OQGP G17 C0501 (799)

LA 1 Screening Reagent / LA 2 Confirmation Reagent

LA 1 [REAGENT] / LA 2 [REAGENT]
Simplified Dilute Russells Viper Venom Test (DRVVT) for detection of Lupus
Anticoagulants

Intended Use

LA 1 Screening Reagent and LA 2 Confirmation Reagent are simplified DRVVT reagents for detec
tion of Lupus Anticoagulants (LA) in one-stage clotting tests.
LA 1 Screening Reagent
Simplified DRVV reagent to screen for the presence of Lupus Anticoagulants.
LA 2 Confirmation Reagent
Phospholipid-rich DRVV reagent for the specific correction of Lupus Anticoagulants.

Summary and Explanation

LAs are autoantibodies against negatively charged phospholipids or complexes of phospholipids

with either beta-2-glycoprotein 1 or clotting factors such as prothrombin. They occur in various
clinical conditions, especially autoimmune diseases1 and are now considered to be a significant
risk factor in patients with otherwise unexplained thrombosis and are often present in women who
have recurrent fetal loss5. LA have traditionally been detected using phospholipid responsive clot
ting tests, such as the activated partial thromboplastin time (APTT), kaolin clotting time (KCT) and
DRVVT2 where they have an anticoagulant effect.
The DRVV time first became popular following the publication by Thiagarajan et al. in 19866. This
method has been standardized and simplified7. According to Petri8 et al., thrombosis in SLE patients
is more closely linked with LA detectable by DRVVT than with anticardiolipin antibodies detected
by enzyme linked immunosorbent assays (ELISA)5. This observation was recently extended by
Galli and Bevers9 who showed that the LA subtype with most effect on DRVVT tests is beta2-glycoprotein 1 dependent and different to the prothrombin-requiring LA subtype having more
prolonging effect on KCT tests.

Quality Control
Each laboratory should determine its own acceptable control values and normal range.
LA Control High ([REF] OQWD) and LA Control Low ([REF] OQWE) are distributed by Siemens for
use in quality control of LA 1 Screening Reagent and LA 2 Confirmation Reagent assays. Quality
control plasma must be tested at the same time as patient samples.

Results

If the LA 1 Screening Reagent clotting time is within the normal range, no further testing for LA
may be necessary. If the LA 1 Screening Reagent clotting time result is more than 2 SD longer
than the mean of normal plasma (ideally n 20), the result should be considered abnormal and
investigated further. (See figure 1)
The final result is best expressed as a ratio of the clotting times of LA 1 Screening Reagent divided
by LA 2 Confirmation Reagent.

LA 1 Screening Reagent clotting time
LA Ratio =
LA
2 Confirmation Reagent clotting time

Figure 1

Test Principle

1. Russells viper venom present in LA 1 Screening Reagent initiate plasma clotting by directly
activating factor X. LA antibodies prolong the LA 1 Screening Reagent clotting time.
2. LA 2 Confirmation Reagent is similar to LA 1 Screening Reagent but contains a high phospholi
pid concentration. The extra phospholipid counteracts the LA antibody and largely corrects the
clot time3.
3. DRVV test bypass factor VII of the extrinsic pathway and the contact and antihemophilic fac
tors of the intrinsic pathway. Therefore LA 1 Screening Reagent is more specific for LA than
APTTs as they are not affected by contact factor abnormalities or by factor VIII deficiencies or
antibodies6. There have been a number of tests developed based on phospholipid correction4
however none have been as convenient to use as LA 2 Confirmation Reagent subsequent to LA 1
Screening Reagent.
4. Mixing tests may be useful to exclude factor II, V and X deficiencies, which may prolong LA 1
Screening Reagent and LA 2 Confirmation Reagent results. Mixing normal plasma with test
plasma replenishes any factors deficient in the test plasma. If the mixing test is still prolonged,
it indicates that an inhibitor (such as LA) is present in the test plasma. A circulating inhibitor
is usually indicated by a prolonged clotting time result that is not corrected by mixing patient
plasma with normal plasma3,10.

Reagent
Composition
LA 1 Screening Reagent and LA 2 Confirmation Reagent contain Russells viper venom, phospholi
pids, antiheparin agents, calcium, buffers, stabilizers, sodium azide and dyes.
Warnings and precautions
For in-vitro diagnostic use only.
When disposing of azide, always flush with large volumes of water to avoid the possibility of an
explosive residue forming in metal plumbing.

Mixing tests
If results are borderline, mixing studies may be used to correct for hidden defects in the sample
and clarify the presence of LA. These tests should be carried out on a 50:50 mixture of test plasma
and normal plasma (Siemens Control Plasma N should not be used for mixing studies) using the
standard test procedure.
TABLE 1: Combination of mixing and confirmatory tests
LA 1

LA 2

Diagnosis

Patient Plasma

Preparation for use

Reconstitute with the volume of distilled water stated on the vial. Mix well by inversion to ensure
complete re-suspension of the lyophilized material.

MixPatient + Normal

Patient Plasma MixPatient + Normal

LA not detected

ABN

ABN

LA present

Storage instructions
The lyophilized reagents are stable at least until the expiry date stated on the vial label when stored
at +2 to +8 C.
Following reconstitution reagents can be stored for 8 hours at +37 C, 24 hours at +20 to +25 C,
48 hrs at +2 to +8 C and 1 month at -20 C.

ABN

ABN

Factor deficient/OAT

ABN

ABN

ABN

LA + Factor deficient

ABN

ABN

ABN

ABN

Other inhibitor

Indications of instability / deterioration

If there is no evidence of vacuum when the vial is opened and/or the reagent does not appear dry
it should be returned to Siemens Healthcare Diagnostics.

Calculating a normalized ratio may be useful to correct for differences in instrument/reagent com
binations. Normalization uses the mean clot times of normal plasma tested with LA 1 Screening
Reagent and LA 2 Confirmation Reagent in the users own laboratory. This may improve discrimina
tion between normal and low positive LA samples.

Specimen Collection and Preparation

patient LA 1 Screening Reagent mean normal LA 2 Confirmation Reagent
Normalized Ratio = x
mean normal LA 1 Screening Reagent
patient LA 2 Confirmation Reagent

The flow chart in figure 1 can also be used to interpret normalized ratios.

Collect and process blood in accordance with NCCLS Standard H21-A3: Collection, Transport and
Processing of Blood Specimens for Coagulation Testing and General Performance of Coagulation
Assays; Approved Guideline - 3rd Edition (1998). Separated plasma should be stored at +2 to +8 C
and tested within 4 hours of collection.
If the samples are to be frozen before testing, the plasma must double spun to remove platelets
(to below 10 x 109/L)10 prior to freezing as these can shorten the LA 1 Screening Reagent clotting
time.

Test Procedure

1. Pre-warm a slight excess of LA 1 Screening Reagent or LA 2 Confirmation Reagent at 37 1 C

in a reagent reservoir, allowing for 200 L per test.
2. Dispense 200 L of test plasma into a glass test tube and warm for 1 minute at +37 C.
3. Add 200 L of pre-warmed reagent to the plasma and time from the moment of reagent addition
to a clotting end point.
4. Repeat for duplicate test values and report the average of these as the result.
Automated method
Protocols for Siemens analyzers are available on request.
LA 1 Screening Reagent and LA 2 Confirmation Reagent tests should be carried out using equal
volumes of test plasma and reagent as in most thrombin time protocols. However, observation or
acquisition times should be extended to 120 seconds.
Materials provided
LA 1 [REAGENT], [REF] OQGP with
10 x l 2 mL LA 1 [REAGENT], LA 1 Screening Reagent
LA 2 [REAGENT], [REF] OQGR with
10 x l 1 mL LA 2 [REAGENT], LA 2 Confirmation Reagent
Materials required but not provided
10 mm x 75 mm glass test tubes
Pipette to deliver 200 L, 1 mL, 2 mL or 5 mL
Water bath, stop watch
Purified water, USP or equivalent
LA Control High ([REF] OQWD)
LA Control Low ([REF] OQWE)
OQGP G17 C0501 (799)

Limitations of the Procedure

Samples containing clots and those with abnormal hematocrits should be discarded. Jaundiced,
lipemic and hemolysed specimens should be tested by manual techniques as some photo-electric
instruments give false results.
Commercially available normal quality control plasmas with unspecified levels of citrate and plate
lets are not recommended for use in mixing studies.
For comparative studies LA 1 Screening Reagent and LA 2 Confirmation Reagent tests should be
performed at the same time.
At least 2 screening tests based on different assay principles should be performed. Additionally a
mixing study for the verification of the presence of a coagulation inhibitor and a confirmation test for
the documentation of phospholipid dependency should be performed10.
Heparin levels up to 1 unit/mL have no effect due to the presence of a neutralizing agent in both LA 1
Screening Reagent and LA 2 Confirmation Reagent.
Results of this test should always be interpreted in conjunction with the patients medical history,
clinical presentation and other findings.

Expected Values

Normal ranges for LA 1 Screening Reagent of 31 - 44 seconds and for LA 2 Confirmation Reagent
of 30 - 38 seconds were obtained using a manual tilt-tube method with samples collected from 26
healthy individuals aged 18 to 55 years. The ratio of LA 1 / LA 2 was in the range 0.8 - 1.2. These
results should be used as a guide only.

LA 1 Screening
If ratio is greater than 2.0, LA is strongly present,

LA 2 Confirm

LA 1 Screening
If ratio is between 1.5 and 2.0, LA is moderately present,

LA 2 Confirm

LA 1 Screening
If ratio is between 1.2 and 1.5, LA is weakly present,

LA 2 Confirm
Each laboratory should determine its own normal range for both manual and automated methods
to overcome differences in sample collection and instrumentation.

Specific Performance Characteristics

Intra-laboratory and inter-laboratory precision studies were performed using both manual tilt-tube
and automated methods. These studies gave coefficient of variation less than 3.5 % on normal
plasmas and less than 5 % for abnormal samples.
Specificity Studies were performed on known plasma samples.
A positive ratio for LA 1 Screening Reagent/LA 2 Confirmation Reagent of greater than 1.2 was
found in known*:
LA plasma-
90 % (26/29)
Heparinized plasma-
12 % (1/8)
OAT patient plasma-
0 % (0/7)
Factor deficient plasma- 0 % (0/5)
Normal plasma-
2 % (1/60)
* N.B. known LA identification with APTT + KCT mixing studies.

