DISCOS PARA ANTIFUNGIGRAMA

CARTUCHO DE 50 DISCOS
ESTUDIO DE LA SENSIBILIDAD DE LAS LEVADURAS DEL GNERO CANDIDA A LOS
ANTIFNGICOS DE LA FAMILIA DE LOS AZOLES (FLUCONAZOL, VORICONAZOL)

IVD
1- INTERS CLNICO
Estos discos permiten determinar la sensibilidad de las levaduras del gnero Candida a los agentes antifngicos de la familia de
los azoles (fluconazol, voriconazol), mediante difusin en agar. Este mtodo sigue un procedimiento normalizado publicado por el
CLSI/NCCLS (1)
Debern consultarse los documentos ms recientes del CLSI/NCCLS para ver cules son las recomendaciones respecto a la
realizacin del antifungigrama y cmo debe interpretarse.

2- PRINCIPIO
Se colocan unos discos de papel impregnados con una concentracin determinada de antifngico en la superficie el medio
MHGBM (Mueller-Hinton + 2% de glucosa + 0,5 g/ml de azul de metileno) previamente sembrado con un inculo calibrado,
preparado a partir de un cultivo puro de la levadura sobre la que se desea hacer la prueba. Se establece un grado de
concentracin de antifngico alrededor de los discos dentro del agar. Despus de la incubacin, el dimetro de las zonas de
inhibicin observadas alrededor de los discos permite deducir las concentraciones mnimas inhibidoras (CMI) de los diferentes
antifngicos (fluconazol, voriconazol) para la cepa sobre la que se ha hecho la prueba, as como su categorizacin clnica:
resistente (R), sensible dosis-dependiente (SDD), sensible (S).

3- PRESENTACIN
Los discos, fabricados a partir de papel absorbente de calidad superior, tienen 6,5 mm de dimetro y estn impregnados de antifngicos
con concentraciones precisas.
Estos discos estn identificados de forma clara por un smbolo compuesto de 3 letras, seguido de la carga expresada en g, impreso a
ambos lados del disco (tabla 1).
Los discos Bio-Rad se presentan en cartucho de 50 discos envasados en recipientes estancos que contienen un deshidratante.

Tabla 1
DISCO

CARGA DEL DISCO

SMBOLO

ENVASE

CDIGO DEL PRODUCTO

Fluconazole

25 g

FCA25

1 x 50 discos

62802

Voriconazole

1 g

VCZ1

1 x 50 discos

62803

4- CONSERVACIN
La fecha de caducidad es vlida nicamente para los discos que se guarden en cartuchos intactos conservados conforme a las
instrucciones del fabricante. La fecha de caducidad y el nmero de lote figuran en cada envase (cartucho y recipiente).
Los cartuchos de discos deben conservarse en su recipiente entre +2 y +8C en un lugar seco.
Antes de abrir los cartuchos, deje que alcancen una temperatura ambiente (18-30C) y vuelva a poner los cartuchos que no se
hayan usado a una temperatura entre +2 y +8C una vez terminada la colocacin de los discos.
No utilizar los discos caducados.
Si los cartuchos se conservan en el distribuidor despus del almacenamiento, es necesario que ste se conserve a una
temperatura entre +2 y +8C en un lugar seco y con desecantes en su interior.
La estabilidad de los discos una vez abiertos los cartuchos y colocados en los distribuidores se ha validado en condiciones de
rutina durante 6 semanas.

5- MATERIAL NECESARIO NO INCLUIDO

distribuidor de discos: 6 discos (cdigo 50271), 8 discos (cdigo 50270), 12-16 discos (cdigo 50295)
medio de cultivo MHGBM (Mueller Hinton + 2% de glucosa + 0,5 g/ml de azul de metileno)
medio de cultivo: agar Sabouraud (cdigo 56519), agar Sabouraud cloranfenicol-gentamicina (cdigo 63774)
asa de siembra
pipetas Pasteur
escala de turbidez 0,5 McFarland
cepas fngicas para el control de la calidad
estufa 35C +/- 2C
material de laboratorio necesario para la realizacin de los antifungigramas mediante difusin en agar

6- PRECAUCIONES DE USO
Seguir las instrucciones de uso de las recomendaciones en vigor (CLSI/NCCLS)
Seguir en todo momento las tcnicas y precauciones en vigor en materia de proteccin contra riesgos microbiolgicos.
Despus de su uso, esterilizar los cultivos y todo el material contaminado.

7- MODO OPERATORIO
a) Medio de cultivo
El documento M44-A del CLSI/NCCLS recomienda la utilizacin del medio MHGBM: Mueller Hinton con 2% de glucosa y 0,5 g/ml de
azul de metileno.
Despus de haber preparado este medio de cultivo descrito en el documento, verter 25 ml del mismo en una placa de Petri redonda de 90
mm de dimetro, o 60 ml en una placa de Petri cuadrada de 120 mm.
Una vez solidificado, secar 15 minutos a 37C antes de su utilizacin.

b) Inculo
Preparar un inculo equivalente al estndar 0,5 de McFarland a partir de un cultivo puro de 24 horas de levadura del gnero Candida,
obtenido sobre un medio de aislamiento (agar Sabouraud con glucosa, Sabouraud cloranfenicol-gentamicina...).
El inculo se prepara mediante la suspensin en suero fisiolgico estril del equivalente a 5 colonias bien aisladas de 1 mm de dimetro.
Una vez homogeneizada la suspensin en el vrtice, ajustar la turbidez a 0,5 McFarland, ya sea aadiendo suero fisiolgico o aadiendo
colonias adicionales.

