Por otra parte, la biotina puede
conjugarse con enzimas o fluorocromos.

El mtodo ABC consiste en tres etapas:

1. Anticuerpo primario.
2. Anticuerpo secundario biotinado.
3. Complejo avidina-biotina-enzima.

Mtodo ABC. En este mtodo el anticuerpo

primario (verde) es reconocido por un anticuerpo
secundario (rojo) que lleva acoplada molculas de
biotina (naranja). En esta tercera etapa se une al
complejo ABC constituido por una molcula de
avidina (azul) a la que se acoplan molculas de
biotina marcadas con peroxidasa (marrn, P).

MTODOS DE POLMEROS

Este mtodo se basa en el uso polmeros a los que se unen

molculas de anticuerpos y enzimas, de esta forma se evita
el

empleo

de

la

biotina,

mantenindose,

incluso

aumentando, la sensibilidad de la tcnica.

Mtodo EPOS

Este mtodo consta de nica etapa. Al antgeno se une un

complejo constituido por el anticuerpo primario (verde), un
polmero (azul) que sirve de andamiaje y la peroxidasa
(marrn).

Mtodo En Vision

Este mtodo consta de dos etapas. En la primera el antgeno

es reconocido por el anticuerpo primario (verde). En la
segunda en anticuerpo primario es reconocido por el
anticuerpo secundario anti-especie (rojo) que va unido al
polmero de dextrano (azul), que a su vez lleva conjugados
molculas de peroxidasa (marrn).

Mtodo PowerVision

En este mtodo al anticuerpo secundario se unen reactivos

multifuncionales que polimerizan linealmente con la
peroxidasa a modo de rascacielos