Bibliography

1. Feinstein DI. Lupus anticoagulant, thrombosis and fetal loss. N. Eng.J.Med. 1985, 313, 13481350
2. Triplett DA, Brandt JT. Laboratory identification of the lupus anticoagulant. Br.J. Haematol.
1991, 73, 139-142
3. Exner T, Triplett DA, Taberner D, Machin SJ. Guidelines for testing and revised criteria for lupus
anticoagulants. Thromb. Haemostas. 1991, 65, 320-322
4. Rauch J, Tannenbaum M, Janoff AS. Distinguishing plasma lupus anticoagulants from antifactor
antibodies using hexagonal phase II phospholipids. Thromb. Haemostas. 1989, 62, 892-896
5. Love PE, Santoro SA. Antiphospholipid antibodies: Anticardiolipin and the lupus anticoagulant
in systemic lupus erythematosis (SLE) and in non-SLE disorders. Ann. Intern. Med. 1990, 112,
682-698
6. Thiagarajan P, Pengo V, Shapiro SS. The use of the dilute Russells viper venom time for the
diagnosis of lupus anticoagulants. Blood 986, 68, 869-874
7. Exner T, Papadopoulos G, Koutts J Use of a simplified dilute Russells viper venom time (DRV
VT) confirms heterogeneity among lupus anticoagulants. Blood Coag. Fibrinol. 1990, 1, 259266
8. Petri M., Rheinschmidt.M. et al. The frequency of lupus anticoagulant in systemic lupus ery
thematosus. Ann. Int. Med. 1987, 106, 524-531
9. Galli M., Finazzi G, Bevers EM, Barbui T. Kaolin clotting time and dilute Russels viper venom
time distinguish between prothrombin dependent and beta-2-glycoprotein 1 dependent an
tiphospholipid antibodies. Blood. 1995, 86, 617-623
10. Brandt JT, Triplett DA, Alving B, Scharrer I, Criteria for the Diagnosis of Lupus Anticoagulants:
An Update. Thromb. Haemostas. 1995, 74 (4), 1185-90

Edition October 2008

Screening-Reagenz LA 1 /
Besttigungsreagenz LA 2
LA 1 [REAGENT] /
LA 2 [REAGENT]
Vereinfachtes Dilute Russells Viper Venom Time (DRVVT, Schlangengiftaktivator)Reagenz zum Nachweis von Lupus Anticoagulans

Anwendungsbereich

Screening-Reagenz LA 1 und Besttigungsreagenz LA 2 sind vereinfachte DRVVT-Reagenzien

zum Nachweis von Lupus Anticoagulans (LA) in einstufigen Gerinnungstests.
Screening-Reagenz LA 1
Vereinfachtes DRVV-Reagenz zum Screening auf Lupus Anticoagulans.
Besttigungsreagenz LA 2
Phospholipidreiches DRVV-Reagenz fr die spezifische Korrektur von Lupus Anticoagulans.

Diagnostische Bedeutung

Bei Lupus Anticoagulans (LA) handelt es sich um Auto-Antikrper gegen negativ geladene Phos
pholipide oder Komplexe von Phospholipiden mit entweder Beta-2-Glykoprotein 1 oder Gerinnungs
faktoren wie Prothrombin. Sie treten bei verschiedenen klinischen Zustnden, insbesondere jedoch
bei Autoimmunerkrankungen auf1. Darber hinaus wird LA heute als signifikanter Risikofaktor fr
Patienten mit anderweitig nicht zu erklrenden Thrombosen angesehen und ist hufig bei Frauen
mit wiederholten Fehlgeburten nachzuweisen5. LA wird blicherweise mit phospholipid-empfind
lichen Gerinnungstests wie APTT (activated partial thromboplastin time), KCT (kaolin clotting time),
und DRVVT2 nachgewiesen, bei denen es gerinnungshemmend wirkt.
Die DRVV-Zeit begann sich nach der Publikation von Thiagarajan et al. im Jahre 1986 durchzuset
zen6. Diese Methode wurde vereinfacht und standardisiert7. Nach Petri8 et al. ist bei ThrombosePatienten mit systemischem Lupus erythematodes die Wahrscheinlichkeit hher, LA mit DRVVT
nachzuweisen mit einem Enzymimmunoassay (ELISA)5 fr Antikardiolipin-Antikrper . Diese
Beobachtung wurde krzlich durch Galli und Bevers9 erweitert, die gezeigt haben, dass der LASubtypus mit der grten Wirkung auf DRVVT-Tests auf Beta-2-Glykoprotein 1 angewiesen ist
und sich vom Prothrombin-abhngigen LA-Subtypus unterscheidet, der sich eher verlngernd auf
KCT-Tests auswirkt.

Reagenzien
Zusammensetzung
Screening-Reagenz LA 1 und Besttigungsreagenz LA 2 enthalten das Gift der Russell Viper,
Phospholipide, Antiheparin-Wirkstoffe, Calcium, Pufferlsung, Stabilisatoren, Natriumazid und Farb
stoffe.
Warnungen und Vorsichtsmanahmen
Nur zur in-vitro diagnostischen Anwendung.
Bei Entsorgung ins Abwasser mit viel Wasser nachsplen, um die Bildung explosiver Stoffe in
Metall-Abflussrohren zu verhindern.
Vorbereitung der Reagenzien
Den Inhalt des Flschchens mit der auf dem Etikett angegebenen Menge destilliertem Wasser
auflsen. Den Inhalt durch Umschtteln sorgfltig mischen, um vollstndige Resuspendierung des
lyophilisierten Materials zu gewhrleisten.
Haltbarkeit und Lagerungsbedingungen
Wenn die gefriergetrockneten Reagenzien bei +2 bis +8 C aufbewahrt werden, sind sie mindes
tens bis zu dem auf dem Flaschenetikett aufgedruckten Datum haltbar.
Nach Rekonstitution knnen die Reagenzien bei +37 C 8 Stunden, bei +20 bis +25 C 24 Stunden,
bei +2 bis +8 C 48 Stunden und bei -20 C einen Monat lang gelagert werden.
Anzeichen fr Instabilitt und Verfall
Wenn beim ffnen des Flschchens keine deutlichen Anzeichen von Vakuum festzustellen sind
und/oder wenn das Reagenz nicht trocken wirkt, sollte dieses an Siemens Healthcare Diagnostics
zurckgesendet werden.

Probenabnahme und -vorbereitung

Das Blut ist gem dem NCCLS-Standard H21-A3 ber Abnahme, Transport und Verarbeitung von
Blutproben fr Gerinnungstests und die Allgemeine Durchfhrung von Gerinnungsassays - aner
kannte Richtlinie - 3.Ausgabe (1998), abzunehmen und zu verarbeiten. Abgetrenntes Plasma ist bei
+2 bis +8 C zu lagern und innerhalb von 4 Stunden nach Entnahme zur Testung einzusetzen.
Wenn die Proben vor der Austestung eingefroren werden sollen, muss das Plasma vor dem Einfrie
ren zweimal zentrifugiert werden, um Blutplttchen (auf weniger als 10 x 109/l)10 zu entfernen, denn
diese knnen sonst die Gerinnungszeit des Screening Reagenz LA 1 verkrzen.

Testdurchfhrung

1. In einem Reagenzglas, das mindestens 200 l pro Test aufnehmen kann, etwas mehr als die
bentigte Menge Screening-Reagenz LA 1 und/oder Besttigungsreagenz LA 2 bei +37 C 1 C
vorwrmen.
2. 200 l Patientenplasma in ein Glasgef geben und 1 Minute bei +37 C inkubieren.
3. 200 l vorgewrmtes Screening-Reagenz LA 1 oder Besttigungsreagenz LA 2 zum Plasma
geben und die Zeit von der Zugabe des Reagenzes bis zum Abschluss der Gerinnungsreaktion
messen.
4. Test fr Doppelbestimmung wiederholen und Mittelwert der Testresultate bilden.
Automatisierte Methode
Testvorschriften fr Siemens-Analysatoren stehen auf Anfrage zur Verfgung.
Die Tests mit Screening-Reagenz LA 1 und Besttigungsreagenz LA 2 sollten, wie auch in den
meisten Thrombin-Zeit-Protokollen, unter Verwendung gleicher Volumina an Testplasma und Reagenz ausgefhrt werden. Die Messwertaufnahme- bzw. Auswertezeit sollte jedoch auf 120 Sekun
den ausgedehnt werden.
Inhalt der Handelspackung
LA 1 [REAGENT], [REF] OQGP mit
10 x l 2 ml LA 1 [REAGENT], Screening-Reagenz LA 1
LA 2 [REAGENT], [REF] OQGR mit
10 x l 1 ml LA 2 [REAGENT], Besttigungsreagenz LA 2
Zustzlich bentigte Materialien
10 mm x 75 mm Reagenzgefe,
Pipette fr 200 l, 1 ml, 2 ml oder 5 ml
Wasserbad, Stoppuhr
destilliertes Wasser (USP oder vergleichbare Reinheit)
LA Kontrolle Hoch ([REF] OQWD)
LA Kontrolle Niedrig ([REF] OQWE)
Qualittskontrolle
Jedes Labor sollte seine eigenen Vertrauensbereiche der Kontrollen und einen Normalbereich
festlegen.
LA Kontrolle Hoch ([REF] OQWD) und LA Kontrolle Niedrig ([REF] OQWE) werden von Siemens zur
Qualittskontrolle von Screening-Reagenz LA 1 und Besttigungsreagenz LA 2 geliefert. Die Bestim
mungen der Kontrollplasmen und Patientenproben mssen gleichzeitig durchgefhrt werden.

Ergebnisse

Wenn die LA 1-Gerinnungszeit im Normalbereich liegt, ist mglicherweise keine weitere Testung
auf LA notwendig. Wenn die LA 1-Gerinnungszeit ber 2 SD oder etwa 20 % lnger als der Mittelwert des Normalplasmas (idealerweise n 20) ist, sollte das Ergebnis als nicht normal betrachtet
werden und weiter untersucht werden (siehe Abbildung 1).
Das Endergebnis lsst sich am besten als Verhltnis (Ratio) zwischen der Gerinnungszeit des
Screening-Reagenz LA 1 und der Gerinnungszeit des Besttigungsreagenz LA 2 ausdrcken.

