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DISEÑO Y SELECCIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO PARA EL CRECIMIENTO DE CEPAS

AZOTOBACTER spp. OBTENIDAS DE RIZOFERA DE STEVIA Y MAIZ.

PRINCIPIOS DE QUIMICA SUSTENTABLE:

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OBJETIVOS.

- Elaboración de tres medios de cultivo para el crecimiento de Azotobacter a

diferentes concentraciones.

- Selección del medio adecuado para el crecimiento de Azotobacter spp.

FUNDAMENTO TEÓRICO

Selección del medio de cultivo

En el caso de Azotobacter, existen una variedad de medio de cultivo químicamente

definido como el agar Ashby; sin embargo, el medio de cultivo que se utilice en la
fermentación no solo debe cumplir con las necesidades nutritivas del microorganismos en
cuestión, sino también con las exigencias del proceso de producción (costo y eficiencia)
del mismo.
El caldo Ashby es un medio de cultivo selectivo para Azotobacter debido a que no
contiene nitrógeno. Su ventaja es que al ser un medio selectivo el crecimiento es lento, es
observable a partir de los 3 – 5 días de realizada la siembra lo que implica un mayor gasto
de energía para la producción.

Factores de crecimiento

 OXIGENO

El oxígeno es el sustrato gaseoso más importante para el metabolismo microbiano y el

anhídrido carbónico es el producto metabólico más importante. El oxígeno no es un gas
muy soluble ya que una solución saturada de oxígeno contiene aproximadamente 9 mg / L
de este gas en agua.
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Debido a la influencia de los ingredientes del cultivo, el contenido máximo de oxígeno

realmente es más bajo de lo que debería ser en agua pura. El suministro se logra
pulverizando aire en el fermentador durante el proceso.

 TEMPERATURA

Los microorganismos que crecen a una temperatura inferior a la óptima tienen retardado
su crecimiento y por lo tanto reducida la producción celular, es decir su productividad. Por
otro lado, si la temperatura es demasiado alta, pero no letal, se puede inducir una
respuesta de estrés al choque térmico con la consiguiente producción de proteasas
celulares que ocasionan una disminución en el rendimiento de los productos proteicos.

 pH

La mayor parte de los microorganismos crecen óptimamente entre pH 5,5 y 8,5. Pero
durante el crecimiento en un fermentador, los metabolitos celulares son liberados al
medio, lo que puede originar un cambio del pH del medio de cultivo. Por lo tanto se debe
controlar el pH del medio de cultivo y añadir un ácido o una base cuando se necesite para
mantener constante el pH. Por supuesto que esta adición del ácido o base debe ser
mezclada rápidamente de tal manera que el pH del medio de cultivo sea el mismo en todo
el fermentador. (1)

MATERIALES Y METODOS

Materias primas: Rizosfera de plantaciones de Stevia, Maiz

Reactivos de laboratorio:
Medio para azotobacter (g/100ml)
Sacarosa 2g; fosfato dipotásico 0.005 g; fosfato monopotásico 0.015g; cloruro de calcio
0,001g, sulfato de magnesio heptahidrato 0,02 g, molibdato de sodio 0,0002 g, cloruro
férrico 0,001 g, azul de bromotimol (al 0,5% p/v en etanol) 0,2 mL, carbonato de calcio 0,1
g, agar agar 1,5g, agua 100 ml.

Agar Ashby 1 (500ml):

Sacarosa 5g ;Manitol 0.75g; fosfato dipotasico 0.01g; sulfato de magnesio heptahidratado
0.01g; cloruro de sodio 0.01g; sulfato de calcio dihidratado 0.005g; carbonato de calcio
0.25g; agar agar 0.8g; Benzoato de sodio 0.5g.

Agar Ashby 2 (g/100ml):

Sacarosa 0.5g; manitol 0.5g; fosfato dipotasico 0.1g; sulfato de magnesio 0.02g; sulfato de
hierro II heptahidratado 0.0005g; cloruro de sodio 0.02g; cloruro de calcio dihidratado
0.02g; agar agar 1.5g; agua 100ml.
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Material de laboratorio: Placas petri, Matraz, Probeta, Mechero, Parafilm, Papel aluminio,
beaker, espátula, pipeta, bagueta, pizeta.

