Strategije kloniranja gena (kloniranje utemeljeno na stanicama i PCR pristup)

Dva glavna pristupa:

1. Kloniranje utemeljeno na stanicama:
- Podijeliti poetnu DNA u odsjeke i klonirati sve
- Takva zbirka klonova koja predstavlja cijelu poetnu populaciju naziva se
knjinica (biblioteka, engl. library)
- Zatim moramo pretraiti knjinicu da bismo identificirali na klon od interesa
koristei postupak koji razlikuje eljeni klon od svih drugih
2. PCR pristup
- Selektivno umnaanje ciljnog slijeda iz poetne DNA; dakle korak
pretraivanja je ugraen u prvi dio postupka, tako da se kloniraju samo odabrani
fragmenti

GENOMSKA DNA, GENOMSKI KLON, GENOMSKA KNJINICA

Genomska DNA, genomski klon, genomska knjinica Genomska DNA je sva

DNA nekog organizma.
Genomski klon je odsjeak genomske DNA u nekom vektoru ili odabrana
stanica domaina koja sadri odsjeak genomske DNA u nekom vektoru.
Genomska knjinica cjelovita je zbirka genomskih klonova koji zajedno sadr
sve sljedove DNA u genomu nekog organizma.

STVARANJE GENOMSKE KNJINICE (IZ LEHN.)

Prvi korak pri stvaranju genomske knjinice je cijepanje DNA restrikscijskim
endonukleazama, tako da se dobiju sekvence u fragmentima raznih veliina
( moraju naravno biti kompatibilni s klonirajuim vektorom ). Fragmenti koji su
preveliki ili premali za kloniranje uklone se centrifugiranjem ili elektroforezom.
Klonirajui vektor poput BAC ili YAC plazmida, se pocijepa s istim restrikcijskim
endonukleazama i slijepi s fragmentom genomske DNA. Ta smjesa se zatim
transformira u stanice kvasca ili bakterije kako bi nastala knjinica tipova stanica,
svaki tip da ima razliitu rekombinantnu DNA molekulu. Svaka transformirana
stanica (ili kvasac) naraste u koloniju. Zatim se koriste metode hibridizacije...

cDNA, KLON cDNA, KNJINICA cDNA

cDNA je DNA nastala kopiranjem (reverznom transkripcijom) mRNA, prvi lanac
cDNA je komplementaran mRNA.
Klon cDNA je odsjeak cDNA u nekom vektoru ili odabrana stanica domaina koja
sadri odsjeak cDNA u nekom vektoru.

Knjinica cDNA je cjelovita zbirka klonova cDNA jednog tipa stanice.

STVARANJE cDNA KNJINICE
- transkripcija genomske DNA, dobijemo RNA transkirpt, nakon toga ide RNA
splicing i dobijemo mRNA ( splicing je modifikacije pre-mRNA transkripta u kojem
se miu introni i spajaju eksoni ), nakon toga se reverznom transkriptazom dobije
cDNA te se klonira..
NAINI SINTEZE PRVOG, DRUGOG LANCA cDNA
Za sintezu prvog lanca cDNA koristi se reverzna transkriptaza (RNA-ovisna DNApolimeraza), enzim koji kao kalup koristi RNA i na tom RNA-kalupu stvara
komplementarnu DNA, tj. cDNA.
Kao poetnice za reverznu transkripciju mogu se koristiti:
- nasumini heksameri
- oligonukleotid oligo(dT) - jer veina eukariotskih mRNA ima poliA rep na 3' -kraju
- poetnica koja je specifina za odreeni gen
Za sintezu drugog lanca:
(Za dobivanje knjinica cDNA najee se kao poetnice koriste nasumini
heksameri ili oligo(dT) za sintezu prvog lanca cDNA jer omoguuju reverznu
transkripciju RNA, a da nije poznat nukleotidni
slijed RNA)
U sintezi drugog lanca se koristi DNA-polimeraza, a kao poetnice:
- savijeni 3'-kraj prvog lanca cDNA koji slui kao poetnica
- RNA-fragmenti nastali razgradnjom RNA-kalupa s RNazom H
- nasumini heksameri
- dodavanje oligonukleotidne poveznice poznatog slijeda
na 3'-kraj prvog lanca cDNA; kao poetnica za sintezu drugog
lanca koristi se oligonukleotid komplementaran poveznici

PRIMJERI: koristi se oligodT, za drugi lanac nasumini heksamer.

ili oligodT za prvi lanac, pa se doda terminalna transferaza i dCTP-ovi (onda doda
oligo dC na 3' kraj) prvog lanca cDNA tak da za drugi koristimo oligo dG za
poetnicu i DNA plimerazu.