LA Ratio =

Gerinnungszeit Screening-Reagenz LA 1

Gerinnungszeit Besttigungsreagenz LA 2

Abbildung 1

Prinzip der Methode

1. Das im Screening-Reagenz LA 1 enthaltene Gift der Russel Viper lst die Plasmagerinnung
durch direkte Aktivierung des Faktor X aus. Die LA-Antikrper verlngern die Gerinnungszeit
des Screening-Reagenz LA 1.
2. Das Besttigungsreagenz LA 2 hnelt dem Screening-Reagenz LA1, enthlt aber eine hhere
Konzentration an Phospholipiden. Diese zustzlichen Phospholipide wirken dem LA-Antikrper
entgegen und korrigieren so weitestgehend die Gerinnungszeit3.
3. Der DRVVT-Test umgeht Faktor VII des extrinsischen Systems der Blutgerinnung sowie die
Kontakt- und antihmophilen Faktoren des intrinsischen Systems. Deshalb ist das ScreeningReagenz LA 1 fr den spezifischen Nachweis von LA besser geeignet als APTT-Tests, denn
es wird weder durch Kontaktfaktor-Anomalien noch durch einen Faktor-VIII-Mangel oder An
tikrper beeinflusst6. Es wurden eine Reihe von Tests auf Basis der Phospholipid-Korrektur4
entwickelt, es hat sich allerdings keiner als annhernd so geeignet erwiesen, wie der Einsatz
des Besttigungs-Reagenz LA 2 im Anschluss an das Screening-Reagenz LA 1.
4. Um einen Mangel an den Faktoren II, V und X auszuschlieen, der das Testergebnis mit dem
Screening-Reagenz LA 1 und dem Besttigungsreagenz LA 2 verlngern wrde, knnen auch
Plasmatauschversuche ntzlich sein. Durch Mischen von normalem Plasma mit Testplasma wer
den die im Testplasma fehlenden Faktoren wieder zugefhrt. Wenn der Plasmatauschversuch
noch immer zu verlngerten Testzeiten fhrt, ist dies ein Hinweis darauf, dass sich im Testplas
ma ein Inhibitor (wie LA) befindet. Normalerweise weist eine verlngerte Gerinnungszeit, die
auch durch Mischen von Patientenplasma mit normalem Plasma nicht korrigiert wird, auf einen
zirkulierenden Inhibitor hin3, 10.

OQGP G17 C0501 (799)

Plasmatauschversuch
Um versteckte Fehlergebisse der Probe zu korrigieren und um die Prsenz von LA zu klren,
knnen bei grenzwertigen Ergebnissen Plasmatauschversuche durchgefhrt werden. Bei diesen
Tests, die wie der normale Standardtest durchzufhren sind, sollte das Verhltnis zwischen der
Plasmaprobe und dem normalen Plasma 50:50 betragen (fr Plasmatauschversuche sollte nicht
Siemens Control Plasma N verwendet werden).
Tabelle 1: Kombination von Plasmatauschversuchen und Besttigungstests
LA 1

LA 2

Diagnose

Patienten
plasma

Mischung
Patient + Normal

Patienten
plasma

Mischung
Patient + Normal

Kein Nachweis
von LA

ABN

ABN

Nachweis von LA

ABN

ABN

Faktormangel/OAT

ABN

ABN

ABN

LA + Faktormangel

ABN

ABN

ABN

ABN

Sonstiger Inhibitor

Zum Ausgleich der Abweichungen bei verschiedenen Kombinationen von Reagenzien bzw. Ger
ten kann die Berechnung einer normalisierten Verhltniszahl sinnvoll sein. Bei der Normalisierung
werden die mittleren Gerinnungszeiten des im Labor des Anwenders mit Screening-Reagenz LA 1
und Besttigungsreagenz LA 2 getesteten Normalplasmas verwendet. Das kann die Unterschei
dung zwischen normalen und schwach positiven LA-Proben erleichtern.

Screening-Reagenz LA 1 Patient mittlere Normalzeit Besttigungsreagenz LA2
Normalisierte Ratio = x
mittlere Normalzeit Screening Reagenz LA 1
Besttigungsreagenz LA 2 Patient

Zur Interpretation normalisierter Verhltniszahlen kann das Flussdiagramm in Abbildung 1 eben
falls herangezogen werden.

Einschrnkungen der Testdurchfhrung

Proben mit bereits vorhandenen Gerinnseln und abnormen Hmatokritwerten sollten verworfen
werden. Hepatische, lipmische und hmolytische Proben sollten mit manuellen Verfahren getestet
werden, da einige photometrische Instrumente falsche Resultate liefern.
Die Verwendung von kommerziell erhltlichen Kontrollplasmen, die keine Angabe zu Citrat- und
Plttchenkonzentrationen machen, ist nicht zu empfehlen.
Bei Vergleichsprfungen sollten die Tests mit Screening-Reagenz LA 1 und Besttigungsreagenz
LA 2 jeweils zur gleichen Zeit durchgefhrt werden.
Es sollten mindestens 2 auf unterschiedlichen Testprinzipien basierende Screening-Tests durchgefhrt werden. Darber hinaus sollte ein Plasmatauschversuch zur Verifikation des Vorhandenseins
eines Gerinnungshemmers und ein Besttigungstest zur Dokumentation der Phospholipid-Abhn
gigkeit durchgefhrt werden10.
Heparin-Konzentrationen bis 1 Einheit/ml haben keine Auswirkungen, denn sowohl ScreeningReagenz LA 1 als auch Besttigungsreagenz LA 2 enthalten entsprechende Neutralisatoren.
Resultate dieses Tests sollten stets in Verbindung mit der Vorgeschichte des Patienten, dem kli
nischen Bild und anderen Untersuchungsergebnissen interpretiert werden.

Erwartete Werte

Mit Proben von 26 gesunden Personen im Alter zwischen 18 und 55 Jahren wurden bei Anwendung
einer manuellen Methode fr das Screening-Reagenz LA 1 ein Normalbereich von 31 - 44 Sekunden
und fr das Besttigungsreagenz LA 2 ein Normalbereich von 30 - 38 Sekunden gefunden. Die
Ratio von LA 1 : LA 2 bewegte sich im Bereich zwischen 0,8 und 1,2. Diese Ergebnisse bieten
lediglich einen Anhaltspunkt.

Screening LA 1
Ist das Verhltnis grer als 2,0, dann ist LA stark ausgeprgt.

Besttigung LA 2

Screening LA 1
Ist das Verhltnis zwischen 1,5 und 2,0, dann ist LA mig ausgeprgt.

Besttigung LA 2

Screening LA 1
Ist das Verhltnis zwischen 1,2 und 1,5, dann ist LA schwach ausgeprgt.

Besttigung LA 2
Jedes Labor sollte seinen eigenen Normalbereich sowohl fr manuelle als auch automatisierte
Testmethoden bestimmen, um Unterschiede bei Probennahme und Gerten auszugleichen.

Intra- und Interlaboratoriumsstudien zur Przision wurden sowohl mit manuellen (tilt tube) als auch
automatisierten Methoden durchgefhrt. Diese Prfungen ergaben Variationskoeffizienten von weniger als 3,5 % bei normalen Plasmen und weniger als 5 % bei abnormen Proben.
Untersuchungen zur Spezifitt wurden an bekannten Plasmaproben durchgefhrt.
Bei folgenden Plasmen* wurde zwischen Screening-Reagenz LA 1 und Besttigungsreagenz LA 2
eine positive Ratio von grer als 1,2 gefunden:
LA-Plasma
90 % (26/29)
heparinisiertes Plasma
12 % (1/8)
Plasma von OAT-Patienten
0 % (0/7)
Plasma mit Faktormangel
0 % (0/5)
Normalplasma
2 % (1/60)
* Bei diesen Plasmen wurde LA in APTT+KCT-Plasmatauschversuchen nachgewiesen.

Literatur

Siehe englische Packungsbeilage.

Ausgabe Oktober 2008

LA 1 Ractif de dpistage /
LA 2 Ractif de confirmation
LA 1 [REAGENT] /
LA 2 [REAGENT]
Test simplifi de mesure du Temps de Venin de Vipre Russell dilu (dRVVT, activateur de
venin de serpent), pour le dpistage des anticoagulants lupiques

Domaine dutilisation

Les ractifs LA 1 de dpistage et LA 2 de confirmation sont des ractifs dRVVT simplifis, qui
permettent la mise en vidence danticoagulants lupiques (LA) dans des tests de coagulation en
une tape.
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LA 2 Ractif de confirmation
Ractif dRVV riche en phospholipides, pour la correction spcifique des anticoagulants lupiques.

Intrt diagnostique

Les anticoagulants lupiques (LA) sont des auto-anticorps dirigs contre des phospholipides char
gs ngativement ou des complexes de phospholipides contenant soit de la beta-2-glycoprotine 1,
soit un facteur de la coagulation comme la prothrombine. Ils apparaissent dans diffrents ta
bleaux cliniques, et plus particulirement dans les maladies auto-immunes1. Par ailleurs, les LA
sont aujourdhui considrs comme un facteur de risque significatif chez les patients souffrant de
thromboses inexpliques, et sont frquemment mis en vidence chez les femmes ayant eu des
avortements rpts5. Les LA sont gnralement mis en vidence laide de tests de coagulation
sensibles aux phospholipides o ils agissent en tant quinhibiteur de la coagulation, comme le TCA
(Temps de Cphaline avec Activateur), le TCK (Temps de Cphaline Kaolin), ou le dRVVT2.
Le dRVVT a commenc tre utilis aprs la publication de Thiagarajan et al. en 19866. Cette
mthode a t standardise et simplifie7. Selon Petri8 et al., la probabilit, chez les patients throm
botiques souffrant dun Lupus rythmateux systmique, est plus leve de rvler des LA avec
le dRVVT que des anticorps anti-cardiolipine avec un test immunoenzymatique (ELISA)5. Cette
observation a rcemment t largie par Galli et Bevers9, qui ont montr que le sous-type des LA
ayant le plus deffet sur le dRVVT est beta-2-glycoprotine 1 dpendant, et diffrent du sous-type
LA prothrombine dpendant qui a un effet dallongement plus marqu sur le TCA.