Instrumentos y equipos: Cocina, Incubadora, Balanza analítica, Estufa, Autoclave,

Potenciometro.

Métodos

Medio para azotobacter (g/100ml) (3)

Esterilizar los materiales de vidrio en la estufa a 150°C durante 20 minutos. En un matraz
colocar primero todos los sólidos y luego los líquidos. Sacarosa 2g; fosfato dipotásico
0.005g; fosfato monopotásico 0.015g; cloruro de calcio 0.001g, sulfato de magnesio
heptahidrato 0.02g, molibdato de sodio 0.0002 g, cloruro férrico 0.001g, carbonato de
calcio 0.1 g, azul de bromotimol (al 0,5% p/v en etanol) 0.2 ml. Agregar al matraz 100ml de
agua previamente calentada. Mezclar vigorosamente hasta enfriar ligeramente y medir el
pH hasta pH 6.8 con potenciómetro calibrado. Finalmente añadir 1.5g de agar agar y
calentar hasta que este se disuelva, llevar a la autoclave a 121C, a 1.5 bar durante 15
minutos, pasado este tiempo colocar en 2 placas petri. Esperar a que gelifique.

Agar Ashby 1 (500ml): (2)

Manitol 0.75g; fosfato dipotasico 0.01g; sulfato de magnesio heptahidratado 0.01g;
cloruro de sodio 0.01g; sulfato de calcio dihidratado 0.005g; carbonato de calcio 0.25g;
agar agar 0.8g; Benzoato de sodio 0.5g.

Esterilizar los materiales de vidrio en la estufa a 150°C durante 20 minutos. En un matraz

colocar los sólidos e ir mezclando y agregando el agua esteril 500ml Mezclar
vigorosamente hasta enfriar ligeramente y medir el pH hasta alcanzar un pH neutro.
Finalmente añadir 7.5g de agar-agar y calentar hasta que este se disuelva, llevar a la
autoclave a 121ºC, a 1.5 bar durante 15 minutos, pasado este tiempo colocar en 2 placas
petri. Esperar a que gelifique

Agar Ashby 2 (g/100ml): (2)

Esterilizar los materiales de vidrio en la estufa a 150°C durante 20 minutos. En un matraz
colocar primero todos los sólidos y luego los líquidos. Sacarosa 0.5g; manitol 0.5g; fosfato
dipotasico 0.1g; sulfato de magnesio 0.02g; sulfato de hierro II heptahidratado 0.0005g;
cloruro de sodio 0.02g; cloruro de calcio dihidratado 0.02g. Agregar al matraz 100ml de
agua previamente calentada. Mezclar vigorosamente hasta enfriar ligeramente y medir el
pH hasta alcanzar un pH de neutro. Finalmente añadir 1.5g de agar-agar y calentar hasta
que este se disuelva, llevar a la autoclave a 121C, a 1.5 bar durante 15 minutos, pasado
este tiempo colocar en 2 placas petri. Esperar a que gelifique. (1)
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REFERENCIAS:

(2)Javier Jiménez Avella –caracterizacion molécular de cepas nativas colombianas de azotobacter

spp. Mediante el análisis de restricción del ADN ribosomal 16s
http://www.unsa.edu.ar/matbib/micragri/micagriapendice.pdf [28/08/2010]

(1)Andrade Ma. José, Correa Carina, Cueva Patricia, Jácome Rafael, Simba Saskia, Tufiño Carolina.”
Producción de un Biofertilizante a partir de cepas Azotobacter spp. Aisladas de plantaciones de
Stevia Rebaudiana”. U. C DEL ECUADOR FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS (2009)
http://www.scribd.com/doc/24636741/Produccion-de-un-Biofertilizante-a-partir-de-cepas-
Azotobacter-spp-Aisladas-de-plantaciones-de-Stevia-Rebaudiana2 [28/08/10]

(3) Leonor Carrillo. 2003