c) Siembra
En los 15 minutos posteriores al ajuste del inculo a 0,5 McFarland, sumergir un hisopo de algodn en la suspensin y remover varias
veces. Eliminar el exceso de lquido presionando fuertemente el hisopo contra la pared del tubo por encima del nivel del lquido.
Una vez secado el medio 15 minutos a 37C, sembrar toda la superficie con ayuda del hisopo segn el mtodo estndar.
Repetir la operacin varias veces girando la placa 60, de modo que el inculo quede repartido de forma homognea por toda la
superficie, incluidos los bordes.
Dejar la placa abierta entre 3 y 5 minutos (sin sobrepasar los 15 minutos) de manera que se absorba el exceso de humedad antes de
colocar los discos sobre el medio.

d) Aplicacin de los discos de antifngicos

Los discos se aplican sobre el agar con ayuda de un distribuidor de discos (6 discos como mximo sobre una placa redonda de 90 mm de
dimetro, 9 discos como mximo sobre una placa cuadrada de 120 mm de lado).

e) Incubacin
Incubar a 35C (+/-2C) en los 15 minutos posteriores a la aplicacin de los discos.
La duracin de la incubacin es de 24 horas.

Fig.1

f) Lectura e interpretacin
Medir los dimetros de las zonas de inhibicin transcurridas 24 horas de incubacin.
Colocar la placa sobre fondo negro no reflejante y realizar la lectura bajo una lmpara.
Si el cultivo es insuficiente despus de 24 horas de incubacin, volver a incubar la placa
otras 24 horas y realizar la lectura a las 48 horas.
Los dimetros de las zonas de inhibicin deben medirse hasta las colonias de tamao normal
(fig. 1),
ya que es posible observar en los bordes de las zonas de inhibicin una inhibicin parcial
del cultivo con presencia de colonias de tamao pequeo o mediano.
Estas colonias no corresponden a mutaciones resistentes y no deben tenerse en cuenta para
la medicin de los dimetros de las zonas de inhibicin.

g) Observaciones
Muestras: los discos no deben utilizarse para realizar una prueba directamente sobre muestras biolgicas
Se recomienda aplicar las buenas prcticas de laboratorio.

8- INTERPRETACIN DE LOS RESULTADOS

Medir con precisin los dimetros de las zonas de inhibicin
La correspondencia entre dimetro, concentracin mnima inhibidora (CMI) y clasificacin clnica: resistente (R), sensible dosisdependiente (SDD), sensible (S) se resume en la tabla siguiente :
Dimetro de la zona de inhibicin en mm*
Cdigo

Disco

Carga

Concentracin crtica CMI en g/ml*

Smbolo
R

S-DD

S-DD

62802

Fluconazole

25 g

FCA 25

14

1518

19

64

1632

62803

Voriconazole

1 g

VCZ 1

13

1416

17

*Fluconazol: documento CLSI/NCCLS M44-A(1)

Voriconazol: Artemis Disk Global Antifungal Surveillance Study (3)

9- RENDIMIENTOS / CONTROL DE CALIDAD DE LA PRUEBA

La tabla siguiente recoge los lmites aceptables de dimetros de inhibicin obtenidos mediante difusin en agar para las cepas de
referencia citadas anteriormente(1):
Cdigo

Disco

Carga

Smbolo

C. albicans
ATCC 90028

C. parapsilosis
ATCC 22019

C. tropicalis
ATCC 750

C. krusei
ATCC 6258

62802

Fluconazole

25 g

FCA 25

2839

2233

2637

62803

Voriconazole

1 g

VCZ 1

3142

2837

1625

10-CONTROL DE CALIDAD DEL FABRICANTE

Todos los productos fabricados y comercializados por Bio-Rad estn sujetos a un sistema de garanta de la calidad desde la recepcin de
las materias primas hasta la comercializacin de los productos finales. Cada lote de producto terminado se somete a un control de calidad
y no se comercializa a menos que cumpla con los criterios de aceptacin. El fabricante conserva la documentacin relativa a la produccin
y al control de cada lote.

11-LMITES DE USO
Los rendimientos de la prueba no dependen slo de la actividad de los discos, sino tambin de factores como la utilizacin de un inculo
estandarizado, de cepas de control adecuadas, de medios de cultivo adaptados a los que se hayan realizado pruebas previas y de una
temperatura adecuada de almacenamiento de los discos.

12-REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS
1. Method for Antifungal Disk Diffusion Susceptibility Testing of Yeasts ; Approved Guideline, M44-A, Vol. 24 N15, NCCLS, May 2004.
2. Reference Method for Broth Dilution Antifungal Susceptibility Testing of Yeasts ; Approved Standard-Second Edition, M27-A2, Vol. 22
N.15, NCCLS, August 2002.
3. M.A. Pfaller, D.J. Diekema, M.G. Rinaldi, R. Barnes, B. Hu, A.V. Veselov, N. Tiraboshi, E. Nagy, D.L. Gibbs, and the Global Antifungal
Surveillance Group. 2005. Results from the ARTEMIS DISK Global Antifungal Surveillance Study : a 6.5- Year Analysis of Susceptibilities
of Candida and Other Yeast Species to Fluconazole and Voriconazole by Standardized Disk Diffusion Testing. J. Clin. Microbiol. 43 :
p. 5848-5859.
4. M.A. Pfaller, D.J. Diekema, J.H. Rex, A. Espinel-Ingroff, E.M. Johnson, D. Andes, V. Chaturvedi, M.A Ghannoum, F.C. Odds, M.G. Rinaldi,
D.J. Sheehan, P. Troke, T.J. Walsh, and D.W. Warnock. 2006. Correlation of MIC with Outcome for Candida Species Tested against
Voriconazole ; Analysis and Proposal for Interpretive Breakpoints. J.Clin. Microbiol. 44 : p. 819-826.

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06/2006