Principe de la mthode

1. Le venin de vipre Russell contenu dans le Ractif de dpistage LA 1 dclenche la coagulation

du plasma par activation directe du Facteur X. Les anticorps anti-LA allongent le temps de
coagulation du Ractif de dpistage LA 1.
2. Le Ractif de confirmation LA 2 ressemble au Ractif de dpistage LA 1, mais sa concentration
en phospholipides est augmente. Ces phospholipides supplmentaires contrecarrent laction
des anticorps anti-LA et corrigent ainsi largement le temps de coagulation3.
3. Le dRVVT contourne le Facteur VII de la voie extrinsque de la coagulation ainsi que les fac
teurs de la phase contact et les facteurs anti-hmophiliques de la voie intrinsque. Aussi le
Ractif de dpistage LA 1 est-il plus adapt pour la mise en vidence spcifique des LA que
le TCA, car il nest influenc ni par des anomalies des facteurs de la phase contact, ni par un
dficit en Facteur VIII, ni par des anticorps6. Une srie de tests bass sur la correction par les
phospholipides4 ont t mis au point. Aucun ne sest cependant rvl aussi simple dutilisation
que le Ractif de dpistage LA 1, suivi du Ractif de confirmation LA 2.
4. Pour exclure un dficit en Facteur II, V ou X, qui pourrait allonger le rsultat obtenu avec le
Ractif de dpistage LA 1 et le Ractif de confirmation LA 2, il peut tre utile deffectuer un test
de mlange. Pour cela, mlanger le plasma test avec un plasma tmoin, de faon rintroduire
les facteurs manquants dans le plasma test. Si le mlange donne toujours un temps allong,
cela signifie que le plasma test contient un inhibiteur de la coagulation (par ex. des LA). Nor
malement, un temps de coagulation allong qui ne se corrige pas par le test de mlange prouve
la prsence dun inhibiteur circulant3, 10.

Ractifs
Composition
Le Ractif de dpistage LA 1 et le Ractif de confirmation LA 2 contiennent du venin de vipre
Russell, des phospholipides, des agents anti-hpariniques, du calcium, une solution tampon, des
stabilisateurs, de lazide de sodium, et des colorants.
Mises en garde et prcautions demploi
Les ractifs sont rservs un usage de diagnostic in-vitro.
En cas dvacuation dans lvier, rincer avec un grand volume deau pour viter tout mlange
explosif dans les canalisations mtalliques.
Prparation des ractifs
Reconstituer le contenu dun flacon avec le volume deau distille indiqu sur ltiquette. Bien m
langer en agitant avec prcaution afin dassurer une parfaite reconstitution du lyophilisat.
Stabilit et conditions de conservation
Les ractifs lyophiliss conservs +2/+8 C peuvent tre utiliss jusqu la date indique sur
ltiquette du flacon.
Une fois reconstitus, ils se conservent 8 heures +37 C, 24 heures +20/+25 C, 48 heures
+2/+8 C et un mois -20 C.
Signes dinstabilit et de dtrioration
Si, louverture du flacon, on observe une absence de vide, et/ou si le ractif ne parat pas lyophi
lis, le retourner Siemens Healthcare Diagnostics.

Prlvement et prparation des chantillons

Leistungsmerkmale des Tests

LA 1 Ractif de dpistage
Ractif dRVV simplifi pour le dpistage des anticoagulants lupiques.

Prlever et prparer les chantillons selon le NCCLS H21-A3 Prlvement, transport et prpara
tion des chantillons sanguins pour tests de coagulation, ainsi que selon la procdure gnrale
pour tests de coagulation, directive valide, 3me dition (1998). Conserver le plasma spar
+2/+8 C, et le tester dans les 4 heures qui suivent le prlvement.
Si les plasmas doivent tre congels avant leur utilisation dans le test, les centrifuger deux fois
pour liminer les plaquettes sanguines (le taux doit tre infrieur 10 x 109/l)10 car celles-ci peuvent
raccourcir le temps de coagulation du Ractif de dpistage LA 1.

Ralisation du test

1. Dans un flacon pour ractif pouvant contenir au moins 200 l par test, prchauffer +37 1 C
un peu plus que la quantit ncessaire de Ractif de dpistage LA 1 et/ou de Ractif de confir
mation LA 2.
2. Distribuer 200 l de plasma de patient dans un tube essai en verre, et laisser incuber 1 minute
+37 C.
3. Ajouter au plasma 200 l de Ractif de dpistage LA 1 ou de Ractif de confirmation LA 2
prchauff, et mesurer le temps coul depuis laddition du Ractif jusqu la fin de la raction
de coagulation.
4. Rpter la mesure pour un dosage en double, et calculer la moyenne des rsultats obtenus.
Mthode automatise
Les protocoles de test sur les automates Siemens sont disponibles sur demande.
Les tests utilisant le Ractif de dpistage LA 1 et le Ractif de confirmation LA 2 doivent, comme
la plupart des tests de mesure du temps de thrombine, tre effectus avec un volume gal de
plasma de patient et de ractif. Cependant, le temps de lecture ou dexploitation doit tre port
120 secondes.
Conditionnements
LA 1 [REAGENT], [REF] OQGP contenant
10 x l 2 ml LA 1 [REAGENT], LA 1 Ractif de dpistage
LA 2 [REAGENT], [REF] OQGR contenant
10 x l 1 ml LA 2 [REAGENT], LA 2 Ractif de confirmation
Matriel ncessaire
Tubes essai en verre de 10 mm x 75 mm
Pipette pour distribuer 200 l, 1 ml, 2 ml ou 5 ml
Bain-marie, chronomtre
Eau distille (USP ou de puret quivalente)
LA Contrle Elev ([REF] OQWD)
LA Contrle Bas ([REF] OQWE)

Contrle de qualit
Il est recommand chaque laboratoire de dterminer ses propres domaines de confiance pour les
contrles et son propre domaine normal.
Le LA Contrle Elev ([REF] OQWD) et le LA Contrle Bas ([REF] OQWE) sont proposs par Sie
mens pour le contrle de qualit du Ractif de dpistage LA 1 et du Ractif de confirmation LA 2.

Rsultats

Si le temps de coagulation de LA 1 est trouv lintrieur du domaine normal, il nest ventuel

lement pas ncessaire deffectuer un autre test de LA. Si le temps de coagulation de LA 1 est
suprieur 2 DS ou allong denviron 20 % par rapport la valeur moyenne dun plasma normal
(idalement n 20), le rsultat doit tre considr comme anormal, et des tests complmentaires
doivent tre effectus (cf. Schma 1).
Le mieux est dexprimer le rsultat final en ratio: temps de coagulation du Ractif de dpistage
LA 1/temps de coagulation du Ractif de confirmation LA 2.

Temps de coagulation du Ractif de dpistage LA 1
Ratio LA =
Temps de coagulation du Ractif de confirmation LA 2

Schma 1

Chaque laboratoire doit dterminer son propre domaine normal, aussi bien pour la mthode ma
nuelle que pour les mthodes avec automates, pour corriger les variations dues au prlvement
des chantillons et lautomate utilis.

Caractristiques du test

Des tudes de prcision intra et inter-laboratoires ont t effectues, en mthode manuelle (retour
nement du tube) et sur automates. Les coefficients de variation obtenus taient infrieurs 3,5 %
pour les plasmas normaux, et infrieurs 5 % pour les chantillons anormaux.
Des tudes de spcificit ont t effectues sur des chantillons plasmatiques connus.
Un ratio positif entre Ractif de dpistage LA 1 et Ractif de confirmation LA 2 suprieur 1,2a
t trouv sur les plasmas connus suivants :
Plasmas LA positifs
90 % (26/29)
Plasmas hparins
12 % (1/8)
Plasmas de patients sous AVK 0 % (0/7)
Plasmas avec facteur dficient 0 % (0/5)
Plasmas normaux
2 % (1/60)
* lidentification des LA sest faite par TCA + TCK sur plasma mlang

Littrature

Cf. texte anglais.

LA 1 Reagente di screening /
LA 2 Reagente di conferma
LA 1 [REAGENT] /
LA 2 [REAGENT]

Test de mlange
En cas de rsultat douteux, effectuer un test de mlange pour corriger lventuel faux rsultat ob
tenu et clarifier la prsence de LA. Pour cela, mlanger parts gales le plasma du malade avec un
plasma normal dit plasma tmoin, et tester le mlange selon la procdure normale du test (comme
plasma tmoin, ne pas utiliser le Siemens Plasma de contrle N).
Tableau 1: Combinaisons des tests de mlange et des tests de confirmation
LA 1

LA 2

Diagnostic

Plasma du
malade

Mlange
malade + tmoin

Plasma du
malade

Mlange
malade + tmoin

Pas de mise en
vidence de LA

ABN

ABN

Mise en vidence
de LA

ABN

ABN

Facteur dficient/
AVK

ABN

ABN

ABN

LA + facteur
dficient

ABN

ABN

ABN

ABN

Autre inhibiteur

Afin de corriger les variations de rsultats obtenus selon les ractifs et lappareil utiliss, il est
recommand de calculer un ratio normalis. Pour cela, utiliser les temps de coagulation moyens
obtenus dans le laboratoire avec le Ractif de dpistage LA 1 et le Ractif de confirmation LA 2
sur un plasma normal. Ceci peut faciliter la diffrenciation entre des chantillons normaux et des
chantillons faiblement positifs en LA.

Ratio normalis =

Temps du malade avec Ractif de dpistage LA 1

Temps moyen du tmoin avec Ractif de dpistage LA 1

X

Temps moyen du tmoin avec Ractif de confirmation LA 2

Temps du malade avec Ractif de de confirmation LA 2

Pour linterprtation du ratio normalis ont peut galement suivre le diagramme reprsent selon le schma
1.

Limites de ralisation du test

Ne pas utiliser dchantillons ayant dj coaguls ou avec un hmatocrite anormal. Les chan
tillons hpatiques, lipmiques ou hmolytiques doivent tre tests en mthode manuelle, car cer
tains appareils photomtriques fournissent des rsultats errons.
Il nest pas recommand dutiliser des plasmas de contrle du commerce dont les concentrations
en citrate et en plaquettes ne sont pas prcises.
Les tests effectus dans le cadre dtudes comparatives avec les Ractifs de dpistage LA 1 et de
confirmation LA 2 doivent tre effectus simultanment.
Effectuer au moins 2 tests de dpistage bass sur des principes de test diffrents. Par ailleurs,
effectuer un test de mlange pour vrifier la prsence dun inhibiteur de la coagulation, et un test
de confirmation pour vrifier la sensibilit aux phospholipides10.
Les concentrations dhparine jusqu 1 unit/ml nont pas dinfluence sur les tests, car aussi bien
le Ractif de dpistage LA 1 que le Ractif de confirmation LA 2 contiennent un neutralisateur
correspondant.
Les rsultats de ce test doivent toujours tre interprts en rapport avec les antcdents mdicaux
du patient, les signes cliniques et autres constatations.

