Clonage

bactérien
 Plan
Introduction
Définitions
Outils
Technique
Exemples d’utilisation
Conclusion
Introduction
 Introduction

Le clonage désigne principalement deux processus:

la multiplication naturelle ou C'est aussi la multiplication
artificielle à l'identique d'un provoquée d'un fragment
être vivant c'est-à-dire avec d'ADN par l'intermédiaire d'un
conservation exacte du même micro-organisme.
génome pour tous les
descendants (les clones).
C'est donc un synonyme de
certaines formes de
multiplication asexuée telles
que le bouturage.
 Définitions
LE clonage c’est :
• Une technique de biologie moléculaire qui consiste à isoler un fragment
d'ADN et à le multiplier à l'identique en l'« insérant » dans une molécule
d'ADN « porteuse » appelée vecteur permettant son amplification.

• Cette technique de biologie moléculaire peut-être utilisée pour un clonage

partiel, ne portant que sur un fragment de matériel génétique (ADN), mais aussi
pour le clonage d'un gène entier permettant la production de la protéine
recombinante correspondante.

• L'« insertion » est souvent réalisée à l'aide d'un vecteur, le plus communément

utilisé étant une molécule d'ADN appelée plasmide .
Outils

Enzymes

Vecteurs

Cellules
 Outils
Enzymes:
o Couper de l ’ADN
• DNase
• Nucléase S1
o Ligaturer de l ’ADN
• Ligase phage T4
o Eliminer ou ajouter de groupement phosphate
• Phosphatase
• Polynucléotide kinase
o Copier de l ’ADN en ADN
• ADN polymérase Fragment de klenow
o Copier de l ’ARN en ADN
• Transcriptase inverse
o Copier de l ’ADN en ARN
• ARN polymérase spécifiques
 Outils
Vecteurs:
PLASMIDES PHAGES

BAC COSMIDES

PAC YAC
 Structure et rôle des PLASMIDES

 Structure d ’un plasmide

– Elément génétique dans le cytoplasme de la bactérie
– ADN double brin circulaire - linéaire possible
– Taille 1 à 1000 kb
– En moyenne 0,2 à 4% de la taille du chromosome
– Forme super-enroulée dans la cellule

Observation par microscopie électronique

 Structure et rôle des PLASMIDES

 Des milliers de plasmides différents

dans la nature
– Isolement de 300 plasmides
naturels chez E. coli
 Rôle des plasmides
– Transfert de matériel génétique
– Construction de diploïdes
partiels
– Véhicule de clonage
Plasmide
Chromosome
 Caractéristiques des PLASMIDES

 Résistance
• Antibiotiques
• Métaux lourds (Cadmium, Cobalt, Mercure, Nickel,
Zinc)

 Virulence
 Production de bactériocines
 Besoin de plasmides
• Facilement manipulables
• Non self transmissibles
• Nombre de résistance limité
 Caractéristiques des PLASMIDES

 Propriétés pour être un bon vecteur de clonage

 Origine de réplication indépendante de celle du chromosome
 Petite taille
 ADN circulaire
 Nombre de copies élevé
Réplication relâchée (relaxed)
Réplication stricte (stringent)
 Présence de marqueurs sélectionnables
Gènes de résistance aux antibiotiques
 Présence de sites uniques de coupure par des enzymes de restriction
 Transfert contrôlable vers l ’hôte
Modification pour empêcher le transfert naturel
Transfert par transformation choc thermique ou par électroporation
Quelques exemples des PLASMIDES
Quelques exemples des PLASMIDES
 Outils
Cellules

Toute bactérie capable d’accepter

notre vecteur de clonage et de le
multiplier tout en permettant de
l’identifier facilement sans gêner
notre marqueur sur le quel on va se
baser pour sélectionner les bactéries
transformées.
 Techniques

Extraction et purification de l’ADN

génomique
 Techniques

Après extraction et purification il faut

isoler le gène :
 Techniques

Préparation du vecteur de clonage

 Techniques
Transformation des Bactéries:
 Techniques

Ligation:

Insert
ADN
Plasmidique
Plasmide
recombinant

Plasmide non
recombinant
 Techniques
Transformation des Bactéries:

Cette étape se fait selon 2 processus:

Choc électrique ou électro-poration
Choc thermique

électroporateur
 Techniques
Criblage:

Il y as deux types de
criblage :
Un criblage négatif
Un criblage positif
 Techniques

Criblage:

Un criblage négatif
Techniques
 Techniques
Criblage:
Un criblage positif
Techniques
 Techniques

Criblage:

Un criblage positif
 Techniques

Criblage:

Un criblage positif
 Exemple d’utilisation
Méthanisation:
 Les bactéries méthanogènes, responsables de la
méthanisation.

 Elles se nourrissent de molécules organiques présentes

dans leur environnement et transforment le gaz carbonique
et l’hydrogène contenus dans ces molécules en méthane et
en oxygène.

 C’est donc grâce aux bactéries productrices

du biogaz que nous sommes là aujourd’hui, puisque c’est à
elles que nous devons l’apparition de l’oxygène sur Terre.
 Exemple d’utilisation
Les avantages de la méthanisation:

 En dehors de la production du biogaz, la méthanisation

des déchets organiques va améliorer les caractéristiques
des effluents résidus.
 La valorisation du biogaz en carburant permet de réduire
l’émission de méthane dans l’atmosphère, phénomène
particulièrement important au niveau des élevages.

 le biogaz est avant tout une énergie renouvelable qui

peut sensiblement diminuer les besoins en énergies
fossiles.
 Exemple d’utilisation

Méthanisation:
 Exemple d’utilisation
Les enzymes qui viennent du froid:
Ces protéines qui catalysent les réactions biochimiques
à la base du fonctionnement de toute cellule vivante,
sont largement employées par l'industrie dans des
applications aussi diverses que :

 la préparation d'aliments,
 la formulation de lessives ou la détection de polluants
par des biosenseurs.
 La plupart des organismes dont sont originaires les
enzymes actuellement utilisées vivent dans des
environnements compris entre 30 et 40°C et leur
efficacité est très sensible à la température
 Exemple d’utilisation
Les enzymes qui viennent du froid:
Quelques unes des activités enzymatiques étudiées dans le cadre
de Coldzyme et leurs domaines possibles d'application
ALPHA- boulangerie, textile, brasserie, détergents
AMYLASE
CELLULASE nettoyage des pierres, biopolissage
BÉTA-
GALACTOSID élimination du lactose du lait
ASE
LIPASES additifs de détergents, aromes
PROTÉASES additifs de détergents, attendrissement des viandes
XYLANASES boulangerie
Conclusion
 MERCI
POUR VOTRE ATTENTION