Valeurs attendues

Les chantillons de 26 sujets sains gs de 18 55 ans tests en mthode manuelle ont donn un
domaine normal compris entre 31 et 44 secondes avec le Ractif de dpistage LA 1, et un domaine
normal compris entre 30 et 38 secondes avec le Ractif de confirmation LA 2. Le ratio LA 1/LA 2
stend sur un domaine compris entre 0,8 et 1,2. Ces valeurs ne sont donnes qu titre indicatif.

Dpistage LA1
Si le ratio est suprieur 2,0, la prsence de LA est fortement marque
Confirmation LA 2


Dpistage LA1
Si le ratio est compris entre 1,5 et 2,0, la prsence de LA est moyenne
Confirmation LA 2


Dpistage LA1
Si le ratio est compris entre 1,2 et 1,5, la prsence de LA est faible
Confirmation LA 2

OQGP G17 C0501 (799)

Edition Octobre 2008

Reagente semplificato per il tempo di Veleno di Vipera Russell Diluito (DRVVT) per
lidentificazione degli Anticoagulanti Lupus

Uso previsto

Il Reagente di screening LA 1 e il Reagente di conferma LA 2 sono reagenti DRVVT per lidentifi

cazione degli anticoagulanti lupici (LA) nei test di coagulazione ad una fase.
LA 1 Reagente di screening
Reagente DRVV semplificato per lo screening degli anticoagulanti lupici.
LA2 Reagente di Conferma
Reagente DRVV ricco di fosfolipidi per la correzione specifica degli anticoagulanti lupici.

Significato diagnostico

Gli anticoagulanti lupici (LA) sono degli autoanticorpi diretti contro i fosfolipidi con carica negativa o
i complessi di fosfolipidi con beta-2-glicoproteina 1 o fattori della coagulazione, quali la protrombina.
Essi si riscontrano in varie condizioni cliniche, specialmente nelle malattie autoimmuni1. Inoltre gli
LA sono da considerarsi come un fattore di rischio significativo nei pazienti con inspiegabili trombosi
e sono spesso presenti in donne con aborti ricorrenti5. Normalmente gli LA vengono individuati
attraverso test coagulativi sensibili ai fosfolipidi, come laPTT (Tempo di Tromboplastina Parziale at
tivato), tempo di coagulazione con caolino (KCT) e DRVVT2, dove hanno un effetto anticoagulante.
Il tempo di DRVV divenne popolare in seguito alla pubblicazione di Thiagarajan et al. nel 19866.
Questo metodo stato standardizzato e semplificato7. Secondo Petri8 et al., la trombosi nei pazienti
SLE maggiormente collegata agli LA identificabili con DRVVT che con gli anticorpi anti-cardioli
pina identificati da test immunoenzimatico (ELISA)5. Questa osservazione stata recentemente
spiegata da Gall e Bevers9, i quali hanno dimostrato che il sottotipo LA con maggiore effetto sui test
DRVVT dipendente dalla beta-2-glicoproteina, e diverso dal sottotipo LA richiedente protrombina,
che ha un effetto prolungato sui test KCT.

Principio del metodo

1. Il veleno di vipera Russell, presente nel Reagente di screening LA 1 attiva direttamente il fattore
X, provocando la coagulazione del plasma. Gli anticorpi LA allungano il tempo di coagulazione
del Reagente di screening LA 1.
2. Il Reagente di conferma LA 2 simile al Reagente di screening LA 1, ma contiene unalta
concentrazione di fosfolipidi. Questi fosfolipidi aggiuntivi agiscono conto gli anticorpi LA e cor
reggono ampiamente il tempo di coagulazione 3.
3. Il test DRVV aggira il fattore VII del sistema estrinseco della coagulazione cos come i fattori
antiemofilici e di contatto del sistema intrinseco. Pertanto, il Reagente di screening LA 1 molto
pi specifico per gli LA del test aPTT, poich non influenzato n da anomalie del fattore di
contatto, n da deficit del fattore VIII o anticorpi6. Sono stati sviluppati una serie di test sulla
base della correzione con fosfolipidi4, ma nessuno risultato cos appropriato come limpiego
del Reagente di conferma LA 2 dopo il Reagente di screening LA 1.
4. E possibile utilizzare un test di miscelazione del plasma per escludere un deficit di fattore II,
V e X che provocherebbero un allungamento dei risultati del Reagente di screening LA 1 e del
Reagente di conferma LA 2. Miscelando il plasma normale con il plasma in esame, si ripristinano
i fattori mancanti nel plasma in esame. Se il risultato del test di miscelazione risulta ancora
allungato, significa che un inibitore (come LA) presente nel plasma in esame. Un tempo
di coagulazione allungato, che non pu essere corretto miscelando il plasma di paziente con
plasma normale, indica la presenza di un inibitore circolante3,10.

Reagenti

Composizione
Il Reagente di screening LA 1 e il Reagente di conferma LA 2 contengono veleno di vipera Russell,
fosfolipidi, agenti anti-eparina, calcio, tamponi, stabilizzanti, sodio azide e colorante.
Avvertenze e precauzioni
Solo per uso diagnostico in-vitro.
Nelleliminare il reagente attraverso lo scarico, far scorrere molta acqua per prevenire la formazione
di residui esplosivi nelle tubature di metallo.
Preparazione del reagente
Ricostituire con la quantit dacqua distillata indicata sulletichetta. Mescolare bene mediante capo
volgimento per assicurare una completa risospensione del materiale liofilizzato.
Conservazione e stabilit
I reagenti liofilizzati, conservati a +2/+8 C, sono stabili fino alla data di scadenza indicata sulleti
chetta.
I reagenti ricostituiti possono essere conservati per 8 ore a +37 C, 24 ore a +20/+25 C, 48 ore a
+2/+8 C e 1 mese a -20 C.
Indice di instabilit / deterioramento
Se, aprendo il flacone, non si osserva presenza di vuoto e/o il reagente non appare secco, deve
essere restituito a Siemens Healthcare Diagnostics.

Raccolta e preparazione dei campioni

Il sangue deve essere prelevato e lavorato secondo lo standard NCCLS H21-A3: raccolta, trasporto
e lavorazione dei campioni di sangue per test coagulativi e esecuzione generale dei metodi coa
gulativi, linee guida approvate - 3a edizione (1998). Il plasma separato deve essere conservato a
+2/+8 C e analizzato entro 4 ore dal prelievo.
Se il campione va congelato, il plasma deve essere centrifugato una seconda volta per rimuovere
le piastrine (inferiori a 10 x 109/l)10, in quanto potrebbero accorciare il tempo di coagulazione del
Reagente di screening LA 1.

Esecuzione del test

1. Preriscaldare a +37 1 C poco pi della quantit necessaria di Reagente di screening LA 1 e/o

Reagente di conferma LA 2, calcolando 200 l per test
2. Dispensare 200 l del plasma in esame in una provetta di vetro e riscaldare per 1 minuto a +37 C.
3. Aggiungere 200 l del reagente di screening preriscaldato al plasma e cronometrare il tempo,
dal momento dellaggiunta del reagente fino alla conclusione della reazione di coagulazione.
4. Ripetere il test per una determinazione in doppio e riportare il valore medio dei risultati del
test.
Metodo automatico
Sono disponibili, su richiesta, i protocolli per gli analizzatori Siemens.
I test con il Reagente di screening LA 1 ed il Reagente di conferma LA 2 devono essere eseguiti con
la stessa quantit di plasma e reagente, come in molti protocolli per il tempo di trombina. Tuttavia,
i tempi di lettura e interpretazione dei dati devono essere portati a 120 secondi.
Materiali forniti
LA 1 [REAGENT], [REF] OQGP con
10 x l 2 mL LA 1 [REAGENT], LA 1 Reagente di screening

Campioni che contengono coaguli e quelli con valori di ematocrito anormali devono essere elimi
nati. I campioni itterici, lipemici e emolitici dovrebbero essere analizzati con tecniche manuali, in
quanto alcuni strumenti fotometrici danno falsi risultati.
Si raccomanda di non utilizzare i plasmi di controllo commercializzati senza indicazione della con
centrazione di citrato e piastrine.
Per gli studi comparativi, i test con il Reagente di screening LA 1 e il Reagente di conferma LA 2
dovrebbero essere eseguiti in simultanea.
Eseguire almeno 2 test di screening basati su principi analitici differenti. Eseguire, inoltre, una prova
di miscelazione del plasma per verificare la presenza di inibitore della coagulazione, e un test di
conferma per documentare la dipendenza dei fosfolipidi10.
Concentrazioni di eparina fino a 1 unit/ml non hanno alcun effetto, per la presenza di un agente
neutralizzante sia nel Reagente di screening LA 1 che nel Reagente di conferma LA 2.
I risultati di questo test devono essere sempre interpretati alla luce della anamnesi del paziente,
della presentazione clinica e valutando contestualmente lesito di altri accertamenti.

Valori attesi

Con campioni di 26 individui sani di et compresa tra 18 e 55 anni e utilizzando un metodo manua
le in provetta (tilt-tube), sono stati ottenuti intervalli normali di 31 - 44 secondi per il Reagente di
screening LA1 e di 30 - 38 secondi per il Reagente di conferma LA 2. La ratio LA1/LA2 oscillava
tra 0,8 e 1,2. Questi risultati devono intendersi solo come riferimento

Screening LA 1
Se la ratio maggiore di 2,0: forte presenza di LA
Conferma LA2


Screening LA 1
Se la ratio compresa tra 1,5 e 2,0: moderata presenza di LA
Conferma LA 2

LA 2 [REAGENT], [REF] OQGR con

10 x l 1 mL LA 2 [REAGENT], LA2 Reagente di Conferma

Screening LA 1
Se la ratio compresa tra 1,2 e 1,5: debole presenza di LA
Conferma LA 2

Ogni laboratorio dovrebbe stabile il proprio intervallo normale, sia per il metodo manuale che per
quello automatico, per poter bilanciare le differenze nel prelievo dei campioni e nella strumenta
zione.

Materiale necessario ma non fornito

Provette di vetro 10 mm x 75 mm
Pipette da 200 l, 1 ml, 2 ml o 5 ml
Bagnomaria, cronometro
Acqua depurata, USP o equivalente
LA Controllo Alto ([REF] OQWD)
LA Controllo Basso ([REF] OQWE)

Caratteristiche specifiche del test

Controllo qualit
Ogni laboratorio dovrebbe stabilire i propri valori di accettabilit dei controlli ed un proprio intervallo
normale.
LA Controllo Alto ([REF] OQWD) e LA Controllo Basso ([REF] OQWE) sono distribuiti da Siemens e
servono per il controllo qualit del Reagente di screening LA 1 e del Reagente di conferma LA 2.
Il plasma di controllo e i campioni dei pazienti devono essere analizzati simultaneamente.

Risultati

Se il tempo di coagulazione con LA 1 rientra nellintervallo normale, non necessario eseguire altri
test. Se il tempo di coagulazione con LA 1 superiore a 2 DS o ca. il 20 % pi lungo del valore
medio del plasma normale (n 20), il risultato deve essere considerato anomalo e sottoposto a
ulteriori indagini (vedere figura 1).
Il risultato finale pu essere espresso meglio come rapporto (ratio) tra il tempo di coagulazione del
Reagente di screening LA 1 e il tempo di coagulazione del Reagente di conferma LA 2.

Ratio LA

Limitazioni della esecuzione del test

Tempo di coagulazione Reagente di screening LA 1

=
Tempo di coagulazione Reagente di conferma LA 2

Studi di precisione intra- ed inter-laboratori sono stati realizzati tanto con il metodo manuale in
provetta (tilt-tube) quanto con il metodo automatico. Questi studi hanno dato un coefficiente di
variazione inferiore al 3,5 % su plasma normale e inferiore al 5 % per i campioni anormali.
Studi di specificit sono stati effettuati su campioni di plasma noti.
Per i seguenti plasmi* e stata riscontrata una ratio positiva maggiore di 1,2, tra il Reagente di
screening LA 1 e il Reagente di conferma LA 2:
Plasma LA
90 % (26/29)
Plasma eparinato
12 % (1/8)
Plasma di paziente TAO
0 % (0/7)
Plasma carente di fattore 0 % (0/5)
Plasma normale
2 % (1/60)
* Per questi plasmi gli LA sono stati identificati con APTT + prove di miscelazione KCT.

Bibliografia
Vedi testo Inglese.

Figura 1
Edizione Ottobre 2008

Reactivo de screening LA 1/
Reactivo de confirmacin LA 2
LA 1 [REAGENT] /
LA 2 [REAGENT]
Reactivo para el tiempo de veneno de vbora de Russell diluido, ("Dilute Russells Viper
Venom Time" reagent), simplificado, para la deteccin del anticoagulante lpico.

Campos de aplicacin

1
Test di miscelazione
Se i risultati si trovano ai limiti, possibile eseguire prove di miscelazione del plasma per corregge
re i difetti nascosti del campione e chiarire la presenza degli LA. In questo test, da eseguire come un
normale test standard, il rapporto tra campione di plasma e plasma normale dovrebbe essere 50:50
(non utilizzare il Plasma di controllo della Siemens per le prove di miscelazione del plasma).
Tabella 1: Combinazione di test di miscelazione e di conferma
LA 1

LA 2

Diagnosi

Plasma di
paziente

Miscela
paziente +
Normale

Plasma di
paziente

Miscela
paziente +
Normale

LA non identificati

ABN

ABN

LA identificati

ABN

ABN

Deficit fattore/TAO

ABN

ABN

ABN

LA + Deficit fattore

ABN

ABN

ABN

ABN

Altro inibitore

Il calcolo di una ratio normalizzata pu essere utile per correggere le differenze delle varie combinazio
ni reagenti/strumenti. Nella normalit, si usano i tempi di coagulazione medi del plasma normale ana
lizzato con il Reagente di screening LA 1 e Reagente di conferma LA 2 nel laboratorio dellutilizzatore.
Ci pu facilitare la differenziazione tra i campioni LA normali e quelli leggermente positivi.

Ratio normalizzata =

Reagente di screening LA 1 del paziente

Tempo normale medio Reagente di screening LA 1
X

Tempo normale medio Reagente di conferma LA 2

Reagente di conferma LA 2 del paziente

Il diagramma della figura 1 pu essere utilizzato anche per interpretare le ratio normalizzate.
OQGP G17 C0501 (799)

El reactivo de screening LA 1 y el reactivo de confirmacin LA 2 son reactivos simplificados, del

reactivo DRVVT para la deteccin del anticoagulante lpico (LA), en un test de coagulacin de
una etapa.
Reactivo de screening LA 1
Reactivo DRVV simplificado para el screening del anticoagulante lpico.
Reactivo de confirmacin LA 2
Reactivo DRVV rico en fosfolpidos para la correccin especfica del anticoagulante lpico.

Significado diagnstico

Los anticoagulantes lpicos (LA) son autoanticuerpos, los cuales estn dirigido contra fosfolpidos
cargados negativamente o contra los complejos de fosfolpidos, ya sea con beta-2-glicoprotena 1
o con factores de la coagulacin como la protrombina. Ellos aparecen en diferentes estadios cl
nicos, especialmente en enfermedades autoinmunes1. Adems, el LA es visto hoy como un factor
de riesgo significante para pacientes con diferentes trombosis inexplicables y se puede reconocer
frecuentemente en mujeres con abortos repetidos5. El LA se detecta normalmente por medio de
ensayos de coagulacin sensibles a los fosfolpidos, tales como, APTT (tiempo de tromboplastina
parcial activado), KCT (tiempo de coagulacin con caoln) y el DRVVT2, en los cuales acta como
inhibidor de la coagulacin.
El test DRVVT comenz a conocerse despus de la publicacin de Thiagarajan et al. en el ao
19866. Este mtodo ha sido estandarizado y simplicado7. Segn Petri et al8. en trombosis de pa
cientes con lupus eritematoso sistmico, es mucho mayor la posibilidad de detectar LA con DRVVT
que el anticuerpo anticardiolipina con un ensayo inmunoenzimtico (ELISA)5. Estas observaciones
fueron extendidas recientemente por Galli y Bevers9, quienes demostraron que el subtipo de LA
con ms efecto sobre el test DRVVT es el dependiente de la beta-2-glicoprotena 1 y se diferencia
del subtipo de LA dependiente de la protrombina, el cual tiene un fuerte efecto en la prolongacin
del test KCT.

Principio del mtodo

1. El veneno de vbora de Russell contenido en el reactivo de screening LA 1 desencadena la

coagulacin del plasma mediante la activacin directa del factor X. El anticuerpo LA prolonga
el tiempo de coagulacin del reactivo de screening LA 1.
2. El reactivo de confirmacin LA 2 es similar al reactivo de screening LA 1, pero contiene una
mayor concentracin de fosfolpidos. Estos fosfolpidos adicionales actan en contra de el an
ticuerpo LA y de esta manera corrigen casi completamente el tiempo de coagulacin3.

3. El test DRVVT evita (bypass) el factor VII del sistema extrnseco de la coagulacin y los factores
de contacto y antihemoflicos del sistema intrnseco. Por esta razn, el reactivo de screening LA 1
es ms apropiado para el reconocimiento especfico de LA, que el test del TTPA, ya que no va a
estar influenciado ni por anomalas de los factores de contacto ni por deficiencia en el factor VIII
o anticuerpos6. Se han desarrollado una gran serie de ensayos basados en la correccin de los
fosfolpidos4, sin embargo ninguno de ellos ha sido tan apropiado para usar como el reactivo de
confirmacin LA 2 a continuacin del reactivo de screening LA 1.
4. Para descartar una deficiencia en los factores II, V o X, la cual podra prolongar los resultados
del ensayo con el reactivo de screening LA 1 y el reactivo de confirmacin LA 2, puede ser de
utilidad realizar ensayos con mezclas de plasmas. Mediante la mezcla de un plasma normal
con un plasma test, se van a agregar al plasma test los factores faltantes. Si el test mezclado
todava produce tiempos prolongado, esto est indicando, que en el plasma test se encuentra
un inhibidor (como LA). Normalmente un tiempo de coagulacin prolongado, el cual tampoco
se pueda corregir mediante la mezcla de plasmas de pacientes con plasmas normales, indica
un inhibidor circular 3, 10.

Figura 1

Reactivos
Composicin
El reactivo de screening LA 1 y el reactivo de confirmacin LA 2 contienen veneno de vbora
de Russell, fosfolpidos, agentes anti-heparnicos, calcio, solucin tampn, estabilizadores, azida
sdica y colorantes.
Advertencias y medidas de seguridad:
Slo para ser utilizado en diagnsticos in-vitro.
Cuando se retira la azida sdica, se debe purgar la caera con suficiente cantidad de agua, para
evitar la posibilidad de formacin de materiales explosivos en la tubera metlica.
Preparacin de los reactivos
Disolver el contenido de los frascos en la cantidad de agua dest. indicada en las etiquetas. Mezclar
bien por inversin para asegurar la completa resuspensin del material liofilizado.
Estabilidad y almacenaje
Los reactivos liofilizados almacenados a una temperatura entre +2 y +8 C pueden ser usados, por
lo menos, hasta la fecha indicada en la etiqueta.
Despus de la reconstitucin los reactivos pueden ser almacenados 8 horas a +37 C, 24 horas
entre +20 y +25 C, 48 horas entre +2 y +8 C y 1 mes a -20 C.
Indicaciones de inestabilidad y deterioracin
Si al abrir el frasco no es evidente la existencia de vaco y/o el reactivo no parece seco, ste se
debe devolver a Siemens Healthcare Diagnostics.

Toma de las muestras y preparacin

La sangre se debe tomar y procesar de acuerdo con el NCCLS-Standard H 21 - A3: Toma, trans
porte y procesamiento de muestras de sangre para los test de coagulacin y la ejecucin general
de los ensayos de la coagulacin- Normas aprobadas - 3a Edicin (1998). El plasma separado debe
ser almacenado entre +2 y +8 C y usado para el test dentro de las 4 horas siguientes a la toma.
Si las muestras van a ser congeladas antes de usarlas, el plasma debe ser centrifugado 2 veces
antes de congelarse, para remover las plaquetas de sangre (por debajo de 10 x 109/l)10, ya que
estas pueden llega a acortar el tiempo de coagulacin del reactivo de screening LA1.

Procedimiento

1. Pre-calentar a 37 1 C, en un tubo de ensayo que pueda contener por lo menos 200 l por
test, un poco ms de la cantidad necesaria del reactivo de screening LA 1 y/o del reactivo de
confirmacin LA 2.
2. Agregar en un tubo de ensayo de vidrio 200 l de plasma de paciente e incubar 1 minuto a +37 C.
3. Aadir al plasma 200 l del reactivo de screening LA 1 o del reactivo de confirmacin LA 2,
pre-calentados, y medir el tiempo desde la adicin del reactivo hasta el final de la reaccin de
coagulacin.
4. Repetir por duplicado el test y reportar el promedio de estos como el resultado.
Mtodo automtico
Los protocolos para los analizadores Siemens estn disponibles a peticin.
Los test con el reactivo de screening LA 1 y con el reactivo de confirmacin LA 2, como en la
mayora de los protocolos para el tiempo de trombina, deben efectuarse usando el mismo volumen
de plasma test y de reactivo. Sin embargo, el tiempo de la toma de la medida o de valoracin debe
ser prolongado a 120 segundos.
Contenido del envase comercial:
LA 1 [REAGENT], [REF] OQGP con
10 x l 2 ml LA 1 [REAGENT], LA 1 Reagente di screening
LA 2 [REAGENT], [REF] OQGR con
10 x l 1 ml LA 2 [REAGENT], LA2 Reagente di Conferma
Materiales adicionales necesarios
Tubos de ensayo 10 mm x 75 mm,
Pipetas de 200 l, 1 ml, 2 ml o 5 ml.
Bao de agua, Cronmetro,
Agua destilada (USP o de pureza equivalente),
LA control alto ([REF] OQWD)
LA control bajo ([REF] OQWE)
Control de calidad
Cada laboratorio debe establecer sus propios rango de confianza para los controles y su propio
rango normal.
El LA control alto ([REF] OQWD) y el LA control bajo ([REF] OQWE) son suministrados por Sie
mens, para ser usados en el control de calidad del reactivo de screening LA 1 y del reactivo de
confirmacin LA 2. Las determinaciones de los plasmas de control y de las muestras de pacientes
deben efectuarse al mismo tiempo.

Resultados

Si el tiempo de coagulacin con LA 1 se encuentra en el rango normal, no es necesario realizar otro

test para LA. Si el tiempo de coagulacin con LA 1 est por encima de 2 SD o es aproximadamente
20 % ms largo que el valor promedio del plasma normal (de manera ideal n 20), el resultado se
debe considerar como anormal y se debe continuar investigando (ver Fig. 1).
El resultado se puede expresar mejor como la relacin (radio) entre el tiempo de coagulacin con
LA 1 y el tiempo de coagulacin con LA 2.

Radio LA =

Tiempo de coagulacin del reactivo de screening LA1

Tiempo de coagulacin del reactivo de confirmacin LA 2

1
Test de mezclas
Para corregir errores escondidos en la muestra y para aclarar la presencia de LA en muestras con
resultados limtrofe, se pueden realizar estudios de mezclas de plasmas. En estos test, los cuales
van a ser realizados como los test estndar, la relacin entre la muestra de plasma y el plasma
normal debe ser de 50:50 (para estos estudios de mezclas de plasmas no se debe utilizar el plasma
control N de Siemens)
Tabla 1: Combinacin del test de mezclas y de confirmacin
LA 1

LA 2

Diagnstico

Plasma de
paciente

Mezcla
Paciente + normal

Plasma de
paciente

Mezcla
Paciente + normal

LA no detectado

ABN

ABN

LA presente

ABN

ABN

Factor deficiente/OAT

ABN

ABN

ABN

LA + factor deficiente

ABN

ABN

ABN

ABN

Otro inhibidor

Para corregir las desviaciones en diferentes combinaciones de reactivos o de aparatos puede ser
de gran utilidad calcular un radio normalizado. Para la normalizacin se van a tomar los valores
promedios del tiempo de coagulacin de plasmas normales chequeados en el laboratorio del usua
rio con los reactivos de screening LA 1 y de confirmacin LA 2. Esto puede facilitar la diferenciacin
entre muestras normales y muestras con LA positivo bajo.

Radio normalizado =

Paciente reactivo de screening LA 1

Tiempo promedio normal reactivo de screening LA 1

x

Tiempo promedio normal reactivo de confirmacin LA 2

Paciente reactivo de confirmacin LA 2

Para la interpretacin de los radios normalizados se puede usar tambin el diagrama de flujos de la
Fig. 1

Limitaciones del Procedimiento

Muestras que ya se encuentran coaguladas y con valores de hematcrito anormales deben ser
descartadas. Muestras hepticas, lipmicas y hemliticas deben medirse por un mtodo manual,
ya que algunos instrumentos fotomtricos producen resultados falsos.
No se recomienda el uso de plasmas de control comerciales disponibles, que no presenten datos
sobre la concentracin de citrato y de plaquetas.
Para estudios comparativos, los test con el reactivo de screening LA 1 y con el de confirmacin LA 2
deben ser efectuados al mismo tiempo.
Se deben realizar por lo menos 2 test de screening basados en principios diferentes. Adems, se
debe realizar un test de mezclas para verificar la existencia de un inhibidor de la coagulacin y un
test de confirmacin para documentar la dependencia de fosfolpidos10.
Concentraciones de heparina hasta de 1 unidad/ml no tiene ninguna influencia, ya que tanto el
reactivo de screening LA 1 como el de confirmacin LA 2 contienen los correspondientes neu
tralizadores.
Los resultados de esta prueba debern interpretarse siempre de acuerdo con la historia clnica del
paciente, la sintomatologia clnica y otras observaciones.

Valores esperados

Con muestras de 26 personas sanas, en edades entre 18 y 55 aos y utilizando un mtodo manual
se encontr un rango normal para el reactivo de screening LA 1 de 31 - 44 segundos y para el
reactivo de confirmacin LA 2 de 30 - 38 segundos. El radio LA 1/LA 2 se encontr en un rango
entre 0,8 y 1,2. Estos resultados deben ser tomados solamente como una gua.

Screening LA1
Si el radio es ms grande que 2,0, la presencia del LA es fuerte
Confirmacin LA2


Screening LA1
Si el radio est entre 1,5 y 2,0, la presencia del LA es moderada
Confirmacin LA2


Screening LA1
Si el radio est entre 1,2 y 1,5, la presencia del LA es dbil
Confirmacin LA2

Cada laboratorio debe determinar su propio rango normal, tanto para el test manual como para
los test automticos, con el fin de compensar las diferencias por la toma de muestra y por los
aparatos.

Caractersticas del test

Estudios de precisin inter e intra laboratorios fueron realizados tanto manualmente (tubo tilt),
como con mtodos automticos. Estos estudios dieron coeficientes de variacin menores al 3,5 %
para plasmas normales y menores del 5 % para plasmas anormales.
Los estudios de especificidad fueron realizados con muestras de plasmas conocidos.
Para los siguientes plasmas conocidos* se encontr entre el reactivo de screening LA 1 y el de
confirmacin LA 2 un radio positivo mayor de 1,2:
Plasma LA
90 % (26/29)
Plasma heparinizado
12 % (1/8)
Plasma de pacientes OAT
0 % (0/7)
Plasma con factor deficiente
0 % (0/5)
Plasma normal
2 % (1/60)
* Para estos plasmas la identificacin del LA se hizo con estudios mixtos APTT + KCT

Literatura

Ver boletn informativo en Ingls

OQGP G17 C0501 (799)

4. Repetir o teste para determinaes duplas e formar o valor mdio dos resultados do teste.

Edicin Octubre 2008

Reagente de rastreio LA 1 /
Reagente de confirmao LA 2
LA 1 [REAGENT] /
LA 2 [REAGENT]
Reagente simplificado Dilute Russells Viper Venom Time (DRVVT, activador de veneno
de vbora) para deteco do anticoagulante lpico

Campo de aplicao

Mtodo automatizado
A pedido, so disponibilizadas os protocolos de teste para os analisadores da Siemens.
Tal como para a maioria dos protocolos para o tempo de trombina, os testes com o reagente de
rastreio LA 1 e o reagente de confirmao LA 2 devero ser executados utilizando os mesmos
volumes de plasma de teste e reagente. Contudo, o tempo de registo e de interpretao do valor
medido dever ser ampliado em aprox. 120 segundos.
Contedo da embalagem comercial
LA 1 [REAGENT], [REF] OQGP com
10 x l 2 ml LA 1 [REAGENT], Reagente de rastreio LA 1
LA 2 [REAGENT], [REF] OQGR com
10 x l 1 ml LA 2 [REAGENT], Reagente de confirmao LA 2
Outros materiais necessrios
Tubos de ensaio com 10 mm x 75 mm,
Pipeta para 200 l, 1 ml, 2 ml ou 5 ml
Banho-maria, crongrafo
gua destilada (pureza USP ou similar)
Controlo LA elevado ([REF] OQWD)
Controlo LA baixo ([REF] OQWE)

Reagente de confirmao LA 2
Reagente DRVV rico em fosfolpidos para a correco especfica do anticoagulante lpico.

Controlo de qualidade
Cada laboratrio dever determinar os intervalos de confiana prprios dos seus controlos e um
intervalo normal.
O controlo LA elevado ([REF] OQWD) e o controlo LA baixo ([REF] OQWE) so fornecidos pela
Siemens para o controlo de qualidade do reagente de rastreio LA 1 e do reagente de confirmao LA 2.
As determinaes dos plasmas de controlo e das amostras do paciente tm de ser executadas
em simultneo.

Significado diagnstico

Resultados

O reagente de rastreio LA 1 e o reagente de confirmao LA 2 so reagentes DRVVT simplificados

para deteco do anticoagulante lpico (LA) em testes de coagulao de um s estgio.
Reagente de rastreio LA 1
Reagente simplificado DRVV para o rastreio de anticoagulante lpico.

O anticoagulante lpico (LA) constitudo por autoanticorpos contra os fosfolpidos carregados nega
tivamente ou complexos de fosfolpidos com beta-2-glicoprotena 1 ou factores de coagulao como a
protrombina. Ocorre em vrias situaes clnicas, especialmente nas doenas autoimunes1. Alm dis
so, o LA considerado actualmente um factor de risco significativo para os pacientes com trombo
ses de etiologia desconhecida e detectado, frequentemente, em mulheres com aborto recorrente5.
O LA detectado, habitualmente, com testes de coagulao sensveis aos fosfolpidos, como o
APTT (tempo de tromboplastina parcial activado), o KCT (kaolin clotting time), e o DRVVT2, onde
possui um efeito inibidor da coagulao.
O tempo DRVV tornou-se popular aps a publicao de Thiagarajan et al. no ano de 19866. Este
mtodo foi simplificado e padronizado7. Segundo Petri8 et al., nos pacientes com trombose com lpus
eritematoso sistmico a probabilidade de detectar LA com DRVVT maior com um ensaio imuno
enzimtico (ELISA)5 para os anticorpos anticardiolipina. Esta observao foi alargada recentemente
por Galli e Bevers9 que mostraram que o subtipo de LA com o maior efeito sobre os testes DRVVT
precisa da beta-2-glicoprotena 1 e se distingue do subtipo LA dependente da protrombina, que possui
um efeito mais prolongado sobre os testes KCT.

Se o tempo de coagulao LA 1 se situar no intervalo normal, eventualmente no sero neces

srios mais testes de LA. Se o tempo de coagulao de LA 1 for superior a 2 SD ou aprox. 20 %
mais prolongado que o valor mdio do plasma normal (idealmente n 20), o resultado dever ser
considerado como anormal e a anlise dever continuar (veja a figura 1).
A melhor forma de exprimir o resultado final a relao (ratio) entre o tempo de coagulao do
reagente de rastreio LA 1 e o reagente de confirmao LA 2.

tempo de coagulao do reagente de rastreio LA 1
Ratio LA =
tempo de coagulao do reagente de confirmao LA 2

Figura 1

Princpio metodolgico

1. O veneno da vbora de Russel presente no reagente de rastreio LA 1 provoca a coagulao

do plasma atravs da activao directa do factor X. Os anticorpos LA prolongam o tempo de
coagulao do reagente de rastreio LA 1.
2. O reagente de confirmao LA 2 semelhante ao reagente de rastreio LA 1, mas contm uma
concentrao de fosfolpidos superior. Estes fosfolpidos adicionais reagem contra o anticorpo
LA corrigindo, assim, largamente, o tempo de coagulao3.
3. O teste DRVVT ilude o factor VII do sistema extrnseco da coagulao do sangue e os factores
de contacto e antihemoflicos do sistema intrnseco. Por isso, o reagente de rastreio LA 1 mais
adequado para a deteco especfica de LA do que os testes APTT, uma vez que no afec
tado pelas anomalias do factor de contacto, nem pela deficincia de factor VII ou anticorpos6.
Foi desenvolvida uma srie de testes com base na correco de fosfolpidos4, mas nenhum se
mostrou, de longe, to adequado como a utilizao do reagente de confirmao LA 2, a seguir
ao reagente de rastreio LA 1.
4. Para excluir a deficincia de factores II, V e X que prolongaria o resultado do teste com o
reagente de rastreio LA 1 e o reagente de confirmao LA 2, tambm podem ser teis testes
de reposio de plasma. Misturando o plasma normal com o plasma de teste, os factores em
falta so novamente aportados. Se o teste de reposio de plasma continuar a originar tempos
de teste prolongados, isso indica a presena de um inibidor (como o LA) no plasma de teste.
Normalmente, um tempo de coagulao prolongado que tambm no foi corrigido misturando
o plasma do paciente com o plasma normal, indicia um inibidor circulante3, 10.

Reagentes
Composio
O reagente de rastreio LA 1 e o reagente de confirmao LA 2 contm o veneno da vbora de
Russell, fosfolpidos, agentes antiheparnicos, clcio, soluo tamponada, estabilizadores, azida
de sdio e corantes.
Advertncias e medidas de precauo
S para uso diagnstico in-vitro.
Em caso de eliminao no esgoto, lavar com gua abundante para evitar a formao de substn
cias explosivas nos canos de esgoto metlicos.

Teste de reposio de plasma

Para corrigir os resultados incorrectos da amostra e clarificar a presena de LA, nos casos em
que os resultados so duvidosos, podem ser executados testes de reposio de plasma. Nestes
testes, que devero ser executados como o teste standard normal, a relao entre a amostra de
plasma e o plasma normal dever ser de 50:50 ( para os testes de reposio de plasma no deve
ser utilizado o plasma de controlo N da Siemens).
Tabela 1: Combinao dos testes de reposio de plasma com os testes de confirmao
LA 1

LA 2

Diagnstico

Preparao dos reagentes

Dissolver o contedo do frasquinho com a quantidade de gua destilada indicada no rtulo. Mis
turar o contedo agitando cuidadosamente, para garantir a ressuspenso integral do material
liofilizado.

Plasma
do paciente

Mistura
patiente + normal

Plasma
do paciente

Mistura
patiente + normal

Estabilidade e condies de conservao

Se os reagentes liofilizados forem conservados entre + 2 e + 8 C, so estveis, no mnimo, at
data impressa no rtulo do frasco.
Aps reconstituio, os reagentes podem ser conservados durante 8 horas temperatura de + 37 C,
24 horas entre + 20 e + 25 C, 48 horas entre + 2 e + 8 C e um ms a -20 C.

Sem deteco
de LA

ABN

ABN

Deteco de LA

ABN

ABN

Deficincia de
factor/OAT

ABN

ABN

ABN

LA + deficincia de
factor

ABN

ABN

ABN

ABN

Outro inibidor

Indcios de instabilidade e caducidade

Se, ao abrir o frasquinho, no se constatarem sinais claros de vcuo e/ou se o reagente no tiver
o aspecto de seco, dever ser devolvido Siemens Healthcare Diagnostics.

Colheita e preparao da amostra

O sangue dever ser colhido e processado em conformidade com a norma H21-A3 NCCLS sobre
a colheita, o transporte e o processamento de amostras de sangue para testes de coagulao e a
directiva geral aprovada para a realizao de ensaios de coagulao - 3 edio (1998). O plasma
separado dever ser conservado entre + 2 e + 8 C e utilizado no teste num perodo de tempo de
4 horas aps a colheita.
Se as amostras tiverem de ser congeladas antes da realizao do teste, antes de ser congelado,
o plasma tem de ser centrifugado duas vezes, para remover as plaquetas sanguneas (inferiores
a 10 x 109/l)10, j que estas, caso contrrio, podem encurtar o tempo de coagulao do reagente
de rastreio LA 1.

Procedimento

1. Aquecer, previamente, num tubo de ensaio com uma capacidade mnima de 200 l por teste,
um pouco mais do que a quantidade necessria de reagente de rastreio LA 1 e/ou reagente de
confirmao LA 2, temperatura de +37 C 1 C .
2. Introduzir 200 l de plasma do paciente num tubo de ensaio de vidro e incubar durante 1 minuto
a +37 C.
3. Adicionar ao plasma os 200 l de reagente de rastreio LA 1 ou reagente de confirmao LA 2
pr-aquecidos e medir o tempo desde a adio do reagente, at concluso da reaco de
coagulao.
OQGP G17 C0501 (799)
7

Para compensar os desvios das diferentes combinaes de reagentes ou aparelhos, pode ser til
calcular um ratio normalizado. Para a normalizao so usados os tempos mdios de coagulao
do plasma normal testado no laboratrio do utilizador com o reagente de rastreio LA 1 e o rea
gente de confirmao LA 2. Isso pode facilitar a diferenciao entre as amostras LA normais e as
amostras fraco-positivas.

Ratio normalizado =

reagente de rastreio LA 1 paciente

tempo mdio normal do reagente de rastreio LA 1

x

tempo mdio normal do reagente de confirmao LA 2

reagente de confirmao LA 2 do paciente

Para a interpretao dos ratios, tambm pode ser usado o fluxograma na figura 1.

Limites de execuo do teste

As amostras com cogulos j existentes e valores de hematcritos anormais devem ser rejeitadas.
As amostras hepticas, lipmicas e hemolticas devem ser testadas com mtodos manuais, j que
alguns instrumentos fotomtricos fornecem resultados errados.

A utilizao de plasmas de controlo adquirveis no comrcio, sem indicao da concentrao de

citrato e de plaquetas, no aconselhvel.
Em caso de anlises comparativas, os testes com o reagente de rastreio LA 1 e o reagente de
confirmao LA 2 devem ser executados ao mesmo tempo.
Devero ser realizados, no mnimo, 2 testes de rastreio, baseados em 2 princpios de teste dife
rentes. Alm disso, dever ser executado um teste de reposio de plasma para a verificao da
existncia de um inibidor de coagulao e um teste de confirmao para documentar a depen
dncia fosfolpida10.
As concentraes de heparina at 1 unidade/ml no tm quaisquer efeitos, j que tanto o reagente
de rastreio LA 1, como o reagente de confirmao LA 2 contm neutralizadores adequados.
Os resultados deste teste devem sempre ser interpretados em conjunto com o histrico mdico do
doente, estado clnico e outros dados de interesse.

Valores expectveis

Com amostras de 26 pessoas saudveis com a idade entre 18 e 55 anos, obteve-se um intervalo
normal de 31 - 44 segundos para o reagente de rastreio LA 1 e um intervalo normal de 30 - 48
segundos para o reagente de confirmao LA 2, utilizando um mtodo manual. O ratio LA 1 : LA
2 andou no intervalo entre 0,8 e 1,2. Estes resultados constituem apenas um ponto de referncia.

rastreio LA 1
Se a relao for superior a 2,0, a presena de LA forte
confirmao LA 2


rastreio LA 1
Se a relao se situar entre 1,5 e 2,0, a presena de LA moderada
confirmao LA 2


rastreio LA 1
Se a relao se situar entre 1,2 e 1,5, a presena de LA fraca
confirmao LA 2

Cada laboratrio dever determinar o seu intervalo normal prprio para os mtodos de teste auto
mticos e manuais, para compensar as diferenas da colheita de amostras e dos aparelhos.

Caractersticas de performance do teste

Estudos de preciso intra e inter-laboratoriais foram executados com o mtodo manual (tilt tube) e
com o mtodo automatizado. Estas anlises forneceram coeficientes de variao inferiores a 3,5 %
nos plasmas normais e inferiores a 5 % nas amostras anormais.
Os estudos de especificidade foram executados com amostras de plasma conhecido.
Nos plasmas* seguintes, entre o reagente de rastreio LA 1 e o reagente de confirmao LA 2
obteve-se um ratio positivo superior a 1,2:
Plasma LA
90 % (26/29)
Plasma heparinizado
12 % (1/8)
Plasma de pacientes OAT
0 % (0/7)
Plasma com deficincia de factor 0 % (0/5)
Plasma normal
2 % (1/60)
* Nestes plasmas, o LA foi detectado com os testes de reposio de plasma APTT+KCT.

Bibliografia

Veja o prospecto da embalagem em ingls.

Edio Outubro 2008

2008 Siemens Healthcare Diagnostics Products GmbH.

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